全 文 ：２０１４年１２月 甘　肃　农　业　大　学　学　报 第４　９卷
第６期７６～８１ ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＧＡＮＳＵ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ 双 月 刊
‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的优化
李谋强１，师桂英１，叶树辉２，黄彦玮１，边小荣１
（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新实验室，甘肃农业大学园艺学院，甘肃 兰州　７３００７０；
２．临洮县农技推广中心，甘肃 临洮　７３０５００）
摘要：以‘兰州百合’为试材，采用ＣＴＡＢ法提取百合嫩叶ＤＮＡ，对‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的Ｔａｑ酶、
ｄＮＴＰ、引物和模板ＤＮＡ进行４个因素４个水平优化试验，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析，最终获得的最佳反
应体系为：２５μＬ反应体系中含Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．５Ｕ，ｄＮＴＰ　０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，模板 ＤＮＡ　６０ｎｇ，
１０×Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）２．５μＬ，不足部分用ｄｄＨ２Ｏ补足．在获得最佳反应体系的基础上确定了引物最
佳退火温度为５３℃，最佳循环次数４５次．该优化体系以ＵＢＣ８７３作为引物对１８份‘兰州百合’材料ＤＮＡ进行ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ扩增，结果显示该优化体系具有较高的扩增稳定性．
关键词：‘兰州百合’；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；体系优化
中图分类号：Ｓ　６４４．１　　　　文献标志码：Ａ　　　　　文章编号：１００３－４３１５（２０１４）０６－００７６－０６
第一作者：李谋强（１９８７－），男，硕士研究生，主要从事蔬菜生理及栽培技术的研究．Ｅ－ｍａｉｌ：９１５３９５７７４＠ｑｑ．ｃｏｍ
通信作者：师桂英，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为作物遗传育种．Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｉｇｙ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
基金项目：甘肃省高等学校基本科研业务费项目；甘肃省农牧厅农业科技创新项目（ＧＮＣＸ－２０１３－３６）．
收稿日期：２０１４－０３－１８；修回日期：２０１４－０４－１６
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
ｆｏｒ‘Ｌａｎｚｈｏｕ　ｌｉｌｙ’
ＬＩ　Ｍｏｕ－ｑｉａｎｇ１，ＳＨＩ　Ｇｕｉ－ｙｉｎｇ１，ＹＥ　Ｓｈｕ－ｈｕｉ　１，ＨＵＡＮＧ　Ｙａｎ－ｗｅｉ　１，ＢＩＡＮ　Ｘｉａｏ－ｒｏｎｇ１
（１．Ｇａｎｓｕ　Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，
Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｎｔａｏ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｉｎｔａｏ　７３０５００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ
‘Ｌａｎｚｈｏｕ　ｌｉｌｙ’，ｗｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｉｔｓ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＣＴＡＢ，ｔｈｅｎ
ｗｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｔｈｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｔ　４ｌｅｖｅｌｓ　ａｎｄ　４ｆａｃｔｏｒｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｄＮＴＰ，ｐｒｉｍ－
ｅｒｓ，ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
ｗａｓ　２５μＬ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　０．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｄＮＴＰ　０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，０．５μｍｏｌ／Ｌ
