全 文 ：TheEffectofTCMTreatment“WarmingYang, PromotingBloodCirculation
andResolvingPhlegm”onTNF-αExpressionofExperimentalRatswithCHF
SHENYan1 , CAOHong-xin2 , ZHOUJing-hua3 , XUHui3
(1.YueyangHospitalofTraditionalChinese＆ WesternMedicine, Shanghai200437, China;
2.ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicine, Beijing100700 , China;
3.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, China)
Abstract:Objective:ToinvestigatetheefectofTCMtreatment“warmingYangpromotingbloodcirculationandresolving
phlegm” onTumornecrosisfactor-alpha(TNF-α)expressionincongestiveheartfailure(CHF)ratmodelinduced
byisoproterenol(ISO), andtoexploretheroleofTNF-αinCHFandthetherapeuticmechanismofthetreatmenton
myocardialremodeling.Method:CHFanimalmodelswereinducedbyISO.After6weeks, hemodynamicsandpathologi-
calmorphologywereassayedandtheexpressionofTNF-αproteinweredetectedbyimmunohistochemistry.Results:The
TCMtreatmentcouldincreasethelevelofdp/dtmax, dp/dtminandLVSP, anddown-regulateLVEDP, andlowerthe
heartweightindex.ItalsocouldinhibitTNF-αproteinexpressioninCHF.Conclusion:Thetreatmentcanimprovemyo-
cardialsystoleanddiastoleandinhibitthemyocardialremodeling, whichmayberelatedtodown-regulatingtheprotein
expresionofTNF-α.
Keywords:WarmingYang, promotingbloodcirculationandresolvingphlegm;CHF;TNF-α;Myocardialremodeling
棉团铁线莲总皂苷抗肿瘤作用研究
杨林 ,姚广玉 ,薛鸿燕 ,杨明俊＊
(兰州理工大学生命科学与工程学院 ,甘肃 兰州 730050)
摘　要:目的:研究棉团铁线莲总皂苷的体内外抗肿瘤作用。方法:采用乙醇提取 、大孔树脂除糖的方法
制备棉团铁线莲总皂苷 ,以 MTT法和移植性 H22实体荷瘤小鼠为模型 ,检测不同剂量棉团铁线莲总皂苷
的体内外抗肿瘤作用。结果:当质量浓度为 0.1 ～ 1mg·mL-1时 ,其对体外培养的 3株人肿瘤细胞
HepG2、SMMC-7721和 Hela的增值表现出显著的抑制作用 , IC50依次为 0.5298mg·mL-1、0.2047mg·
mL-1 、0.2877mg·mL-1。体内实验表明 ,棉团铁线莲总皂苷高 (1.5g·kg-1)、中 (0.75g·kg-1 )、低
(0.375g·kg-1)3剂量组也较好的抑制了荷瘤小鼠瘤块的生长 ,抑瘤率依次为 41.55%、 34.96%、
32.37%;通过肿瘤组织的病理学切片观察 ,同样显示棉团铁线莲总皂苷具有较好的抗肿瘤作用。但比
