全 文 ：麻栗坡兜兰 ISSＲ引物筛选及反应体系的优化
高丽霞 (河池学院化学与生物工程学院，广西宜州 546300)
摘要 ［目的］对麻栗坡兜兰 ISSＲ引物进行筛选，并建立一个稳定性高、重现性好、适合麻栗坡兜兰 ISSＲ反应体系。［方法］以麻栗坡
兜兰 DNA为模板，分别对 Mg2 +、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等 PCＲ反应成分进行优化，并用优化的体系对 25 条兰科中报道的
ISSＲ引物进行筛选。［结果］确立了麻栗坡兜兰最适 ISSＲ － PCＲ 反应体系:在 25 μl 反应体系中，Mg2 + 2 mmol /L、引物 0． 4 mmol /L、
dNTP 0． 20 mmol /L、DNA 1． 5 μl、Taq酶 1． 4 U。利用该体系，共筛选得到 10条 ISSＲ引物用于麻栗坡兜兰分析，并对 21份麻栗坡兜兰材
料进行扩增，获得了较好的扩增效果。［结论］该体系稳定可靠，为今后 ISSＲ标记在兜兰属植物的种质鉴定、遗传多样性等方面的广泛
应用奠定了重要基础。
关键词 麻栗坡兜兰; ISSＲ － PCＲ;体系优化
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2014) 20 －06553 －03
Selection of ISSＲ Primers and Optimization of Ｒeaction System in Paphiopedilum malipoense
GAO Li-xia ( Chemical and Biological Engineering college，Hechi University，Yizhou，Guangxi 546300)
Abstract ［Objective］ ISSＲ primers were selected and PCＲ system was optimized in order to establish ISSＲ reaction system with high stabili-
ty and good reproducibility． ［Method］Using single-factor test，Mg2 +，dNTP，primer concentration，Taq DNA polymerase and DNA dosage
were optimized． Using the optimized system，primers were screened out of 25 primers． ［Ｒesult］The optimized reaction system was as the fol-
lowing: in a 25 μl reaction system，10 × PCＲ Buffer 2． 5 μl，Mg2 + 2 mmol /L，the primers 0． 4 mmol /L，dNTP 0． 20 mmol /L，DNA 1． 5 μl
and Taq enzyme 1． 8 U． Using this system，10 primers were screened and 21 materials of Paphiopedilum malipoense were amplified． The pro-
file was clear and the polymorphism was high．［Conclusion］The system was stable and reliable，and laid an important foundation for wide ap-
plication of the ISSＲ marker in the pocket orchid genus plant identification，genetic diversity for the future．
Key words Paphiopedilum malipoense; ISSＲ-PCＲ; System optimization
基金项目 河池学院人才引进科研启动项目( 2008QB-N001) 。
作者简介 高丽霞( 1980 － ) ，女，山东泰安人，副教授，从事植物种质资
源创新研究工作。
收稿日期 2014-06-11
麻栗坡兜兰(Paphiopedilum malipoense)属兰科(Orchi-
daceae)兜兰属(Paphiopedilum)地生兰或半附生兰。麻栗坡
兜兰是兜兰属现存种类中最原始的类型，代表了由杓兰属向
兜兰属过渡的种类［1］，主要分布于云南东南部、广西西部、贵
州西北部，以及越南北部。一方面由于近年来的过渡采摘，
另一方面由于其自身的生物学原因，它没有像硬叶兜兰和杏
黄兜兰那样延长的地下根状茎［2］，是当前最需要保护的濒临
物种之一。
ISSＲ分子标记技术已在兰科中得以广泛应用。赵谦
等［3］用 14条 ISSＲ引物分析了 14个蝴蝶兰品种间的遗传关
系，其多态百分比为 82%，表明蝴蝶兰品种间存在丰富的遗
传多样性，并构建了 ISSＲ遗传图谱;吴振兴等［4］用 15 条 IS-
SＲ引物对兰属植物进行遗传多样性分析，其多态百分比为
27． 2%，并构建了 ISSＲ 遗传图谱;孙小琴等［5］用 12 条 ISSＲ
引物对江西省寒兰进行了遗传多样性分析，其多态百分比为
78． 9%;马佳梅等［6］用 12条 ISSＲ引物对西双版纳地区流苏
