全 文 ：一 18 24一 药物分析杂志 hi Cn Jh P~ An l a 2( 0 )6 , 26 ( 9)
反相高效液相色谱 一蒸发光散射检测法测定
消渴清颗粒中菠莫皂昔元的含量
刘占强 , 章顺楠 ’ , 刘彤 ,刘金平
(天津天士力制药股份有限公司 ,天津 3以科0 2 )
摘要 目的: 建立消渴清颗粒中菠葵皂昔元的含量测定方法 , 为其提供质量标准 。 方法 : 应用高效液相色谱 一 蒸发光散射检
测器 ,迪马 (钻石 ) iD a m on isl C l: 色谱柱 ( 250 ~ 、 4
.
6
~
,
5 林m ) , 以甲醇为流动相 ,流速为 0 . s mL · m in 一 ’ ,检测器漂移管温度
为 70 ℃ ,载气流速为 2 . Z L · m i n 一 ’ 。 结果 :菠契皂昔元在 1 . 巧 此 一 5 . 75 此范围内呈 良好线性关系 ( r = 0 . 999 9 ) ,平均回收率
为 10 . 6% ( RS D = 2 . 1% ) 。 结论 :该方法有创新性 ,简便 、准确 ,无干扰 ,可用于消渴清颗粒中菠葵皂昔元的质量控制 。
关键词 : 消渴清颗粒 ;菠莫皂昔元 ; RP 一 H P Lc 一 E巧D
中图分类号 : gR l7 文献标识码 : A 文章编号 : 0254 一 1793 (2 0 6 ) 09 一 12 84 一 03
R P 一 H P L C 一 E L S D d e et r m l n s it o n o f
S s r S S S S P 0 g em l I n 兀a o ke q i n g G r a n ul e s
L IU Z h a n 一 q ia n g , Z HA N G S h u n 一 n a n , L IU T o n g , L IU Ji n 一 P in g
( iT anj i
n T as ly C or u p
,
T ianj i
n 3 0( 抖 02 , Ch i n a )
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ELS D M
e ht o d : hT
e e o lu m n u s e d w a s a p a e k e d w i t h s 林m s ta t i o n娜 D i a m o n s i l ( 2 5 0 m m x 4 . 6 m m , 5 林m ) . hT e
m o b i l p h a s e e o n s i s t e d o f m e t h a n o l
,
iw th a fl ow ar t
e of 0
.
s m L
·
m i n
一 1 . A t a t e m p e ar tu er o f d ir ft tu b e of 7 0℃ a n d th e
n e bul i z e r g a s fl o w r at e w a s 2
.
Z L
· 而 n 一 盆. R e s ul t : hT e l in e ar ar n g e o f t h e Sa sr a s a p o g e n i n w a s 1 . 15 林g 一 5 . 75 林g
(
r = 0
.
99 99 )
,
hT
e va e r a g e er e o v e理 of S a sr a s a p o g e n i n w a s lX() . 6 % ( R SD = 2 . 1% ) . C o n c lius o n : hT e m e t h o d 15
i n n o v at iv e
,
er l iab l
e , s im p le p er e i s e
, a n d e a n b e u s e d fo r th e 四 al iyt e o n t or l o f X i a o k e q i n g Gar n u l e s .