较给药后荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数后发现 ,它对荷瘤小鼠的免疫功能亦具有一定的抑制作用。
结论:棉团铁线莲总皂苷具有较好的抗肿瘤作用 ,但对动物的免疫功能有所抑制 。
关键词:棉团铁线莲;总皂苷;抗肿瘤
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2011)02-0021-04
收稿日期:2010-12-05　　修回日期:2011-01-17
基金项目:甘肃省自然科学研究基金计划项目(编号:0916RJZA007)
作者简介:杨林(1974-), 男 ,博士 ,副教授 ,主要从事药用植物及天然
产物药理活性研究。
＊通讯作者:杨明俊 ,男 ,博士 , E-mail:yangmj@lut.cn
　　棉团铁线莲(ClematishexapetalaPal.)系毛茛科
铁线莲属植物 ,又名黑薇 、山蓼 、棉花子花 、野棉花等。
分布于朝鲜 、蒙古 、西伯利亚东部及我国的东北 、内蒙
古草原 、山西 、河北 、陕西 、甘肃东部 [ 1] 。以根 、叶入
药 ,为《中国药典 》(2005版)收载的三种正品威灵仙
药材之一。具有祛风除湿 、通经活络 、止痛抗癌等功
效 [ 2] 。临床上主要用于治疗风湿痹痛 、屈伸不利 、四
肢麻木 、跌打损伤以及胃癌 、食管癌 、体表良性肿瘤
等 [ 3] ,配合用药 ,可以减轻癌症患者放 、化疗的不良反
应 [ 4] 。现代药理学研究表明 ,棉团铁线莲具有抑菌 、
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抗肿瘤 、抗炎 、镇静 、止痛 、抗利尿 、利胆 、免疫抑制 、松
弛平滑肌以及对心脑血管系统的影响等多种药理作
用 [ 5] 。 《内蒙古植物志 》记载 ,棉团铁线莲根中含有生
物碱 、三萜皂苷 B、铁线莲皂苷 C、白头翁素 、谷甾醇 、
肉豆蔻酸等有效成分 [ 6] 。本实验通过观察不同剂量
棉团铁线莲总皂苷对体外培养的人肝癌细胞 Hep-
G2、SMMC-7721、宫颈癌细胞 Hela增殖的影响 ,以及
对移植性 H22荷瘤小鼠瘤块的生长 、脾脏指数 、胸腺指
数的影响 ,探讨棉团铁线莲总皂苷的抗肿瘤作用 ,以期
为更好的开发传统中药材和临床用药提供科学依据 。
1　材料
1.1　药材　棉团铁线莲于 2009年 8月采自甘肃东部
合水县子午岭连家砭林区 ,经兰州理工大学生命科学
与工程学院杨林副教授鉴定为毛茛科铁线莲属植物棉
团铁线莲 ClematishexapetalaPal.,其标本保存于兰州
理工大学生命科学与工程学院天然药物研究与开发实
验室。
1.2　瘤株与实验动物 　人肝癌细胞株 Hep-G2、
SMMC-7721、人宫颈癌细胞 Hela均引自兰州大学细
胞培养室;H22细胞株购于甘肃省医学科学研究院。
SPF级昆明种小鼠 55只 ,雌雄兼用 ,体重 18 ～ 22g,购
于兰州大学实验动物中心 ,许可证号:SCXK(甘)2009
-0004。
1.3　仪器与试剂　旋转蒸发仪(上海亚荣);真空干
燥箱(上海博讯);电子分析天平(Metler-Toledo);酶
联免疫检测仪(BioTek);CO2培养箱(Binder);96孔细
胞培养板(Costar);0.22μm针孔滤器 (GIBCO);超净
工作台(上海博讯);高压灭菌锅(上海博讯);倒置显
微镜(OLYMPUS);血球计数板;乙醇(工业级);RPMI
-1640(美国 GIBCO公司);DMEM(培养 Hela用);无
支原体新生小牛血清(杭州四季青);胰蛋白酶(鹏程
生物);噻唑兰(MTT,鹏程生物);丝裂霉素(MMC,浙
江海正药业);DMSO(二甲基亚砜 ,分析纯);注射用环
磷酰胺(CTX,山西普德药业);0.9%NaCl(甘肃扶正
药业)。
2　方法
2.1　棉团铁线莲总皂苷的制备　将棉团铁线莲干燥
根粉碎后称取 600g粉末 ,加 3000mL60%乙醇 ,水浴
回流提取 3次 ,回收乙醇 ,提取物上大孔树脂柱 ,分别
以水 、20%、50%、95%乙醇洗脱 ,收集 50%、95%洗脱
液 ,回收乙醇 ,得总皂苷。
2.2　体外抗肿瘤试验(MTT法)[ 7] 　取对数生长期的