石斛进行遗传多样性分析，其多态百分比为 89． 74%，表明流
苏石斛品种间存在丰富的遗传多样性;严华等［7］采用 ISSＲ
分子标记技术对 38 种国兰亲缘关系进行分析;沈颖等［8］用
ISSＲ分子标记技术对 9 种石斛属植物进行品种鉴定分析。
但在兜兰属的研究中，仅见陈业等［9］对兜兰属亲缘关系的分
析，从 50条引物中，仅筛选得到 6 条，对分析遗传多样性远
远不够。
笔者以我国濒临物种麻栗坡兜兰为材料，对影响 ISSＲ
扩增效果的 dNTP、Mg2 +、引物、Taq酶以及模板 DNA进行单
因子优化试验，建立适用于麻栗坡兜兰的 ISSＲ-PCＲ 反应体
系，利用该体系对从兰科中检索到的 25条 ISSＲ引物进行筛
选，为进一步研究麻栗坡兜兰遗传多样性奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 供试材料为麻栗坡兜兰，采自木论国家级
自然保护区的自然居群。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 DNA的提取。取新鲜带叶兜兰的嫩叶，经研磨后，
按 MUＲＲAY等［10］的 CTAB法提取叶片总 DNA［10］。
1． 2． 2 ISSＲ分析。ISSＲ引物由上海生工生物工程有限公
司合成，参照高丽等［11］，吴振兴等［4］，严华等［7］以及沈颖
等［8］的研究结果选取其中的 25 条引物进行试验，编号分别
为 UBC807，UBC811，UBC812，UBC814，UBC817，UBC818，
UBC820，UBC822，UBC825，UBC827，UBC829，UBC834，
UBC835，UBC836，UBC840，UBC841，UBC855，UBC860，
UBC862，UBC864，UBC867，UBC868，UBC880，UBC881，
UBC895。
设定原始反应体系为:25 μl反应体系中 10 × PCＲ Buffer
2． 5 μl、dNTP 0． 2 mmol /L、Mg2 + 3 mmol /L、引物 0． 4 mmol /L、
Taq酶 1． 4 U、模板 DNA 30 ng。PCＲ反应程序为:94 ℃预变
性 5 min，94 ℃变性30 s，49 ℃复性40 s，72 ℃延伸90 s，40个
循环。最后 72 ℃延伸 7 min，然后置于 4 ℃保存。扩增产物
用 8%聚丙烯酰胺凝胶，170 V电压电泳检测，选取扩增条带
清晰、多态性好的引物进行下一步优化试验。
1． 2． 3 ISSＲ-PCＲ试验设计。采用单因素试验设计方法，对
ISSＲ反应体系中的Mg2 +、引物、Taq酶、模板 DNA、dNTP 5种
主要成分进行分析(25 μl 反应体系中各成分优化设计方案
见表 1)。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(20) :6553 － 6555 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.20.010
表 1 单因素优化设计方案
水平
因素
引物
mmol /L
dNTP
mmol /L
Mg2 +
mmol /L
模板 DNA
ng
Taq酶
U
1 0． 1 0． 05 1． 0 10 0． 8
2 0． 2 0． 10 1． 5 20 1． 0
3 0． 3 0． 15 2． 0 30 1． 2
4 0． 4 0． 20 2． 5 40 1． 4
5 0． 5 0． 25 3． 0 50 1． 6
6 0． 6 0． 30 3． 5 60 1． 8
7 0． 7 0． 35 4． 0 70 2． 0
8 0． 8 0． 40 4． 5 80 2． 2
1． 2． 4 引物筛选。取麻栗坡兜兰 DNA样品用优化后的反
应体系对 25条引物进行筛选，选出扩增条带清晰、多态性好
的引物。
1． 2． 5 ISSＲ-PCＲ体系的验证。利用优化后的最佳反应体
系，用筛选的引物对 21 份麻栗坡兜兰进行 ISSＲ-PCＲ 扩增，
检测 ISSＲ-PCＲ扩增效率及体系稳定性。
2 结果与分析
2． 1 初次引物筛选结果 将 25条引物进行初步筛选，引物
UBC840扩增条带较理想，因此选择 UBC840 进行 ISSＲ-PCＲ
反应体系的优化。
2． 2 各单因素对扩增结果的影响
2． 2． 1 引物浓度。由图 1 可知，引物浓度在 0． 3、0． 4、0． 5、
0． 6、0． 7、0． 8 mmol /L时都有扩增，浓度为 0． 1和 0． 2 mmol /L
时没有扩增条带。引物浓度过低时 PCＲ产率会大大降低，甚
至不能扩增;引物浓度过高时 PCＲ所扩增的条带变得模糊，
还会产生新的位点，非特异性扩增增加。因此，引物浓度为
0． 3 mmol /L时扩增效果最好。
注:1 ～ 8 是引物浓度分别为 0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7、0． 8
mmol /L;9 ～ 16 是 dNTP 浓度分别为 0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、
0． 25、0． 30、0． 35、0． 40 mmol /L。
图 1 不同引物浓度、dNTP浓度的 ISSＲ-PCＲ扩增结果
