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2016,45(1): 7～12.
Subtropical Plant Science


响应面法优化乌骨藤通光藤苷 G 提取工艺
王泽锋，石 玲，张 薇，许 春，张 丽，闵 勇
(红河学院，云南 蒙自 661199)

摘 要：利用响应面法对乌骨藤Marsdenia tenacissima通光藤苷G的提取工艺进行优化。以通光藤苷G提取率为指标，
在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数进行4因素3水平的Box-Behnken中心组合研
究，并运用Design Expect 8.0软件对试验参数进行分析，研究各自变量及其交互作用对通光藤苷G提取率的影响。结
果显示，通光藤苷G的最佳提取条件为：乙醇溶液浓度80%，料液比1∶20(W/V)，提取时间1.5 h，提取2次，在此条
件下，通光藤苷G提取率为0.253%。
关键词：乌骨藤；通光藤苷G；响应曲面法；高效液相色谱-蒸发光散射检测器
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2016.01.002
中图分类号：Q946.83 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2016)01-0007-06

Optimization of Extraction Process for Tenacissima G from Marsdenia by
Response Surface Methodology
WANG Ze-feng, SHI Ling, ZHANG Wei, XU Chun, ZHANG Li, MIN Yong
(Honghe University, Mengzi 661199, Yunnan China)

Abstract: The optimum extraction conditions of tenacissima G from Marsdenia tenacissima were
investigated. On the basis of single factor test, the alcohol concentration, solid-liquid ratio, extraction
duration and extraction times were selected for the four-factor, three-level Box-Behnken experimental
design. In addition, Design Expect 8.0 software was employed to analyze the test data and the
response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions. The results
suggested that optimum extraction conditions consisted of 80% ethanol as the extraction solvent, an
extraction duration of 1.5 h, a solid-liquid ratio of 1∶20(W/V) and extraction of two times. Under
these optimum conditions, the extraction yields of tenacissima G from M. tenacissima was 0.253%.
Key words: Marsdenia tenacissima; tenacissima G; response surface method; HPLC-ELSD