人肝癌细胞 Hep-G2、SMMC-7721、人宫颈癌细胞
Hela, 0.25%的胰蛋白酶消化 ,用含 10%小牛血清的
RPMI-1640或 DMEM培养液调节细胞浓度至 1 ×
10
5 /mL,分别接种于 96孔细胞培养板中 ,每孔加入细
胞悬液 100μL,置 5%CO2 、37℃培养箱中过夜 ,次日细
胞贴壁后加药 ,药物设 5个梯度 ,使其终浓度依次为
1mg·mL-1 、 0.75mg· mL-1 、 0.5mg· mL-1 、 0.25mg·
mL-1 、0.1mg·mL-1 , 同时设不加药的阴性对照组和
50μg·mL-1的丝裂霉素组 ,每组设 5个重复 ,每孔加样
100μL。加药培养 48h后 ,每孔加入 5mg·mL-1 MTT
20μL,继续培养 4h,然后快速翻板法弃去孔内液体 ,每
孔加 100μLDMSO,振荡 10min,使形成的甲瓒结晶充
分溶解 ,于酶标仪上在 490nm波长处检测各孔的 OD
值 。按下列公式计算各组的抑制率(RI)。
抑制率 (RI)=1 -(药物组 OD值 /阴性对照组
OD值)×100%
并根据量效关系和直线回归法计算棉团铁线莲总
皂苷对各株细胞的半数抑制浓度 IC50。
2.3　体内抑瘤试验[ 8, 9]
2.3.1　动物建模与分组　健康昆明种小鼠 55只 ,雌
雄兼用 ,在实验室自由摄食饮水适应 3d后建模。取接
种 7 ～ 10d生长良好的 H22荷瘤小鼠 ,无菌条件下抽取
乳白色腹水 ,生理盐水稀释调整瘤细胞数至 1×107 /
mL,台盼兰(2g·L-1)染色法检测细胞存活率≥95%。
用无菌注射器吸取瘤细胞悬液接种于小鼠右前肢腋窝
皮下 ,每鼠 0.2mL,造 H22实体瘤模型。接种 24h后称
重 ,随机分成 5组 ,每组 11只 ,分组情况为:荷瘤对照
组 ,环磷酰胺(CTX)组 ,棉团铁线莲总皂苷高 、中 、低 3
个剂量组。 5组分笼编号喂养 。
2.3.2　给药方法　接种次日给药 ,荷瘤对照组:灌服
(ig)生理盐水 ,剂量 20mL·kg-1 ,每日 1次 ,连续 10d;
环磷酰胺(CTX)组:腹腔注射 (ip)CTX,剂量 20mg·
kg-1 ,隔日 1次 ,共 5次;棉团铁线莲总皂苷高 、中 、低
剂量组:灌胃给药 , 剂量依次为 1.5g·kg-1、 0.75g·
kg-1、0.375g·kg-1 ,每天 1次 ,连续 10d。
2.3.3　指标的测定　末次给药 24h后颈椎脱臼法处
死小鼠 ,分别称体重 ,然后解剖剥离出瘤块 、脾脏 、胸
腺 ,用滤纸吸净组织上的液体 ,精密称量各组织及脏器
重量 ,记录数据 ,计算抑瘤率 、脾脏指数及胸腺指数 。
抑瘤率 =(C-T)/C×100%
其中 C为对照组平均值 , T为实验组平均值。脾
脏指数 =脾脏平均重量(mg)/平均体重(g),胸腺指数
=胸腺平均重量(mg)/平均体重(g)。
2.4　肿瘤组织病理学观察　剥取各组新鲜肿瘤组织 ,
用 10%福尔马林溶液固定 ,取材 ,常规石蜡包埋切片 ,
HE染色 ,封片 ,普通光学显微镜下观察各组织的病理
形态变化。
2.5　统计学分析　数据采用 SPSS16.0软件处理 ,以
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均数 ±标准差( x±s)表示 ,进行方差分析 , P<0.05为
显著性差异 。
3　结果
3.1　棉团铁线莲总皂苷体外对 HepG2、SMMC-
7721、Hela株肿瘤细胞增殖的影响
结果见表 1。实验结果表明 ,棉团铁线莲总皂苷
在其质量浓度为 0.25 ～ 1mg·mL-1时 ,对人肝癌细胞
HepG2、SMMC-7721及人宫颈癌细胞 Hela的增值均
有显著的抑制作用 ,且随药物浓度的加大 ,抑制作用愈
强 ,呈明显的剂量依赖关系。当浓度为 1mg·mL-1时 ,
其对以上三种细胞的抑制率分别为 86.0%、93.8%、
85.1%,接近于阳性药丝裂霉素 。根据剂量与抑制关
系计算出棉团铁线莲总皂苷对 HepG2、SMMC-7721、
Hela三株肿瘤细胞的 IC50 ,依次为 0.5298mg·mL-1 、
0.2047mg·mL-1、0.2877mg·mL-1。由此可见 ,三株细