ｐｒｉｍｅｒｓ，６０ｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｄｄＨ２Ｏ．Ｗｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　５３℃ ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ＰＣＲ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ａｎｄ　４５ｃｙｃｌｅｓ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｙｃｌｅ　ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｕ－
ｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ＵＢＣ８７３ｏｎ　１８‘Ｌａｎｚｈｏｕ　ｌｉｌｙ’，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｈａｄ
ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：‘Ｌａｎｚｈｏｕ　ｌｉｌｙ’；ＩＳＳＲ；ｓｙｓｔｅｍ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　　‘兰州百合’（Ｌｉｌｉｕｍ　ｄａｖｉｄｉ）是百合属川百合
的一个变种，无性繁殖，狭域分布，仅适合于兰州周
边二阴山区栽培［１］．目前生产上由于种质资源遗传
背景不清、有性杂交育种停滞、育成新品种极少［２－３］，
DOI:10.13432/j.cnki.jgsau.2014.06.015
第６期 李谋强等：‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的优化
农户从栽培田直接优选籽球组成混合群体栽培成为
常态．因此开展‘兰州百合’的遗传育种研究十分必
要．近年来‘兰州百合’的研究主要集中在栽培措施、
施肥水平，离体快繁等方面［４－５］，而有关细胞生物学、
杂种培育、倍性育种方面的报道很少［６－９］，尤其在
ＤＮＡ水平上的种质资源研究尚属空白．
分子标记技术是进行遗传变异研究的重要手
段，在诸多分子标记方法中，简单重复序列间 （ｉｎｔｅｒ
ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，简称ＩＳＳＲ）标记技术比较
适合‘兰州百合’的研究．该技术的基本原理为ＩＳＳＲ
利用ＳＳＲ序列，设计出能与各种ＳＳＲ序列相结合
的引物，对两个相距较近，方向相向的ＳＳＲ之间的
ＤＮＡ片段进行扩增．由于‘兰州百合’目前遗传背景
不清楚，基本未知其基因序列信息，而ＩＳＳＲ技术由
于不需要基因组序列的信息，不仅简便、易于操作；
且与ＲＡＰＤ技术相比，ＩＳＳＲ技术重复性高，稳定性
好；与 ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ技术相比，ＩＳＳＲ技术更快捷、
成本较低、ＤＮＡ用量小、安全性较高［１０］．
建立稳定ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系是ＩＳＳＲ分子标
记技术应用的基础．影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的因素很
多．为了保证ＩＳＳＲ－ＰＣＲ试验结果的稳定性、重复性
和可靠性，必须针对不同的材料、仪器设备、不同厂
家的试剂以及影响ＰＣＲ扩增的主要因子进行适当
地调整、筛选和优化［１１］．‘东方百合’‘龙芽百合’‘岷
江百合’等百合属植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化
研究已有文献报道，其反应体系优化方案均以琼脂
糖和ＥＢ检测扩增产物分析作为依据［１２］．由于采用
聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术检测扩增产物，
其分辨率要比琼脂糖和ＥＢ检测扩增产物高．因此，
本试验在前人研究的基础上，以聚丙烯酰胺凝胶电
泳结合银染技术检测扩增产物结果作为反应体系优
化的依据，研究了影响‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应
的多个因素，建立了适合‘兰州百合’的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
反应体系，以期为今后利用ＩＳＳＲ标记方法进行‘兰
州百合’种质资源研究提供技术支持．
１　材料与方法
１．１　材料与试剂
１．１．１　供试材料　‘兰州百合’种球来源于甘肃省
七里河区、榆中县、临洮县等地的１１个居群，于
２０１３年３月栽植于甘肃省临洮县上营乡包家山村，
２０１３年５月下旬取幼嫩叶片用冰盒带入实验室后
置于 －８０℃冰箱保存备用．
１．１．２　主要试剂　用于ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的Ｔａｑ
ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、均购自宝生物工程（大连）有限公司，引
物序列由上海生工生物技术有限责任公司合成．
１．２　试验方法
１．２．１　基因组 ＤＮＡ的提取　本试验参考Ｆｒｅｄｅｒ－
