全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2015 年
收稿日期：2015－01－14
基金项目：国家自然科学基金项目（31160134）
作者简介：寇小霞（1991－），女，重庆人，在读本科生，（电话）18290822382（电子信箱）1639877304＠qq．com；通信作者，吾买尔夏提·塔汉（1968－），
男（维吾尔族），副教授，硕士生导师，主要从事植物分类、系统与进化方面的研究，（电话）15099187086（电子信箱）omirshat＠sina．com。
第 54 卷第 17 期
2015年 9 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 54 No.17
Sep.，2015
大赖草［Leymus racemosus （Lam．） Tzvel］又名
巨大滨草、巨野麦，禾本科多年生根茎型草本。 主要
分布在新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠沿额尔
齐斯河两岸的沙丘上及俄罗斯东南部的一些沙漠
中［1，2］。大赖草的耐风蚀、耐高温、耐严寒、耐沙埋、抗
旱等较强的沙生适应特性及其强烈的克隆生长能
力和密集的地上、地下构件等特征使其成为一种优
良的固沙植物，对于增加荒漠地表的粗糙度、防风
固沙等方面有重要的生态价值 ［3］，是保护干旱荒漠
化土地的重要生物屏障。 然而，由于受自然和人类
活动的长期作用，大赖草种群已严重退化成为濒危
物种，迫切需要恢复与重建。 因大赖草穗大、多花、
茎秆强壮，具有抗干旱、寒冷、盐碱和多种病虫害等
特点，国内外不少学者在小麦育种及转基因工作中
大赖草基因组 DNA提取方法比较分析
寇小霞 1a，代培红 1a，罗淑萍 1a，李玮璐 1a，吾买夏提·塔汗 1b，曲云壮 2
（1． 新疆农业大学， a．农学院； b．草业科学与环境学院， 乌鲁木齐 830052；
2．山东省蓬莱市南王街道办事处农业综合服务站，山东 蓬莱 265600）
摘要：为了研究不同提取方法对大赖草［Leymus racemosus （Lam．） Tzvel］基因组 DNA 提取质量的影响，
以大赖草的嫩叶为材料，采用 CTAB 法、CTAB 改良法、SDS 法、SDS－CTAB 法 4 种提取方法提取大赖草叶
片基因组 DNA，对提取的基因组 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计法检测，获得最佳大赖草
DNA 提取方法，并利用 ISSR 标记验证其质量。 结果表明，改良的 CTAB 法提取的大赖草基因组 DNA 纯
度较高、完整性较好，ISSR 扩增条带清晰，多态性高。 最终确定 CTAB 改良法为最佳提取方法，完全适合
于进一步的分子生物学研究。
关键词：大赖草［Leymus racemosus （Lam．） Tzvel］； 基因组 DNA；提取方法 ；CTAB 法 ；CTAB 改良法 ；
SDS 法；SDS－CTAB 法
中图分类号：Q78；S543＋．9 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）17－4324-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.057
Comparison of Different Extraction Methods of Genomic DNA
in Leymus racemosus（Lam．）Tzvel
KOU Xiao－xia1a，DAI Pei－hong1a，LUO Shu－ping1a，LI Wei－lu1a，OMIRSHAT Tahan1b，QU Yun－zhuang2
（1a． College of Agronomy；1b． College of Pratacultural and Environmental Sciences， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China；
2． Nanwang Streets Office Comprehensive Agricultural Service Station of Shandong Province Penglai City， Penglai 265600， Shandong， China）
Abstract： In order to research the effects of different extraction methods on the quality of genomic DNA in Leymus racemo-
sus （Lam．） Tzvel and select the optimum method， taking leaves as materials， genomic DNA was extracted by four methods