2． 2． 2 dNTP浓度。dNTP是 PCＲ 扩增反应中磷酸基团的
主要原料，其浓度对 PCＲ反应具有至关重要的影响，对 dNTP
8个不同浓度进行了扩增，结果见图 1。由图 1 可知，8 个浓
度均能扩增条带，当 dNTP浓度为 0． 15 mmol /L时扩增条带
最清晰，效果最好。
2． 2． 3 Mg2 +浓度。Mg2 +与 dNTP以及模板 DNA 结合形成
复合体，才能被 Taq酶识别，其浓度影响 Taq酶的活性、精度
及产物的特异性，还可影响模板与 PCＲ产物的解链温度，引
物二聚体的形成等。由图 2 可知，8 个不同浓度的 Mg2 +，除
浓度 1． 0 mmol /L没有扩增条带外，其他浓度均能扩增条带。
浓度为 1． 5 mmol /L 时只有 2 条扩增条带，浓度高于 2． 0
mmol /L时，大片段的非特异性扩增带增多，因此确定 2． 0
mmol /L为 Mg2 +的最佳浓度。
注:1 ～8 Mg2 +浓度分别为 1、1． 5、2、2． 5、3、3． 5、4、4． 5 mmol /L。
图 2 不同Mg2 +浓度的 ISSＲ-PCＲ扩增结果
2． 2． 4 模板 DNA。模板 DNA也是影响 ISSＲ-PCＲ反应的因
素之一，模板 DNA的用量分别为 10、20、30、40、50、60、70、80
ng，其每个梯度都有扩增，结果见图 3。由图 3 可知，当 DNA
用量为 30 ng时扩增效果较好。
注:1 ～8是 Taq 酶用量分别为 0． 8、1． 0、1． 2、1． 4、1． 6、1． 8、2． 0、
2． 2U;9 ～ 16 是 DNA 用量分别为 10、20、30、40、50、60、70、80
ng。
图 3 不同 Taq酶用量、DNA用量的 ISSＲ-PCＲ扩增结果
2． 2． 5 TaqDNA聚合酶。Taq 酶通过降低反应的活化能加
快反应速度，不改变反应的平衡点。其用量在 PCＲ 反应中
也是一个重要的因素，用量过低则不能扩增，用量过高又会
产生非特异性扩增且增加成本。试验设计了 0． 8、1． 0、1． 2、
1． 4、1． 6、1． 8、2． 0、2． 2 U 8 个梯度，扩增结果见图 3。由图 3
可知，在所设梯度中，扩增差异不显著，因此选 0． 8 U。
2． 3 麻栗坡兜兰 ISSＲ-PCＲ最佳反应体系 最终确定木论
麻栗坡兜兰 ISSＲ-PCＲ的最佳反应体系为:25 μl体系中含有
引物 0． 3 mmom/L、dNTP0． 15 mmol /L、Mg2 + 2 mmol /L、模板
DNA 30 ng、Taq酶 0． 8 U、10 × PCＲ Buffer 2． 5 μl。
2． 4 引物筛选结果 按优化后的 ISSＲ-PCＲ最佳反应体系
对引物进行筛选，结果从 25条引物中筛选出 10条有扩增条带
的引物，其中，引物UBC834、UBC835、UBC840扩增条带最清晰，
重复性最好;其次是引物 UBC812、UBC822、UBC841、UBC868、
UBC880、UBC881;引物 UBC855只有微弱的扩增(图 4)。
4556 安徽农业科学 2014 年
注:1 ～ 25 分别为引物 UBC895、UBC881、UBC880、UBC868、UBC867、UBC864、UBC862、UBC860、UBC855、UBC841、UBC840、UBC836、UBC835、
UBC834、UBC829、UBC827、UBC825、UBC822、UBC820、UBC818、UBC917、UBC814、UBC812、UBC811、UBC807。
图 4 25条 ISSＲ引物的 PCＲ结果
2． 5 优化体系的验证 利用优化出来的体系和筛选出来
的引物用于木论麻栗坡兜兰 ISSＲ-PCＲ 反应，验证该体系的
实用性。选取 UBC840 和随机选取 21 份材料进行 PCＲ 扩
增，扩增结果见图 5。由图 5可知，该体系在各材料中具有较
清晰的条带，且具有丰富的多态性。
图 5 引物 UBC840在优化后的体系下对 21份木论麻栗坡兜兰 DNA样品的扩增结果
3 结论与讨论
DNA模板用量一般对扩增结果影响不大，试验中，ISSＲ
反应对模板 DNA的用量要求不是特别严格，每个反应梯度
都有较好的扩增结果;而适合的引物浓度对 PCＲ 产率及多
态性扩增都有关键性的影响，该试验过低的引物浓度(0． 1、
0． 2 mmol /L)没有得到扩增产物，过高的引物浓度(0． 7、0． 8
mmol /L)扩增产物不清晰，效率低;Mg2 +浓度影响反应的特
异性和扩增效率，其浓度对反应影响较大，该研究也证明了
这一点，当浓度低于 2 mmol /L 时，几乎没有扩增结果;相对
于反应体系中其他成分而言，Taq DNA聚合酶的用量直接决
定试验的稳定性与重现性，高浓度 Taq DNA聚合酶增加成本
和非特异性扩增产物，低浓度的酶可能使催化能力不够强而
影响产物的合成效率，因此选择高质量的酶是试验开展的首
要任务，其合适的用量也是关键。
该试验通过对影响 ISSＲ-PCＲ反应的多个因素的系列调
整与优化，建立了适合麻栗坡兜兰 ISSＲ分析的 PCＲ反应体
系，并将这一体系用于 21份木论麻栗坡兜兰进行体系验证，
结果证明该体系稳定可靠，该体系的成功建立为今后 ISSＲ
标记在兜兰属植物的种植鉴定、遗传多样性等方面的广泛应
用奠定了重要基础。
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