胞中 SMMC-7721对棉团铁线莲总皂苷最为敏感 ,
Hela次之 ,其次为 HepG2。
表 1　各浓度棉团铁线莲总皂苷对 HepG2、
SMMC-7721、Hela的抑制率和 IC50
细胞株 药物浓度(mg·mL-1)抑制率(IR) IC50(mg·mL-1)
0.1 1.5%
0.25 16.9%
HepG2 0.5 52.2% 0.5298
0.75 56.1%
1 86.0%
50μg·mL-1丝裂霉素 92.4%
0.1 15.9%
0.25 66.1%
SMMC-7721 0.5 88.9% 0.2047
0.75 92.7%
1 93.8%
50μg·mL-1丝裂霉素 96.6%
0.1 15.7%
0.25 47.9%
Hela 0.5 72.5% 0.2877
0.75 79.7%
1 85.1%
50μg·mL-1丝裂霉素 97.8%
3.2　棉团铁线莲总皂苷体内抗肿瘤作用
3.2.1　对 H22荷瘤小鼠肿瘤组织的生长及免疫器官
的影响
实验结果见表 2。由此实验结果可以看出灌服给
药中(0.75g·kg-1)、高(1.5g·kg-1)剂量的棉团铁线
莲总皂苷明显的抑制了 H22荷瘤小鼠瘤块的生长 ,抑
制率分别为 34.96%、41.55%,与荷瘤对照组相比 ,具
显著差异(P<0.05)。小剂量组(0.375g·kg-1)虽然
也表现出了一定的抑制效果 ,但差异不显著 。 CTX组
抑瘤率为 44.40%(P<0.01)。
胸腺和脾脏是动物重要的免疫器官 ,胸腺指数和
脾脏指数的大小能够直接反映机体免疫功能的高低。
棉团铁线莲总皂苷高 、中 、低 3剂量组灌胃 H22荷瘤小
鼠后 ,各组的胸腺指数和脾指数见表 2。与 CTX组相
比 ,棉团铁线莲总皂苷明显的提高了荷瘤小鼠的胸腺
指数(高 、低剂量 P<0.05,中剂量 P<0.01),但与荷
瘤对照组相比 ,棉团铁线莲总皂苷表现出了轻微的免
疫抑制作用 ,影响不是很明显。相反 ,无论与荷瘤对照
组还是 CTX组比较 ,棉团铁线莲总皂苷给药组显著的
降低了荷瘤小鼠的脾脏指数(P<0.05或 P<0.01)。
由此可见 ,虽然棉团铁线莲总皂苷在体内表现出了一
定的抗肿瘤活性 ,但对机体的免疫功能也有所抑制 ,与
胸腺相比 ,对脾脏的影响尤为明显 。此结果与夏伦祝
等 [ 10]研究结论相一致。
3.2.2　肿瘤组织的病理学观察
各组显微照片见图 1。对照组瘤细胞生长旺盛 ,
排列紧密 ,核大深染 ,核分裂象多见。环磷酰胺组瘤细
胞排列稀疏 ,细胞结构严重受损 ,异型明显 ,可见大片
坏死区 ,细胞核固缩 、崩解 ,坏死较多见 。棉团铁线莲
总皂苷组肿瘤组织生长异常 ,亦可见坏死区 ,细胞排列
松散 ,细胞核固缩 、破碎 、溶解 ,与环磷酰胺组相比 ,坏
死区较少 ,坏死程度较轻 ,但无明显差别。
表 2　不同剂量棉团铁线莲总皂苷对 H22荷瘤小鼠抑瘤率 、胸腺指数及脾指数的影响( x±s)
组别 n 剂量(g·kg-1) 瘤重(g) 抑瘤率(%) 胸腺指数(mg·g-1) 脾指数(mg·g-1)
荷瘤对照组 11 20(mL·kg-1) 1.1917±0.8981 - 2.7817±0.7481△△ 6.2936±1.7857
CTX组 11 20(mg·kg-1) 0.6627±0.2946＊＊ 44.40% 1.8786±0.8230＊＊ 6.5730±2.9843
高剂量组 11 1.5 0.6966±0.4193＊ 41.55% 2.4109±1.2356△ 5.6116±1.7385＊
中剂量组 11 0.75 0.7751±0.5863＊ 34.96% 2.7567±1.1355△△ 4.7466±1.4668＊＊△
低剂量组 11 0.375 0.8060±0.5448 32.37% 2.3229±0.9263＊△ 4.9870±2.3047＊＊△
　　注:与荷瘤对照组比较 , ＊＊P<0.01, ＊P<0.05;与 CTX组比较 , △△P<0.01, △P<0.05。
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图 1　各组肿瘤组织的病理学观察(HE染色 100×)
