全 文 ：第 28卷 第 2期 暨南大学学报(医学版) Vol.28　No.2
2007年 4月 JournalofJinanUniversity(MedicineEdition) Apr.　2007
　
[收稿日期 ] 　2006-07-21
[作者简介 ] 　任先达(1946-),男 ,教授 ,硕士生导师 ,研究方向:肿瘤药理学 , Tel:020-38896810, E-mail:renxd520@ 126.com
刺果紫玉盘素 J诱导 Lovo细胞凋亡的作用
任先达 , 　杨政红 , 　周光雄 , 　叶开和 , 　吕艳青
(暨南大学药学院 , 广东 广州 510632)
[摘　要 ] 　目的:观察刺果紫玉盘素 J(CalamistrinJ, Cal-J)诱导人结肠癌 Lovo细胞凋亡的作用 , 并探讨其诱导细
胞凋亡的可能机制。方法:Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态变化 , 流式细胞仪(FCM)分
析细胞 DNA含量变化及计算凋亡率。荧光酶标仪检测 DCFH-DA荧光探针标记的活性氧(ROS), 以 DiOC6(3)标
记 、流式细胞仪测定细胞线粒体膜电位(Δψm)的改变 。结果:Cal-J作用 48h后 , 荧光显微镜下可见细胞核固缩 , 染
色质凝聚等典型凋亡形态学特征。 FCM检测可见 Lovo细胞凋亡率明显增加, 且具有时间 、剂量的双重依赖性。 Cal-J
处理 Lovo细胞 12 h后, 可剂量依赖性地增高胞内 ROS水平 , Cal-J100 μg· mL-1作用于 Lovo细胞 , 可时间依赖性降
低 Δψm。结论:Cal-J具有诱导 Lovo细胞凋亡的作用, 该作用呈一定的剂量和时间依赖性 ,其机制与提高细胞内 ROS
水平和降低线粒体膜电位有关。
[关键词 ] 　刺果紫玉盘素 J;　结肠癌;　凋亡;　活性氧;　线粒体膜电位
[中图分类号 ] 　R963, R979.1　　[文献标识码 ] 　A　　[文章编号 ] 　1000-9965(2007)02-0142-05
TheeffectofCalamistrinJoninducingLovocelsapoptosis
RENXian-da, 　YANGZheng-hong, 　ZHOUGuang-xiong, 　YEKai-he, 　L Yan-qing
(PharmacyCollege, JinanUniversity, Guangzhou510632, China)
[ Abstract] 　Aim:ToobservetheapoptosisinducedbyCalamistrinJonhumancoloncarcinomaLovo
cels, andtoexploreitsmechanism.Methods:Observethemorphologicalchangesoftheapoptosiscels
byfluorescencemicroscopewithHoechst33258 staining, measuretheapoptosisrateofLovocelsbyflow
cytometry(FCM).ROSlevelsincelslabeledbyDCFH-DAwereassayedbyspectrofluorometerandthe
changeofΔψmwasanalyzedbyFCMwithDiOC6(3)staining.Results:LovocelstreatedbyCalamistrin
Jcouldbeobservedtohavetypicalymorphologicalchangesthroughfluorescencemicroscope, including
celshrinkagewithacondensedcytoplasm, chromatincondensation, etc.ItwasmeasuredbyFCMthat
CalamistrinJinducedapoptosisinatime-anddose-independentmanner.ThecelularROSlevelofLovo
celsshowedasignificantincreaseafterexposedtoCalamistrinJfor12hinadose-independentmanner.
ItwasobservedthatΔψmbegantodecreaseafterexposedtoCalamistrinJ100 μg· mL-1 , thelosof
Δψmbecomemoreremarkableastimegoeson.Conclusion:CalamistrinJsignificantlyinducedapoptosis
ofLovocels, whichmaybeduetoitsincreaseofthecelularROSlevelandthedecreaseofΔψm.