ｉｃｋ等［１３］的ＣＴＡＢ法提取‘兰州百合’基因组ＤＮＡ，
获取基因组ＤＮＡ后利用紫外分光光度计测定所提
取的总ＤＮＡ的含量和纯度，同时，采用１％琼脂糖
凝胶电泳法检测ＤＮＡ的质量．
１．２．２　ＰＣＲ扩增及产物检测　ＰＣＲ扩增程序初步
定为：９４℃预变性５ｍｉｎ；然后进行４０个循环：
９４℃变性５０ｓ，５２℃复性４５ｓ，７２℃延伸７５ｓ；循
环结束后７２℃延伸８ｍｉｎ．４℃保存．扩增结束后，
其产物在５％的聚丙烯酰胺凝胶上恒压２００Ｖ电泳
８０ｍｉｎ银染后在照相板上照相．
ＰＣＲ扩增效果判定参考丁信誉等［１４］的方法进
行：采用人工目测法，扩增效果判定标准是产物稳定
性、条带数丰富度、背景清晰度及条带的强度．扩增
条带根据强度分为主带和次带，在各处理间稳定性
好，目测估计清晰度及亮度达到 ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　１／３
的条带为主带．其余为次带，视为杂带处理，不计入
扩增的有效谱带统计范围．
１．２．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的优化　通过查阅关
于百合ＩＳＳＲ 分子标记的相关资料，从前人的文
献［１５－１６］中挑选出稳定性好，多态性高的引物２０条，
经初步筛选，以引物 ＵＢＣ８４４（（ＣＴ）８ＲＣ）为‘兰州
百合’ＩＳＳＲ体系优化引物．为了确定最佳的ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应条件，采用２５μＬ反应体系，对影响ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应的主要参数（ｄＮＴＰｓ、引物、模板ＤＮＡ和
Ｔａｑ酶）设置了浓度梯度，各参数的梯度见表１，各
处理反应体系中均含有１０×Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）２．５μＬ，并加ｄｄＨ２Ｏ补足至２５μＬ．逐一
优化每个参数，优化后的参数保持不变，再进行下一
个参数的优化．
１．２．４　确定退火温度、循环次数及最佳体系验证　
在筛选出最佳反应体系的基础上，对退火温度及循
７７
甘 肃 农 业 大 学 学 报 ２０１４年
环次数进行梯度试验，筛选出合适的退火温度以及
循环次数．退火温度分别设置为５１、５２、５３、５４℃；循
环次数分别设置为３５、４０、４５次．退火温度和循环次
数确定后，用优化的体系对‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
反应体系及其反应参数的稳定性进行验证．
表１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的因素与水平
Ｔａｂ．１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应参数 梯度
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶／Ｕ　 ０．５　 １．０　 １．５　 ２．０
ｄＮＴＰｓ／ｍｍｏｌ·Ｌ－１　 ０．１　 ０．２　 ０．３　 ０．４
引物／μｍｏｌ·Ｌ
－１　 ０．５　 １．０　 １．５　 ２．０
模板ＤＮＡ／ｎｇ　 ４０　 ６０　 ８０　 １００
２　结果与分析
２．１　ＤＮＡ的提取结果
由紫外分光光度计检测结果显示，所提取的‘兰
州百合’基因组ＤＮＡ 的Ｄ２６０／Ｄ２８０为１．８～２．０，说
明样品 ＤＮＡ 中蛋白质、多糖等杂质含量较少，
ＤＮＡ纯度高；１％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示
（图１），条带清晰，没有拖尾现象，点样孔无滞留，说
明提取的ＤＮＡ蛋白质和ＲＮＡ去除的比较干净．这
些结果说明采用改良ＣＴＡＢ法可以获得高质量的
‘兰州百合’基因组ＤＮＡ．
图１　ＤＮＡ提取结果
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
２．２　Ｔａｑ酶用量对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
Ｔａｑ酶用量变化对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增试验结果影
响较大，用量过少，不能扩增；用量过多，不仅增加试
验成本，而且导致非特异性产物增加．试验设置了４
个梯度，总反应体系为２５μＬ．如图２所示，Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶含量为０．５～２．０Ｕ，其含量的变化对
‘兰州百合’ＩＳＳＲ条带数量的影响较大，但对亮度的
影响不是很明显．随着Ｔａｑ酶含量的增高，扩增条
带的数量有所减少．当Ｔａｑ酶含量为０．５和１．０Ｕ
时，扩增出４条清晰条带，而Ｔａｑ酶含量为１．５和
２．０Ｕ的两个处理仅扩增出１条清晰条带．从成本
角度考虑，选择Ｔａｑ酶用量为０．５Ｕ为该体系最适
含量．
１：０．５Ｕ；２：１．０Ｕ；３：１．５Ｕ；４：２．０Ｕ．
图２　Ｔａｑ酶用量对ＩＳＳＲ扩增的影响
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ　ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２．３　ｄＮＴＰ用量对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