of CTAB，modified CTAB， SDS， and SDS－CTAB， and the quality was tested and verified by agarose gel electrophoresis and
ISSR analysis． The results showed that the DNA extracted by the modified CTAB method had a high quality and purity， and
was not degraded； in addition，the bands amplified by ISSR－PCR were clear and possessed high polymorphism． In conclusion，
the modified CTAB method has the best extraction effect， and could be used for the subsequent molecular biology research．
Key words： Leymus racemosus（Lam．） Tzvel；genomic DNA；CTAB method；modified CTAB method；SDS method；SDS－CTAB
method
第 17 期
对大赖草的优良种质进行了大量的应用［3－7］，并将大
赖草列为改良成多年生谷物或饲料候选物种。 刘宇
等 ［8］进行了多次野外调查，发现种子的初始萌发时
间长，萌发速率低，虽然穗大、花多，异花受粉且具
有自交不亲和性［9］，可以产生种子，但其结实率并不
高，种子产量仅为开花数量的 25％左右，且自然生
境中干旱少雨、水分缺少，导致种子萌发后易“闪
苗”。 这些因素导致大赖草有性繁殖更新率低 ［10］。
目前对大赖草进行分子生物学研究的报道较少，
特别是大赖草 DNA 提取相关的研究。基因组 DNA
的提取质量直接影响到后期的分子生物学试验结
果，为使所得的 DNA 纯度高，断裂降解程度小、量
足，在提取时应根据不同研究需要，保证其结构的
相对完整性， 尽量排除其他大分子成分如蛋白质、
多糖等的污染 ［11］。 目前植物基因组 DNA 提取常用
的方法有 CTAB 法、SDS 法、SDS－CTAB 法、 高盐低
pH 法等［12－15］。 针对研究目的和试验材料的不同，提
取植物基因组 DNA 的方法侧重点也不同， 各有其
优缺点。 而获取高质量的 DNA是进行限制性酶切、
PCR 扩增、分子杂交、遗传多样性分析以及基因组
学等分子生物学研究的基础。 因此，本研究拟通过
不同的 DNA 提取方法比较， 旨在获得提取质量较
高的大赖草总 DNA 方法， 以期为后续的分子生物
学研究奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料大赖草于 2013 年 5 月采自新疆阿尔
泰地区，用硅胶干燥，带回实验室备用。
DNA 抽提缓冲液 ： ① CTAB 抽提缓冲液 。
100 mmol ／ L Tris－HCl（pH 8．0）、20 mmol ／ L EDTA
（pH 8．0）、350 mmol ／ L NaCl、2％ CTAB 抽提缓冲液、
2％ β－巯基乙醇。 ②CTAB 改良法抽提缓冲液。 溶
液Ⅰ：100 mmol ／ L Tris－HCl（pH 8．0）、2 mmol ／ L ED-
TA（PH 8．0）、14 mmol ／ L NaCl、0．35 mmol ／ L 葡糖糖、
PVP40； 溶液Ⅱ：100 mmol ／ L Tris－HCl （pH 8．0）、20
mmol ／ L EDTA （pH 8．0）、1．4 mmol ／ L NaCl、2％
CTAB、2％ PVP40、0．1％ VC。 ③SDS 抽提缓冲液 。
100 mmol ／ L Tris －HCl （pH 8．0）、50 mmol ／ L EDTA
（PH 8．0）、500 mmol ／L NaCl、3％ SDS、2％ β－巯基乙醇。
④SDS－CTAB抽提缓冲液：100 mmol ／ L Tris－HCl（pH
8．0）、50 mmol ／ L EDTA （pH 8．0）、500 mmol ／ L NaCl、
20％ SDS、40％ PVP40。
试验所使用的试剂均为国产分析纯。 Taq DNA
聚合酶、Mg2＋、dNTP 等均购自北京鼎国昌盛生物技
术有限公司；ISSR 引物选用哥伦比亚大学公布的
UBC815，由上海生工生物技术有限公司合成。
1．2 方法
1．2．1 DNA 提取方法
1）CTAB 法。 称取 0．02 g 干燥的大赖草叶子置
于液氮中速冻， 用研钵磨成细粉。 装入 1．5 mL 的
Eppendorf 管， 迅速加入 700 μL 65 ℃预热的 CTAB
抽提缓冲液，轻轻混匀，于 65 ℃条件下保温 10 min，
4 ℃、12 000 r ／ min 离心 10 min。 吸取上清液移入到
新的 1．5 mL Eppendorf 管中， 加入等体积的三氯甲
烷 ／异戊醇（体积比为 24∶1）混合溶液混匀 2 min，