[ Keywords] 　CalamistrinJ;　coloncarcinoma;　apoptosis;　reactiveoxygenspecies;　mitochondrial
membranepotential
　　1982年 Jolad[ 1]等从番荔枝科紫玉盘属植物
Uvariaaccuminata中分离出一种抗癌活性很强的内
酯 Uvaricin,由于结构独特 ,抗肿瘤机制为作用于线
粒体干扰能量代谢 ,而且无致突变性 ,引起人们的极
大兴趣 。现已发现的这类化合物有近 400种 ,它们
都具有多种生物学活性。我们从番荔枝科紫玉盘属
刺果紫玉盘(UvariacalamistrataHance)植物根中提
取到一种新的番荔枝内酯化合物刺果紫玉盘素 J
(CalamistrinJ, Cal-J),为白色无定形粉末 ,溶解于无
水乙醇 、丙酮 、二甲基亚枫(DMSO)等 , 分子式为
C37H66O7 ,分子量 622。前期研究已发现 Cal-J对体
外培养的多种人类肿瘤细胞具有不同程度的抑制增
殖作用 ,其中对人结肠癌 Lovo细胞抑制作用最强
(待发表)。本文观察了 Cal-J的诱导 Lovo细胞凋
亡作用 ,并对该作用的可能机制进行初步探讨 。
1　材料与方法
1.1　实验材料及主要试剂
人结肠癌 Lovo细胞由我校中药与天然药物研
究所实验室提供 ,胰蛋白酶 (Trypsin1:250)为美国
Difco公司产品 , RPMI1640培养基及 EDTA为美国
GIBCO公司产品 , PI、Hoechest33258、RNase、MTT、2,
7-二氯荧光素二乙酸酯(2′, 7′-Dicholoroflurescindi-
acetae, DCFH-DA)和碘化二己基恶碳菁(3, 3 -Di-
hexyloxacarbocyanineiodide, DiOC6 (3))均为美国
SIGMA公司产品 ,活性氧检测试剂盒购自碧云天生
物公司 。刺果紫玉盘素 J(CalamistrinJ, Cal-J)为本
实验室制备 ,经高效液相色谱(HPLC)测定 ,各批产
物纯度均在 95%以上 ,用 DMSO溶解配制为 100
mg·mL-1储备液备用。试验前用 RPMI-1640培养
基稀释为 1 000、500、250、125、62.5 μg· mL-1质量
浓度 ,超声波混匀助溶后备用 。加入细胞后其最终
药物质量浓度为 100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1 ,
并调节 DMSO终质量分数为 0.1%。
1.2　细胞培养
取 Lovo细胞 ,按密度为 3 ×105 /mL接种 ,细胞
置于 RPMI-1640培养液(含体积分数 10%已灭活的
小牛血清 、青霉素 1 ×105 IU· L-1、链霉素 100
mg·L-1)中 , 37 ℃、体积分数为 5 %的 CO2饱和湿
度培养箱中培养 。间日换液 , 3 ～ 4 d传代 ,取指数
生长期细胞用于实验 。
1.3　Hoechst33258荧光染色
用 24孔板培养细胞 ,预先将小盖玻片置于每个
孔板底部 ,制作细胞爬片 。分别以空白溶媒(质量
分数 0.1%DMSO)和 Cal-J12.5、25、50μg· mL-1处
理 48h后 ,以冷 PBS洗 2次 ,体积分数为 4%多聚
甲醛固定 10min,去除固定液 ,清洗 2次 ,晾干。加
Hoechst33258(10μg· mL-1)0.5 mL染色 10 min,
蒸馏水冲洗 ,晾干。以紫外光(340 nm)激发 ,用荧
光显微镜观察并拍照。
结果判断:正常细胞的细胞核呈现弥散均匀荧
光 ,出现细胞凋亡时 ,细胞核或细胞质内可见浓染致
密的颗粒块状荧光 ,甚至可见 DNA荧光碎片 。
1.4　流式细胞仪检测凋亡率
将对数生长期的 Lovo细胞接种于 18个 25 cm2
培养瓶孵育 ,细胞完全贴壁后(4h以上),随机分为
6组 ,每组 3瓶 ,分别以空白溶媒(质量分数 0.1%
DMSO)和 Cal-J6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1处