乌骨藤Marsdenia tenacissima，又名通光藤、通光散，系萝藦科Asclepiadaceae 植物。其性味苦、微
寒，具清热解毒、止咳平喘、散结止痛等功效，民间用于治疗癌症、支气管炎、哮喘、肺炎等病[1]。
以乌骨藤提取物为主要成分的中药抗肿瘤制剂，例如“消癌平片”、“消癌平注射液”等在临床运用
中表现出良好的效果，但其药理作用机制仍没有定论。乌骨藤含有甾体酯苷、生物碱、有机酸、多糖、
树脂及色素等多种化学成分[2]，活性研究显示，C21甾体类化合物具有较好的抗肿瘤活性[3]。因此，研
究C21甾体类化合物的提取工艺对提高乌骨藤中药制剂的质量控制水平具有较好的参考价值。本研究采
用HPLC-ELSD法对乌骨藤中C21甾体苷类化合物通光藤苷G的含量进行测定，采用响应面法优化通光藤
苷G提取条件，以确定其最佳提取工艺。
1 材料与方法
1.1 仪器
美国 Waters e2695 高效液相色谱仪，包括 2424 蒸发光散射检测器和 Empower 色谱工作站；CP224C
收稿日期：2016-02-28
基金项目：云南省科技厅应用基础研究项目(2013FZ120)；红河学院科研基金重点项目(XJ14Z02)
作者简介：王泽锋，硕士，讲师，从事天然产物研究与开发。E-mail: wangzefeng841006@163.com
注：闵勇为通讯作者。E-mail: minyong19741206@126.com
第 45 卷 ﹒8﹒
型电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)；DZF-6050MBE 真空干燥箱(常州诺基仪器有限公司)，N-1100D
型旋转蒸发仪(东京理化)，80-2 型离心沉淀器(上海手术器械厂产品)。
1.2 材料
乌骨藤采自云南省红河州屏边县新华乡，经红河学院生命科学学院田学军教授鉴定。通光藤苷 G
标准品(批号：MUST-13010402)购自北京世纪奥科生物技术有限公司。乙腈为色谱纯，其余化学试剂均
为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 材料处理 将乌骨藤放置在烘箱中60 ℃烘干，取藤茎为原料。将藤茎用粉碎机搅碎成粉末状，过
40目筛，保存备用。
1.3.2 通光藤苷G含量测定 对照品溶液制备：精密称取通光藤苷G适量，定容得质量浓度0.17 mg·mL-1。
标准曲线绘制：分别精密量取对照品溶液1、5、10、20、25 µL注入液相色谱仪，测定，分别对通
光藤苷G峰面积A和进样量X取常用对数，以lgA对lgX作图，得线性回归方程。
供试品溶液制备：精密称取乌骨藤药材 0.5 g，回流提取，提取液 5000 r·min-1 离心分离 10 min，回
收溶剂，用甲醇定容至 10 mL，经 0.45 µm 有机滤膜过滤。
色谱条件：色谱柱 Agilent ZORBAXSB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相为乙腈∶水＝45∶55；
流速 1.0 mL·min-1；进样体积 10 μL；柱温 30 ℃；等度洗脱，2424 蒸发光散射检测器，增益为 200，气
体压力 40 psi，喷雾器加热级别为冷却，漂移管温度 50 ℃。
1.3.3 不同乙醇浓度 称取样品0.5 g置于50 mL圆底烧瓶，按料液比1∶30 加入不同浓度乙醇15 mL (乙
醇浓度分别为20%、40%、60%、80%、100%)，置于电热恒温水浴锅中回流提取1.0 h，提取液5000 r·min-1
离心分离10 min，回收溶剂，甲醇溶解并定容至10 mL，样品经0.45 µm有机滤膜过滤，测定其峰面积。
每条件3个平行，计算提取率。
1.3.4 不同料液比 在试验“1.3.3”所得最佳条件下，在其他条件不变时，料液比设为1∶10、1∶15、
1∶20、1∶25、1∶30。
1.3.5 不同提取时间 在试验“1.3.3”和“1.3.4”所得最佳条件下，加入提取溶剂，置于电热恒温水浴
锅中，其他条件不变，提取时间设为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。
1.3.6 不同提取次数 在上述最佳提取条件下，提取次数设为1、2、3、4、5次。
1.3.7 响应面试验设计 根据 Box-Behnken 中心组合试验设
计原理进行 4 因素 3 水平设计，利用 Design Expert 8.0 软件
进行数据拟合优化通光藤苷 G 提取工艺。在单因素试验的
基础上，每个自变量的低、中、高试验水平，分别以-1、0、
1 进行编码，以通光藤苷 G 提取率为响应值，以乙醇浓度、
提取次数、提取时间、料液比为自变量设计分析试验(表 1)。
表 1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels in response surface
design
编码水平 因素名称 -1 0 1
乙醇浓度 A/% 70 80 90
料液比B(W/V) 1∶15 1∶20 1∶25
提取时间 C/h 1.0 1.5 2.0
提取次数 D/次 1 2 3
2 结果与分析
2.1 标准曲线测定
根据测试结果计算出通光藤苷G对照品溶液的回归方程为: lgA= 1.4675lgX + 1.1462，r= 0.9996，表
明通光藤苷G对照品溶液在线性范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.2 乙醇浓度对通光藤苷G提取率的影响
如图 1 所示，当乙醇浓度低于 80%时，通光藤苷 G 的提取率随乙醇浓度的增加而增加，随后继续
增加乙醇浓度，通光藤苷 G 提取率反而下降。根据被提取物与溶剂的相似相溶原理，溶剂浓度不一样
极性也不一样，只有在一定的极性条件下提取率才高。当乙醇浓度达 80%时，甾体苷类化合物溶出趋
于饱和，同时随着乙醇浓度的进一步升高，一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出增加，这些成分与
C21 甾体苷竞争同乙醇-水分子结合，从而导致 C21甾体苷提取率下降[6]。因此，乙醇浓度以 80%为宜。
第 1 期 王泽锋,等：响应面法优化乌骨藤通光藤苷 G 提取工艺 ﹒9﹒
2.3 料液比对通光藤苷G提取率的影响
由图1可知，随着提取溶剂用量的增加，通光藤苷G提取率呈升高趋势，但当料液比达1∶20时，继
续增加溶剂的用量，通光藤苷G提取率基本不变。这可能是因为该料液比条件下，C21甾体苷类物质已
基本溶出，继续增加溶剂用量反而促使其他杂质溶出，使得通光藤苷G提取率下降[7]。因此，选择料液
比为1∶20较合适。
2.4 提取时间对通光藤苷G提取率的影响
随着提取时间的延长，通光藤苷G提取率逐渐增大(图1)，这是由于随着时间的增加，溶解在溶剂
中的通光藤苷G越来越多。但当提取时间达1.5 h后，继续延长提取时间，通光藤苷G提取率呈缓慢下降
趋势，这可能是由于提取1.5 h时通光藤苷G已大部分溶出，继续延长提取时间有可能使C21甾体苷类物
质发生降解或者伴随其他杂质的溶出[8]。因此，提取时间选择为1.5 h。
2.5 提取次数对通光藤苷 G 提取率的影响
由图 1 可知，随着提取次数的增加，通光藤苷 G 提取率呈先升后降的趋势，当提取次数超过 2 次
后，提取率逐渐减小。这可能是提取 2 次，通光藤苷 G 已基本被提取完全，再增加提取次数，有部分
通光藤苷 G 可能出现分解。因此，选择 2 次为最佳提取次数。