K e y w o r ds : X i a o k e q i n g Gar n u l e s ; Sasr
a s a P o g e n i n ; H PL C 一 ESL D
消渴清颗粒是由知母 、苍术 、 地锦草等药材制成
的复方制剂 ,具滋阴降火 、 清热化湿 、活血化痕之功
效 ,临床主要用于糖尿病及糖尿病引起的并发症 。
方中知母为君药 ,知母中含有多种街体皂昔 ,其皂昔
元主要有菠葵皂昔元 ( Sasr as ap og en in ) 、 马尔可皂昔
元 ( Mar k o罗 n i n ) 、新吉托皂普元 ( n e o ig t o罗 n i n )等 , 现
代药理研究表明知母皂昔及其皂昔元为知母的主要
活性成分 [’ ,2] 。 参照 20 5 版中国药典一部及相关
文献 「’ ,4 , ]故将测定菠莫皂昔元含量作为考察指标
控制本品质量 ,对建立消渴清颗粒中葵皂昔元含量
测定方法进行了研究 。
1 仪器与试药
Wa t e r s 2695 高效液相色谱仪 ; A l te e h 2 000 蒸
发光散射检测器 ; 甲醇为色谱纯 ( ME R CK ) , 水为超
纯水 , 其他试剂均为分析纯 ; 菠莫皂昔元对照品
( 7科 一 9904 ,供含量测定用 ,购自中国药品生物制品
检定所 ) ,消渴清制剂为临床研究用药 。
2 色谱条件
色谱柱 :迪马 (钻石 ) D i a m o n s i l e 1 8柱 ( 2 50 m m 、
4
.
6 m m
,
5 林m ) ; 流动相 : 甲醇 ; 流速 : 0 . 8 m L ·
m in
一 ` ;蒸发光检测器漂移管温度 70 ℃ , 载气流速
2
.
Z L
·
m in
一 ’ ;柱温 : 30 ℃ 。 对照品溶液进样 10 , 20
林L , 供试品及阴性样品溶液进样 20 林L 。 按以上色
谱条件得到对照品 、 消渴清供试品及消渴清阴性样
品色谱图见图 1 。
3 溶液的制备
3
.
1 对照品溶液 精密称取菠葵皂昔元对照品适
量 ,加甲醇制成每 1 m L 含有 0 . 2 30 m g 的溶液 , 即
` 通讯作者 eT l : ( 0 2 2 ) 2 6 7 36 8 7 0 ; E 一 m al : z s n @ t as ly . e o m
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2006. 09. 016
药物分析杂志 C h i nJh P~ Anl a2( 0巧 , 26 ( 9) 一 128 5 一
Y = 1
.
9637X + 5
,
0 57 4 r 二 0
.
999 9
结果表明菠葵皂昔元在 1 . 1 5 一 5 . 75 林g 范围内
重量对数值与峰面积对数值的线性关系良好 。
4
.
3 精密度试验 精密吸取浓度为 0 . 230 m g ·
mL
一 ’的对照品溶液 10 林L , 重复进样 5 次 , 测定 ,
R SD 为 0 . 7% 。
4
.
4 稳定性试验 取待测供试品溶液 ,分别在 O ,
l
,
2
,
4
,
8
,
12
,
24 h 进样 ,测定峰面积 , R SD 为 1 . 0 % 。
4
.
5 重复性试验 取同一批次样品 5 份 ,精密称
定 ,按 “ 3 . 2 ” 项下方法操作 ,依法进样测定 , 样品中
筱葵皂昔元平均含量为 0 . 331 % ( n 二 5 ) , sR D 为
2
.
1%
4
.
6 加样回收率试验 取已知含量消渴清颗粒粉
0 5 10 1 5
t m/ i
n
图 1 对照品 ( A ) 、供试品 ( B ) 、 阴性样品 ( C )高效液相
色谱图
iF g 1 H PLC e玩 m a t o gr 别口 s of 花 fe er n e e 、 b s atn e e ( A ) ,
s
am p l
e
( B ) an d
n e g iat
v e s田p le ( C )
1
. 菠葵皂昔元
得 。
3
.
2 供试品溶液 取消渴清颗粒适量 ,研细 ,取约
1
.
4 9
,精密称定 ,置烧瓶中 , 加 20 % 盐酸溶液 ( 20 。
10 ) 30 m L
, 超声使溶散 , 置水浴上蒸气缓慢回流
l
.
s h
,放冷后加人氯仿 30 m L , 回流萃取 20 而 n 。 分
取氯仿层 , 水层再以氯仿萃取 2 次 (巧 m L 每次 ) ,合
并氯仿提取液 , 蒸干 , 残渣加甲醇溶解 , 转移至 25
m L量瓶中 , 甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,即得 。
4 方法与结果
4
.