理 48 h后 , 加质量分数 0.25%的胰蛋白酶消化 ,
3 000r/min离心 5min, PBS洗 2次。以 4 ℃预冷的
体积分数为 70%乙醇重悬细胞 ,固定备检 。检测前
离心固定细胞悬液 , PBS洗 2次 ,取单细胞样品(1×
10
6 · mL-1)200 μL, 加等容积的 RNase溶液 (10
μg· mL-1),置 37 ℃水浴摇床 30 min。将细胞过
滤 ,去除聚积成团的细胞 , 加 PI染液 (100 μg·
mL-1)100μL置 4 ℃ 30 min,上机检测。用 FACS-
Can(BectonDickinsonImmunocytometrySystem)软
件分析 DNA,所测数据经 Lysis软件收集 、储存和分
析。以凋亡指数 APO(%)表示细胞凋亡百分率 。
APO(%)=凋亡细胞数 /所测细胞数 ×100%
另取对数生长期的 Lovo细胞接种于 18个
25 cm2细胞培养瓶 ,随机分为 6组 ,分别为 Cal-J100
μg· mL-1给药 0 h(空白对照)、 12、 24、 36、 48和
72 h组 ,每组按预定的时间结束培养 ,其余处理及结
果分析同上。
1.5　活性氧的检测
胞内 ROS水平采用 DCFH-DA荧光性探针来检
测[ 2] 。对数生长期的 Lovo细胞以密度 2×105接种
于 6孔板中 , 培养 24 h后 ,分别加入 Cal-J6.25、
12.5、25、50、100 μg· mL-1作用 12 h,去培养液 ,每
孔加 DCFH-DA(10 μmol· L-1)1 mL, 37 ℃孵育
20 min,用无血清培养液清洗 3次 ,以充分去除未进
入细胞内的 DCFH-DA,用荧光酶标仪检测荧光强
度 ,激发波长 488 nm,发射波长 525 nm。
1.6　线粒体膜电位的检测
采用 DiOC6(3)通过流式细胞仪检测 Cal-J诱导
143　第 2期 任先达 , 等:刺果紫玉盘素 J诱导 Lovo细胞凋亡的作用
的 Lovo细胞线粒体膜电位的变化情况 [ 3] 。对数生
长期的 Lovo细胞以每瓶 1×106接种于 50mL培养
瓶中 ,培养 24h后 ,加入 Cal-J100μg·mL-1分别作
用 0、12、24、36、48h,收集贴壁及已悬浮的细胞 ,用
PBS洗 2次 , 3 000r/min离心 5min,弃上清 ,重悬在
含 0.5%新生牛血清的 PBS中 ,加入 DiOC6(3)荧光
探针 ,使终浓度为 40 nmol· L-1 ,在 37 ℃反应 30
min,应用流式细胞仪分析线粒体膜电位变化情况。
1.7　数据处理
实验数据用均数 ±标准差( x±s)表示 ,所有数
据均采用 SPSS11.0软件进行处理 。多组样本数据
用单因素方差分析 ,两组样本均数之间比较用组间 t
检验 , P<0.05被认为有显著性差异。
2　结果
2.1　对 Lovo细胞形态学的影响
染色质凝聚是凋亡细胞典型的细胞形态学变化
之一。 Cal-J作用 48 h后的 Lovo细胞 , 经 Hoe-
chest33258染色后 , 荧光显微镜下可见 ,细胞核固
缩 ,染色质凝聚 ,染色加深 ,细胞核或细胞质内出现
浓染致密的块状或颗粒状荧光 。(图 1)
　A:对照组　　　　　　　　　　B:Cal-J12.5μg· mL-1处理组
C:Cal-J25μg· mL-1处理组　 D:Cal-J50 μg· mL-1处理组
细胞经Hoechest33258染色后 ,在荧光显微镜下观察(×200)
图 1　不同质量浓度 Cal-J作用 48h后
Lovo细胞核的形态学变化
2.2　对 Lovo细胞凋亡率的影响
流式细胞仪分析显示 , Cal-J诱导 Lovo细胞凋
亡具有时间 、剂量双重依赖性 。不同剂量 Cal-J作
用于 Lovo细胞 ,在 6.25 μg· mL-1剂量下 , Lovo细
胞即开始凋亡 ,在 DNA直方图上出现典型的凋亡
峰 ,随着剂量的增加 , 凋亡率不断增高 , 在剂量为
100 μg· mL-1时 , 凋亡率达 54.7%, 与对照组(0
μg· mL-1)相比有显著差异(P<0.01)(表 1)。同