ｄＮＴＰｓ是ＰＣＲ扩增反应的原料，必须达到一
定的浓度才能满足要求，但过高也会与Ｔａｑ酶竞争
Ｍｇ２＋，对扩增不利［１７］．本试验设置了４个浓度梯度
进行优化，由图 ３ 可知，当 ｄＮＴＰｓ浓度为 ０．１
ｍｍｏｌ／Ｌ时，无任何扩增条带；当ｄＮＴＰｓ浓度为０．２
ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增条带少且相对较弱；当浓度为０．３、
０．４ｍｍｏｌ／Ｌ时条带多且清晰，两个处理均扩增得
到４条主带．考虑到浓度过高会与 Ｔａｑ 酶竞争
Ｍｇ２＋，因此选择０．３ｍｍｏｌ／Ｌ为‘兰州百合’ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应体系的最佳浓度．
１：０．１ｍｍｏｌ／Ｌ；２：０．２ｍｍｏｌ／Ｌ；３：０．３ｍｍｏｌ／Ｌ；４：０．４ｍｍｏｌ／Ｌ．
图３　ｄＮＴＰ浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄＮＴＰ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ
ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２．４　引物浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
引物质量与浓度是ＰＣＲ扩增反应的关键，浓度
太低不能进行有效扩增，浓度太高会增加引物二聚
体的形成，导致条带不稳定及清晰度下降．由图４可
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第６期 李谋强等：‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的优化
看出，引物浓度在０．５～１．５μｍｏｌ／Ｌ时均能扩增出
条带，但随着引物浓度升高条带数量逐渐减少，且比
较模糊．当引物浓度达到２．０μｍｏｌ／Ｌ时，条带明显
减少且模糊，几乎无扩增；引物浓度为１．５μｍｏｌ／Ｌ
时，扩 增 条 带 较 少，也 比 较 模 糊；引 物 浓 度 在
１．０μｍｏｌ／Ｌ时较在０．５μｍｏｌ／Ｌ时扩增的条带模
糊；只有当引物浓度为０．５μｍｏｌ／Ｌ时扩增出的条
带清晰度最好，该处理可获得７条主带．由此确定引
物浓度为０．５μｍｏｌ／Ｌ时是反应体系的最适浓度．
１：０．５μｍｏｌ·Ｌ－１；２：１．０μｍｏｌ·Ｌ－１；３：１．５μｍｏｌ·Ｌ－１；４：２．０
μｍｏｌ·Ｌ－１．
图４　引物浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ
ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２．５　模板用量对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
ＤＮＡ模板的含量也是影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增产
物的一个重要因素，模板含量过低，分子碰撞的机率
低，偶然性大，扩增产物无或不稳定，模板含量过高，
扩增产物的非特异性又会相应增加．从图５可知，模
板用量为４０～１００ｎｇ时，ＰＣＲ扩增产物的条带数和
亮度基本一致．考虑到模板ＤＮＡ含量过低扩增产
物将会不稳定，而模板ＤＮＡ含量过高，非特异性扩
增产物又会增加，因此本试验选择模板ＤＮＡ用量
为６０ｎｇ或８０ｎｇ．
１：４０ｎｇ；２：６０ｎｇ；３：８０ｎｇ；４：１００ｎｇ．
图５　模板用量对ＩＳＳＲ扩增的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２．６　退火温度对扩增产物的影响
本试 验 根 据 引 物 ＵＢＣ８４４ 的 理 论 Ｔｍ 值
５１．６℃，设置了４个温度梯度，分别为５１、５２、５３和
５４℃．由图６可以看出：当退火温度为５２～５４℃时
均能扩增出比较好的条带，而当退火温度为５１℃
时，扩增出的主带变少，杂带增多；考虑到退火温度
过高，扩增反应受抑制、产物少或无，退火温度过低
导致引物与模板的非特异性结合．因此本研究选择
５３℃为引物ＵＢＣ８４４的最适退火温度．
１：５１℃；２：５２℃；３：５３℃；４：５４℃．
图６　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中不同退火
温度的扩增结果
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒ
２．７　循环次数对扩增产物的影响
扩增的循环次数是影响扩增结果的又一重要因
素．循环次数少，扩增的产物就少；循环次数多，扩增
的产物多，但非特异性扩增也多，易出现拖带现象．
由图７可知，当循环次数为３５次时，几乎无扩增；以
后随着循环次数的增加，条带数目逐渐增多且清晰；
４０个循环时扩增的条带模糊不清；当达到４５个循
环时，无论是条带的数量，还是清晰度都最好．因此
确定４５个循环为‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 反应的最
佳循环次数．
１：３５；２：４０；３：４５．