1 检测器参数优化 蒸发光检测器为质量型检
测器 ,不合适的漂移管温度和气体流速将会产生较
大噪音 。 根据流动相种类和 比例 ,在不同漂移管温
度和不同载气流速条件下观察菠葵皂昔元对照品的
信号强度 ,最后确定漂移管温度 70 ℃ , 气体流速为
2
.
Z L
·
m in
一 ’ 为最优检测器参数 。
4
.
2 线性关系考察 精密称取菠莫皂昔元对照品
适量 ,加甲醇制成浓度为 0 . 230 m g · m L 一 ’ 的对照品
溶液 , 精密吸取对照品溶液 5 , 10 , 巧 , 20 , 25 林L , 注
人液相色谱仪 , 测定峰面积 , 以峰面积常用对数为纵
坐标 ,进样量的常用对数为横坐标 , 绘制标准曲线 ,
得回归方程为 :
末约 0 . 7 9 ( 0 . 33 1% ) ,精密称定 , 置烧瓶中 ,取菠葵
皂普元对照品约 2 . 31 m g , 精密称定后加人烧瓶中 ,
按 “ 3 . 2 ” 项下方法操作 , 依法进样测定 。 平均回收
率为 10 0 . 6% ( n 二 5 ) , SR D 为 2 . 1% 。
4
.
7 空白阴性试验 按处方比例制备空缺知母药
材的阴性消渴清制剂 ,按 “ 3 . 2 ” 项下方法操作 , 进样
加 卜L ,结果阴性制剂色谱图在菠葵皂普元峰相应位
置上无相应峰存在 。
4
.
8 样品测定 分别精密吸取对照品溶液 10 ,加
匹 ,供试品溶液 20 泌 ,注人液相色谱仪 , 依上述色
谱条件测定 , 以外标两点法对数方程计算菠葵皂昔
元含量 ,结果见表 1。
表 1 样品含工测定结果 ( n 二 3)
aT b 1 R es ul st of
s别口 Pl es d et r in n a tion
批号 (助 t No . ) 菠羹皂昔元含量ms(
`
g
一 ,
) sR D/ %
t e o n t e n t ot s a sr as 叩 0罗m n )
2X() I Z DI 3 1
2X() I ZDI 3 2
2X() I ZDI 3 3
5 讨论
5
.
1 菠葵皂昔元在紫外区内几乎无吸收 , 仅在近
紫外区有末端吸收 ,采用高效液相紫外法检测时 ,往
往由于灵敏度低 、基线易漂移及溶剂的干扰而导致
测定结果无法反映真实含量 ;另有文献报道采用示
差折光检测法 e[, , 〕 , 但示差折光检测器灵敏度相比
蒸发光散射检测器较低且易受溶剂干扰导致基线不
稳漂移 , 故选用高效液相 一蒸发光散射检测法 。
5
.
2 实验比较了甲醇 、 甲醇 一 水 ( 95巧 ) 、 乙睛 、 乙
睛 一 水 ( 95 : 5 ) 多种流动相系统 , 结果以 甲醇 、 甲
醇 一水 (95 : 5) 都可达到令人满意的分离效果 ,但甲
一 12 86 一 药物分析杂志 hC ni J Ph ~ nA al 2 0( 巧 , 26 ( 9)
醇流动相菠葵皂昔元保留时间为 1 m in , 而甲醇 -
水流动相保留时间为 16 而 n ,且用甲醇 一 水流动相
需较高蒸发光检测器漂移管温度和载气流速 ,故选
用甲醇为流动相 。
5
.