4 ℃、12 000 r ／ min 离心 10 min。 重复上一步骤。 之
后，吸取上清液移入到新管中，加入 2 倍体积预冷
的无水乙醇，混匀，于－ 20 ℃条件下静置 10 min，4℃、
10 000 r ／ min 离心 10 min，弃上清。 用 70％乙醇洗涤
沉淀 1 次，待自然风干后，加入 20 μL ddH2O 溶解
DNA，－20 ℃贮存备用。
2）CTAB 改良法。 称取 0．02 g 干燥的大赖草叶
子置于液氮中速冻，用研钵磨成细粉。 装入 1．5 mL
Eppendorf 管， 迅速加入 700 μL 溶液Ⅰ，2％β－巯基
乙醇，剧烈振荡，4 ℃、12 000 r ／ min离心 10 min。弃上
清液， 迅速加入 700 μL 溶液Ⅱ及 2％β－巯基乙醇，
轻轻混匀，65 ℃水浴 50 min， 期间摇动，4 ℃，12 000
r ／ min 离心 5 min。 吸取上清液移入到新的 1．5 mL
Eppendorf管中，加入等体积的三氯甲烷 ／异戊醇（体
积比为 24∶1）混合溶液和 200 μL 3 mol/L NaAc 溶
液，混匀 2 min，4 ℃、12 000 r ／ min 离心 5 min。 重复
上一步骤。 吸取上清液移入到新管中， 加入 2 倍
体积预冷的无水乙醇， 混匀， 于－20 ℃条件下静置
20 min，4 ℃、10 000 r ／ min 离心 15 min，弃上清。 用
500 μL 75％乙醇漂洗沉淀， 短暂离心， 待自然风干
后，加入 20 μL ddH2O溶解 DNA，－20 ℃贮存备用。
3）SDS法。 称取 0．02 g 干燥的大赖草叶子置于
液氮中速冻， 用研钵磨成细粉。 加入 650 μL 预热
65 ℃的 SDS 抽提缓冲液混匀，65 ℃保温 40 min，其
间缓慢颠倒 4 次， 取出， 于－20 ℃条件下静置 10
min，4 ℃、10 000 r ／ min 离心 10 min。 吸取上清液移
入到新的 1．5 mL Eppendorf 管中， 加入等体积三氯
甲烷 ／异戊醇（体积比为 24∶1）混合溶液缓慢颠倒混
匀 2 min，4 ℃、10 000 r ／ min 离心 10 min。 重复上述
步骤 1 次。 吸取上清液， 加入 2 倍体积无水乙醇，
于－20 ℃条件下静置 20 min，4 ℃、12 000 r ／ min 离心
10 min，弃上清液。 沉淀用 70％乙醇洗涤 2 次，待自
然风干后，沉淀加 ddH2O溶解，－20 ℃贮存备用。
4）SDS－CTAB 法。 称取 0．02 g 干燥的大赖草叶
子置于液氮中速冻，用研钵磨成细粉。 加入 600 μL
预热 65 ℃的 SDS－CTAB 抽提缓冲液，临时加 80 μL
寇小霞等：大赖草基因组 DNA 提取方法比较分析 4325
湖 北 农 业 科 学 2015 年
20％ SDS 以及 150 μL 40％ PVP 混匀，65 ℃保温 60
min，其间缓慢颠倒 4 次，然后于－20 ℃条件下静置
10 min，4 ℃、12 000 r ／ min离心 10 min。吸取上清液，
加入等体积三氯甲烷 ／异戊醇（体积比为 24∶1）混合
溶液抽提， 缓慢颠倒混匀至乳状，4 ℃、12 000 r ／ min
离心 10 min。重复上述步骤 1次。加入 2倍体积无水
乙醇，于－20 ℃条件下静置 20 min，4 ℃、12 000 r ／ min
离心 10 min，弃上清液。 沉淀用 70％乙醇洗涤 2次，
待自然风干后，加 ddH2O溶解，－20 ℃贮存备用。
1．2．2 DNA 的紫外分光光度法及琼脂糖凝胶电泳
检测 用紫外分光光度计测定 230、260、280 nm 的
吸光度， 根据 OD260 nm/OD280 nm、OD260 nm/OD230 nm的比值
判断纯度。 吸取 4 μL DNA，加 1 μL上样缓冲液，在
1．0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压 80 V，电泳时间
20 min，电泳结果经溴化乙锭染色液染色后，在凝
胶成像系统中观察拍照，检测其完整性。
1．2．3 ISSR－PCR 扩增产物检测 以所选取最佳的
方法提取的 DNA为模板进行 ISSR－PCR检测。 PCR
反应体系为 25 μL， 其中 10×PCR Buffer 2．5 μL，10
mmol ／ L dNTPs 混合液 0．5 μL，10 mmol ／ L 引物 0．5
μL，2．5 U Taq DNA 聚合酶 0．5 μL，30 ng ／μL DNA
1 μL， ddH2O 20 μL。 扩增程序：94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 30 s，53 ℃退火 45 s，72 ℃延长 45 s，
35 个循环；72 ℃延伸 7 min；4 ℃保存。 用ISSR引物
UBC815 检验不同 DNA 模板的 PCR 效果，产物在
1．0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在EB 染色