Ⅰ :空白组;Ⅱ:模型组;Ⅲ:给药组。
4　讨论
棉团铁线莲作为传统药材威灵仙的药源之一 ,运
用于临床已经有着悠久的历史 ,一直以来主要用于治
疗风湿痹症 、关节屈伸不利以及跌打损伤等。近些年
来 ,旧药新用 ,许多人将其用于胃癌 、食管癌等一些恶
性肿瘤的治疗 ,得到了很好疗效。但棉团铁线莲具体
的抗肿瘤成分还不是十分明确 ,本实验就其主要药效
成分皂苷加以提取 ,并进一步对总皂苷的体内 、外抗肿
瘤作用进行研究 。实验结果提示我们在临床用药时要
充分考虑中医辨证施药的理念 ,在最大发挥药效的同
时 ,尽可能的降低其毒副作用。
参考文献:
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AntitumorActivitiesofTotalSaponinsfromClematisHexapetalaPal.
YANGLin, YAOGuang-yu, XUEHong-yan, YANGMing-jun
(SchoolofLifeScienceandEngineering, LanzhouUniversityofTechnology, Lanzhou730050, China)
Abstract:Objective:ToinvestigatetheantitumorefectoftotalsaponinsofClematishexapetalaPal.Methods:Thetotal
saponinsfromClematishexapetalaPal.werepreparedbyethanolextractionandmacroporousresin.Itsanti-tumorac-
tivityinvitroandinvivowasevaluatedbyMTTcolorimetricassayandH22 cels-bearingmicemodels.Results:There-
sultsshowedthatthetotalsaponinsofClematishexapetalaPal.significantlyinhibitedproliferationofthehumanhepato-
macellinesHepG2, SMMC-7721 andthehumancervicalcarcinomacelHelaattheconcentrationof0.1-1mg·
mL-1.TheIC50valueonthesethreetumorcelswere0.5298mg·mL-1 , 0.2047mg·mL-1 and0.2877mg·mL-1 respec-
tively.Invivo, high(1.5g·kg-1), middle(0.75g·kg-1)andlow(0.375g·kg-1)dosetotalsaponinsofClematishexap-
etalaPal.alsosignificantlysuppressedthetumorgrowthwithtumorinhibitionrateof41.55%, 34.96% and32.37%
respectively.Theslicethroughthepathologicalobservationoftumortisuealsoindicatedthatithasgoodantitumoractiv-
ity.However, itcanalsoreducethespleenindexanddisplayscertaininhibitoryactiontotheimmuneorganoftumor-
bearingmice.Conclusion:ThetotalsaponinsfromClematishexapetalaPal.hasasignificantantitumorefect, butitalso
cansuppresimmunefunctionofexperimentalsanimalsinvivo.
Keywords:ClematishexapetalaPal.;Totalsaponins;Anti-tumor
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