一剂量 Cal-J(100 μg· mL-1)作用于 Lovo细胞不同
时间 ,在作用 6 h后即开始出现凋亡 ,随着时间的增
加 ,凋亡率不断增高 , 72 h达 76.5%(表 2)。
2.3　对 Lovo细胞 ROS的影响
用 Cal-J处理 12h后的细胞 ,在 6.25μg·mL-1
时胞内的 ROS水平即有明显增加 ,且随 Cal-J质量
浓度增大逐渐上升 ,表现为 DCF的荧光强度随 Cal-J
质量浓度增大逐渐增强(表 1)。
2.4　对 Lovo细胞线粒体膜电位的影响
Cal-J100 μg· mL-1作用于 Lovo细胞 12, 24,
36, 48h后 ,线粒体膜电位降低 ,表现为峰值左移 ,
平均荧光强度减少 ,且随药物作用时间的增加变异
逐渐明显(表 2)。
表 1　不同质量浓度 Cal-J对 Lovo细胞凋亡和
ROS水平( x±s, n=3)的影响
ρ(Cal·J)/μg· mL-1 细胞凋亡率 1)/% DCF荧光强度 2)/×105
0 2.7±0.5 2.65±0.13
6.25 6.3±1.33) 3.79±0.143)
12.5 19.6±2.83) 3.90±0.093)
25 30.8±2.13) 4.01±0.143)
50 40.3±1.93) 4.29±0.213)
100 54.1±1.63) 4.71±0.113)
　1)药物作用 48 h, 2)药物作用 12 h, 3)与对照组(0剂量)比较
P<0.01
表 2　Cal-J100 μg· mL-1作用不同时间对 Lovo
细胞凋亡和线粒体膜电位( x±s, n=3)的影响
　　作用时间 /h　细胞凋亡率 /% FI(DiOC6(3))平均荧光强度　
　0 　2.0±0.3 47.3±0.8
12 11.7±1.01) 38.9±0.81)
24 24.3±1.71) 29.9±1.31)
36 39.5±4.41) 20.0±1.51)
48 53.7±1.11) 10.6±0.11)
72 77.2±7.31)
　1)与对照组(0时刻)比较 P<0.01
3　讨论
近年来发现大多数的促癌剂都是凋亡的抑制
剂 ,提示凋亡在肿瘤演进中的重要作用 。周宁宁
等[ 4]通过研究发现番荔枝内酯 squamocin具有诱导
白血病 HL-60细胞凋亡的作用 。程冠军等 [ 5] 发现
144 暨南大学学报(医学版) 第 28卷
阿蒂莫耶番荔枝内酯具有诱导人乳腺癌细胞凋亡的
作用。在前期研究已证明 Cal-J对体外培养的人结
肠癌 Lovo细胞增殖有较强抑制作用基础上 ,我们首
先采用 Hoechst33258荧光染色法 , 检测细胞的凋
亡 ,在荧光显微镜下观察可见经 Cal-J处理后的 Lo-
vo细胞 ,核内出现致密浓染的块状及颗粒状荧光 ,
而对照组细胞则无此表现 ,从形态学上提示 Cal-J
对 Lovo细胞具有诱导凋亡的作用 。同时我们又采
用碘化丙锭(propidineiodide, PI)染色 ,通过流式细
胞仪分析细胞凋亡情况 ,实验结果表明 Cal-J对 Lo-
vo细胞有较明显的促凋亡作用 ,且呈剂量和时间双
重依赖性 , Cal-J100 μg·mL-1作用 72 h后 Lovo细
胞凋亡率高达 77.2 ±7.3%。以上结果可以证明 ,
促进肿瘤细胞凋亡是 Cal-J抗肿瘤作用的重要机
制 。
既往有研究认为:番荔枝的主要作用靶点是肿
瘤细胞的线粒体 ,使细胞 ATP产生迅速减少 [ 6] 。而
经典的凋亡途径是线粒体释放细胞色素 C,细胞色
素 C与 Aparf-1结合 ,在 ATP的存在下激活 caspase-
9, caspase-9激活 caspase-3, caspase-3是凋亡的执行
者 ,它激活 DFF因子 ,使 DNA片断化 [ 7] 。可见 , ATP
的耗竭并不至于使细胞发生凋亡 ,而应是抑制凋亡
发生。有研究 [ 8]发现 , PARP的激活可耗竭 ATP,导
致细胞发生坏死 ,而非凋亡 。由此推断番荔枝内酯
诱导凋亡的作用机制可能与 ATP的耗竭无关 。有
报道番荔枝内酯在 G1期与肿瘤细胞作用 ,诱导 Bax