图７　不同循环次数对扩增产物的影响
Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｙｃｌｅ　ｔｉｍｅｓ
９７
甘 肃 农 业 大 学 学 报 ２０１４年
２．８　最佳反应体系的验证
选择ＩＳＳＲ 引物 ＵＢＣ８７３（ＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡ－
ＣＡＧＡＣＡ）对优化确立的百合ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系
稳定性进行检测，结果如图８所示，该引物以１８份
‘兰州百合’材料为模板进行扩增，结果都能扩增出
清晰、重复性好的谱带．该引物扩增到多个主带，样
本间表现出较高的多态性．表明优化后的体系能够
用于‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的扩增．
１：３５；２：４０；３：４５．
图８　以ＵＢＣ８７３为引物对１８份‘兰州百合’进行扩增的效果
Ｆｉｇ．８　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　１８‘Ｌａｎｚｈｏｕ　ｌｉｌｙ’ｗｉｔｈ　ｐｒｉｍｅｒ　ＵＢＣ８７３
３　讨论
本试验结果表明，在２５μＬ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体
系中，模板用量对扩增影响不大，这与丁信誉等［１４］
的研究结果一致．可见‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系
对模板用量适应范围较大．Ｔａｑ酶的活性与用量是
关系到扩增能否正常进行的重要因子，不同的生产
厂家对酶浓度的标定可能不同［１８］，因此在试验的过
程中，应针对所用的Ｔａｑ酶确定用量．本试验结果
显示，随着Ｔａｑ酶用量的增加，扩增条带的数量有
所减少，这与思彬彬等［１９］对藤三七的研究结果一
致，其原因可能是受Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶中甘油成分
的影响，甘油是Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶的抑制剂，能够降
低Ｔａｑ聚合酶的活性，从而影响扩增结果［１７］．引物
常用浓度范围为０．２５～１．０μｍｏｌ／Ｌ
［１９］，本试验选
择０．５μｍｏｌ／Ｌ为引物最适浓度，在常用的浓度范
围内．
ＩＳＳＲ引物的长度一般都在１５～２４ｂｐ，反应的
退火温度在５２～５５℃，本试验认为引物ＵＢＣ８４４的
最适退火温度为５３℃，比其理论Ｔｍ 值高１．４℃，
这与邓明文等［１２］研究的‘岷江百合’的退火温度为
５２．８℃的结果基本一致．本试验确定４５个循环为
最佳循环次数，与大多报道中提到的循环次数为３５
～４０次不一致，其原因可能是由于物种不同，仪器
设备不同造成ＰＣＲ反应条件有所差异．
目前报道的百合ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系均以琼脂
糖和ＥＢ检测扩增产物分析作为反应体系优化的依
据．而采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染技术检测
扩增产物，其分辨率要比琼脂糖和ＥＢ检测扩增产
物要高．因此，本研究采用后者作为反应体系优化的
依据，在百合ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化技术细节方
面有所改进．
此外，在涉及各种作物，各种分子标记的各种反
应体系优化方案中，通过人工目测来判定扩增效果
是通用的方法，在百合ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化研
究中，以丁信誉等关于‘东方百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应
体系中的ＰＣＲ扩增结果人工目测判定标准较为严
谨．该标准主要参考条带亮度、背景清晰度进行判
断，产物稳定性、条带数量丰富度从高到低依次打
分，进行数据分析．因此，本研究依据此方法对ＰＣＲ
扩增效果进行分析．考虑到杂带的影响，笔者补充了
条带强弱判定的依据，即：扩增条带根据强度分为主
带和次带，在各处理间稳定性好，目测清晰度及亮度
达到ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ　１／３的条带为主带．其余为次带，
视为杂带处理，不计入扩增有效谱带统计范围．当
然，本研究所补充的判定主带的这一标准不可避免
０８
第６期 李谋强等：‘兰州百合’ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系的优化
的带有主观性，该标准获得同行的认可，尚需作进一
步完善．
参考文献
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理指标的影响［Ｊ］．甘肃农业大学学报，２００９，４４（１）：
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研究［Ｊ］．西北农林科技大学学报：自然科学版，２００９，
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