液中染色，凝胶成像系统中观察。
2 结果与分析
2．1 大赖草 DNA样品的纯度鉴定
使用紫外分光光度计分别测定 260、280、230
nm波长下 4种方法所提 DNA样品的吸光度， 每个
方法获取的样品测 3次值，平均结果见表 1。 从表 1
可以看出， 用 CTAB改良法提取的 DNA纯度较高、
污染度低，为下一步进行大批量提取大赖草基因组
DNA奠定一定的基础。
2．2 大赖草 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳结果
图 1 为 4 种方法提取的大赖草 DNA 的琼脂糖
凝胶检测结果。 由图 1可以看出，CTAB改良法提取
的 DNA 亮度均匀一致、条带清晰、整齐、几乎无拖
尾现象， 质量较好；SDS 法与 CTAB 法提取的 DNA
出现降解现象且降解严重；而 SDS－CTAB 法提取的
DNA 条带不明显。 相比较而言，改良的 CTAB 法的
提取效果最好，说明该方法对于大赖草中的多糖和
次生代谢产物去除效果相对其他 3 种方法的效果
较好，所提取 DNA的完整性较好。 对 CTAB 改良法
提取 DNA 的效果进行进一步验证， 结果如图 2 所
示。 由图 2 可知，CTAB 改良法所提取的 24 份大赖
草 DNA 条带整齐、完整、无降解，表明其质量较高，
完全可以满足后续试验需要。
2．3 大赖草 DNA样品的 ISSR扩增反应检测结果
以 CTAB改良法提取的总 DNA为模板，用引物
UBC815进行 ISSR－PCR扩增，进一步验证 CTAB 改
良法所提取 DNA的可靠性，结果如图 3所示。 由图
3 可知，CTAB 改良法提取的总 DNA 的扩增效果图
谱清晰、多态性高。
3 小结与讨论
植物 DNA 的提取方法较多， 基本上是比较成
熟的，但对不同的植物来说，由于其各自的生物化
学成分和结构不同， 在具体操作中存在较大的差
异。 多酚、多糖、蛋白质等物质的含量是 DNA 提取
质量的关键影响因素。 一般来说，CTAB缓冲液比较
适用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物
表 1 不同方法提取大赖草基因组 DNA 的纯度比较
方法
CTAB 改良法
CTAB 法
SDS 法
SDS-CTAB 法
A260 nm/A280 nm
1.84
1.95
1.98
1.65
A260 nm/A230 nm
2.05
1.90
1.85
1.23
M．DL10 000 DNA Marker；1－2．CTAB 改良法；4－5．CTAB 法；7－
8．SDS 法；10－11．SDS－CTAB 法
图 1 不同方法提取大赖草总 DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
图 2 CTAB 改良法提取的大赖草 DNA 的琼脂糖
凝胶电泳验证结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
图 3 CTAB 改良法获得 DNA 模板的 ISSR－PCR 电泳结果
2 000 bp
1 600 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14
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第 17 期
DNA提取［15，16］。
本研究根据试验材料大赖草所具有的特性，选
用了 4 种常见的方法提取了基因组 DNA，在试验过
程中为了提高 DNA 的质量，首先，提取前在抽提缓
冲液中加入了 EDTA、PVP40 等能络合多种酚类物
质的试剂，可以防止 DNA 发生褐变；其次，加入了
β－巯基乙醇以降解蛋白质并抑制多种酶的氧化活
性；再次，考虑到细胞裂解的充分性，在水浴的过程
中，将水浴时间延长到了 50 min；此外，利用三氯甲
烷 ／异戊醇（体积比为 24∶1）混合溶液抽提时，可根
据大赖草叶子的老与嫩选择抽提的次数，老叶子适
当增加抽提次数。 如果琼脂糖凝胶电泳图谱的点样
孔有残留杂质， 说明该 DNA 样品中含有较多的未
被去除的蛋白质、 多糖及一些其他次生代谢产物，
由于这些物质具有黏连特性， 常与 DNA 结合成复
合物， 使得 DNA 分子无法离开点样孔或电泳速度
较慢。 试验利用 ISSR－PCR 检测 CTAB 改良法提取
的基因组 DNA 质量，发现扩增效果图谱清晰、多态
性高，说明此方法在提取的过程中蛋白质、多糖等
物质除去的较干净，从而提高了对 PCR 反应体系中
TaqDNA聚合酶的活性以及引物结合模板的能力。
综上可知， 采用 CTAB 法、CTAB 改良法、SDS
法、SDS－CTAB 法 4 种方法提取大赖草叶片基因组
DNA 时，以 CTAB 改良法提取的效果最佳，可以满
足后续的分子生物学研究。
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（责任编辑 吕海霞）
寇小霞等：大赖草基因组 DNA 提取方法比较分析 4327