表达 ,增强 caspase-3的活性 ,引起肿瘤细胞凋亡 [ 9] 。
另有报道番荔枝内酯通过细胞内 cAMP和 cGMP水
平的降低而诱导了凋亡 [ 10] 。有关番荔枝内酯诱导
凋亡作用及其机制目前还不清楚 ,仍需进一步研究 。
当细胞受到物理 、化学及生物因素等刺激时 ,通
过细胞生物膜上的 NADPH氧化酶系统的作用产生
大量的 ROS。大量的报道都表明细胞内产生的
ROS与细胞凋亡有着密切的关系 ,在介导细胞凋亡
的过程中 ROS充当着第二信使的作用 ,高浓度的
ROS可破坏大分子蛋白 、脂质 、DNA等 ,造成生物体
功能的损坏 ,从而引起细胞凋亡。胞内 ROS水平可
用 DCFH-DA荧光性探针来检测[ 2] , DCFH-DA本身
无荧光 ,可以自由穿过细胞膜 ,进入细胞后可以被细
胞内的酯酶水解成 DCFH。而 DCFH不能通透细胞
膜 ,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的
ROS可以氧化无荧光的 DCFH,转变为强荧光物质
DCF(2, 7-二氯荧光素),因此可通过 DCF的荧光强
度来反映细胞内 ROS的含量。本实验通过对细胞
内 ROS水平的检测发现 ,由 Cal-J诱导的 Lovo细胞
凋亡中 ,药物作用 12 h后在 Lovo细胞内 ROS水平
即有明显增加 , 证实 Cal-J具有促进 Lovo细胞内
ROS增加的作用 。
线粒体在细胞凋亡过程中起着枢纽作用 ,多种
细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡 ,
通过 PT孔的开放 ,引起线粒体跨膜电位(Δψm)的
下降 ,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生
的事件 ,它发生在细胞核凋亡特征 (染色质浓缩 、
DNA断裂)出现之前 ,一旦线粒体崩溃 ,则细胞凋亡
不可逆转 [ 11] 。
线粒体跨膜电位的存在 ,使一些亲脂性阳离子
荧光染料可结合到线粒体基质 ,其荧光的增强或减
弱可反映线粒体内膜电负性的增高或降低 。DiOC6
(3)是一种亲脂性荧光染料 ,可借助线粒体的负膜
电位进入线粒体并集中于其骨架中 ,因此可应用 Di-
OC6(3)通过流式细胞仪检测 Cal-J诱导的 Lovo细
胞线粒体膜电位的变化情况 [ 3] 。我们使用 DiOC6
(3)荧光染料检测了 Cal-J作用不同时间对 Lovo细
胞线粒体跨膜电位的影响。药物作用 12 h后 , Δψm
即开始下降 ,随时间推移下降越来越明显 , 到 48 h
达最低值 ,说明在 Cal-J的作用下线粒体功能受损 ,
提示其诱导 Lovo细胞凋亡可能是由于启动了线粒
体途径。
线粒体是细胞内 ROS产生的主要部位 , 也是
ROS攻击的部位。细胞受到 ROS的攻击而发生脂
质过氧化后 ,线粒体外膜通透性增加 ,内膜电化学梯
度降低 ,导致凋亡诱导因子的释放 。线粒体外膜通
透性增加又可产生更多的 ROS, 故可形成一个正反
馈性信号扩大过程 ,导致线粒体结构和功能的紊乱 ,
线粒体外基质内流 、渗透压失衡 、细胞器肿胀 、线粒
体的内外膜依次裂解释放出 caspase激活蛋
白[ 12-13] 。本实验中 Cal-J作用后 Lovo细胞线粒体
跨膜电位下降 ,与 ROS的升高一致 ,提示 Cal-J致细
胞凋亡机制可能与两者有关 。 ROS的大量释放和
线粒体跨膜电位的降低均能引起 caspase9的释放 ,
从而激活 caspase3,后者使其底物 PARK降解 ,诱导
肿瘤细胞凋亡 [ 14] 。抗肿瘤药物如何通过 ROS介导
细胞凋亡可能因药物种类不同而异 ,且细胞内的各
种凋亡途径并不是完全独立的 , 因此 ,在本实验中
Lovo细胞内产生的 ROS究竟是引起 Δψm下降的原
因 ,还是其结果 ?它是通过何种途径来调节由 Cal-J
所诱导的凋亡 ?这些问题仍需进一步的研究 。
145　第 2期 任先达 , 等:刺果紫玉盘素 J诱导 Lovo细胞凋亡的作用
[参考文献 ]
[ 1] 　JOLADSD, HOFFMANJJ, SCHRAM KH, etal.