3 实验发现菠莫皂昔酸水解程度受其加热方式
影响较大 。 实验分别考察了电炉加热水解 、 置水浴
中加热水解 、置水浴上蒸气加热水解三种不同加热
方式 。 结果电炉加热含量测定结果波动较大 ;置水
浴中加热水解含量测定结果偏低 ;置水浴上蒸气加
热水解则含量测定结果较为理想 、稳定 ,故选择水浴
蒸气加热酸水解 。
分别测定了不同加热方式的水解液温度 , 其中
电炉加热温度为平均 97 ℃ ,置水浴中加热为 94 . 5
℃ ,置水浴上蒸气加热为 91 ℃ 。 结合该温度数据和
实验结果初步分析 ,电炉加热温度较高 ,且易受热不
均匀 ,故导致含量测定结果波动较大 ;置水浴中加热
水解时 ,装有水解液的烧瓶浸人沸水浴中 ,整个烧瓶
内温度都比较高 , 当经冷凝管冷凝的盐酸溶液缓慢
回滴时因为烧瓶内上部温度较高 ( 85 ℃ ) ,部分盐酸
重新挥发 ,影响水解酸度且回流效果不好 ,导致实验
含量测定结果偏低 ;置水浴上蒸气加热则烧瓶只有
底部受热 ,上部温度并不太高 ( 7 ℃ ) , 故盐酸溶液
可以正常缓慢回滴 ,酸解浓度比较稳定 ,含量测定结
果比较理想 。 由此可见 , 酸度和温度是影响菠莫皂
昔水解程度的两个关键因素 ,就酸度和温度与菠葵
皂昔水解程度的关系作者将另文进行详细探讨叙
述 。
中国药典 20 0 版一部对知母药材含量测定项
下筱葵皂昔水解加热方式描述为 “ 置水浴上用蒸气
缓慢回流 l h ” ,中国药典 20 5 版一部征求意见稿改
为“ 置水浴中回流 Z h ” ,最终定稿又改为 “ 加热回流
Z h
” , 由本实验结果可知应是 20 0 年版中国药典一
部对菠莫皂昔水解加热方式的描述较为准确 。
5
.
4 消渴清颗粒水溶性较好 ,且菠莫皂昔元在酸
性乙醇中不稳定易受到损失 , 而在酸水中则相对比
较稳定川 ,故将消渴清颗粒粉末用酸水溶解后直接
水解 ,将菠葵皂昔的提取及酸水解合并为一步 ,减少
了实验步骤和时间 ,节约了实验成本 。 实验结果表
明该方法简便 、专属 、可靠 。
5
.
5 水解时间的选择 通过实验比较了不同的水
解时间 ( 0 . 5 , 1 , 1 . 5 , 2 , 2 . 5 h) 对实验结果的影响 ,结
果表明水解 l . s h 已基本将菠葵皂昔水解完全 , 故
选择 1 . 5 h 为水解时间 。
5
.
6 水解酸度的选择 通过实验比较了不同的水
解酸度 ( or % , 20 % , 30 % , 4 0% ) 对实验结果 的影
响 ,结果表明酸度为 20 % 时水解效果最好 , 故选择
20 % 为水解酸度 。
5
.
7 伍庆采用苯 、 酸水二相酸水解方法测定知母
药材中菠莫皂昔元含量 , 结果较好 [ s 〕 。 苯毒性较
大 ,本实验曾尝试以氯仿 、 酸水二相酸水解菠莫皂
昔 ,氯仿沸点为 61 . 2 ℃ , 回流温度较低 ,菠葵皂普水
解不完全 ,提高水浴温度则导致氯仿层沸腾过于剧
烈 ;通过提高水解酸度提高了菠葵皂昔的水解程度 ,
但因酸解条件剧烈 ,菠葵皂昔元含量测定结果重复
性不好 ( R SD 二 6% ) 。
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(本文于 2X() 5 年 12 月 12 日收到 )