Uvaricin, anewantitumoragentfromUvariaaccuminata
(Annonaceae)[ J] .JOrgChem, 1982, 47(11):3151-
3153.
[ 2] 　LIPINSKIB.Rationaleforthetreatmentofcancerwith
sodiumselenite[ J] .MedHypotheses, 2005, 64(4):
806-810.
[ 3] 　FENNELLDA, COTTERFE.Stochasticmodelingof
apoptosistolerancedistributionsmeasuredbymultivariate
flowanalysisofhumanleukemiacels[ J] .Cytometry,
2000, 39(4):266-274.
[ 4] 　周宁宁 , 朱孝峰 , 李志铭 , 等.番荔枝内酯化合物
squamocin诱导白血病 HL-60细胞凋亡 [ J] .癌症 ,
2000, 19(12):1098-1100.
[ 5] 　程冠军 , 潘启超 , 朱振宇 , 等.DNA末端标记法检测
番荔枝内酯诱导人乳腺癌细胞凋亡 [ J] .中山医科大
学学报 , 1998, 19(2):109-111.
[ 6] 　LONDERSHAUSENM, LEICHTW, LIEBF, etal.Mo-
lecularmodeofactionofonannonins[ J] .Pestic-Sci,
1991, 33(3):427-438.
[ 7] 　LIUX, ZOUH, SLAUGHTERC, etal.DEF, ahet-
erodimericproteinthatfunctionsdownstreamofcaspase-3
totriggerDNAfragmentationduringapoptosis[ J] .Cell,
1997, 89(2):175-184.
[ 8] 　HAHC, SNYDERSH.Poly(ADP-ribose)polymem-
raseisamediatorofnecroticceldeathbyATPdepletion
[ J] .ProcNatlAcadSciUSA, 1999, 96(24):13978-
13982.
[ 9] 　 KUWABARAK, TAKADAM, IWATAJ, etal.Design
synthesesandmitochondrialcomplexIinhibitoryactivity
ofnovelacetogeninmimics[ J] .EurJBiochem, 2000,
267(9):2538-2546.
[ 10] CHIUHF, CHIHTT, HSIANYM, etal.Bulatacin,
apotentantitumorannonaceousacetogenin, inducesap-
optosisthroughareductionofintracellularcAMPand
cGMPlevelsinhumanheptoma2.2.15 cels[ J] .Bio-
chemPharmacol, 2003, 65(3):319-327.
[ 11] KROEMERG, ZAMZAMIN, SUSINSA.Mitochondrial
controlofapoptosis[ J] .ImmunologyToday, 1997, 18
(1):44-51.
[ 12] HIRSCHT, MARZOI, KROEMERG.Roleofthemito-
chondrialpermeabilitytransitionporeinapoptosisi[ J] .
BiosciRep, 1997, 17(1):67-76.
[ 13] ZAMZAMIN, BRENNERC, MARZOI, etal.Subcel-
lularandsubmitochondrialmodeofactionofBcl-2 like
oncoproteins[ J] .Oncogene, 1998, 16(17):2265 -
2282.
[ 14] 李艳芳.番荔枝内酯抗肿瘤作用研究进展 [ J] .中国
药理学通报 , 2004, 20(3):245-247.
[责任编辑:李　弘 ]
146 暨南大学学报(医学版) 第 28卷