2.6 响应面试验
在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数进行 4 因素 3 水平试验，
根据 Box-Benhnken 中心组合设计原理，利用响应面分析方法优化乌骨藤中通光藤苷 G 提取工艺参数，
试验设计方案和提取结果如表 2。对表 2 数据进行多元二次回归拟合，建立提取工艺参数回归模型，回
归方程为：Y＝0.250 + 4.250 × 10-3A - 2.750 × 10-3B + 7.917 × 10-3C + 0.019D - 1.250 × 10-3AB + 0.250 ×
10-3AC + 3.250 × 10-3AD - 1.500 × 10-3BC - 3.500 × 10-4BD + 7.000 × 10-3CD - 9.167 × 10-3A2 - 6.417 ×
10-3B2 - 8.167 × 10-3C2 - 0.025D2。
由表 3 可知，二次回归模型的 F 值为 17.85，P<0.0001，表明该模型达到极显著水平；失拟项是模
型中数据的变异，失拟项 P＝0.0525>0.05，说明失拟项差异不显著，试验无失拟因素存在，残差均由
随机误差引起，能充分反映实际情况，回归模型是适合的；此外，试验模型的决定系数 R2＝0.9542，
说明试验中通光藤苷 G 提取率与模型预测结果有极好的一致性，试验模型的校正系数 Radj2＝0.9007，
图 1 单因素对通光藤苷 G 提取率的影响
Fig. 1 Effects of single factor on the extraction yield of tenacissima G
0.11
0.12
0.13
0.14
0.15
0.16
0.17
0.18
20 40 60 80 100
乙醇浓度/%
提
取
率
/%
0.11
0.12
0.13
0.14
0.15
0.16
0.17
0.18
0.19
0.20
0.5 1 1.5 2 2.5
提取时间/h
提
取
率
/%
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28
1 2 3 4 5
提取次数/次
提
取
率
/%

0. 16
0. 17
0. 18
0. 19
1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30
料液比
提
取
率
/%
第 45 卷 ﹒10﹒
表明试验结果有 90.07%受试验因素影响。因此，试验结果可靠，此模型可对通光藤苷 G 提取率结果进
行分析和预测[9—10]。
表 2 Box-Benhnken 试验方案及其提取率
Table 2 Box-Behnken design with experimental results
试验号 A B C D 通光藤苷 G 提取率/%
1 0 0 1 1 0.248
2 0 1 0 -1 0.198
3 0 0 0 0 0.252
4 0 -1 0 1 0.252
5 -1 -1 0 0 0.232
6 -1 0 -1 0 0.234
7 0 1 0 1 0.239
8 0 0 1 -1 0.203
9 0 -1 -1 0 0.226
10 -1 0 0 -1 0.194
11 0 0 0 0 0.249
12 1 -1 0 0 0.245
13 -1 0 1 0 0.238
14 1 0 1 0 0.246
15 0 0 0 0 0.251
16 0 -1 1 0 0.245
17 1 0 0 -1 0.203
18 0 1 -1 0 0.228
19 -1 1 0 0 0.225
20 0 0 -1 1 0.215
21 -1 0 0 1 0.221
22 0 -1 0 -1 0.197
23 1 1 0 0 0.233
24 1 0 0 1 0.243
25 0 1 1 0 0.241
26 1 0 -1 0 0.225
27 0 0 -1 -1 0.198

回归方程各项方差分析中，F 检验可判断自变量对因变量的影响，还可看出各因素对通光藤苷 G
提取率影响的主次顺序为 D>C>A>B，即提取次数对通光藤苷 G 提取率的影响最大，其次是提取时间
和乙醇浓度，最后是料液比。由回归方程和方差分析还可知，模型中一次项 C、D 对通光藤苷 G 提取
率的影响达极显著水平；模型中交互项 CD 对通光藤苷 G 提取率的影响达显著水平；模型中二次项 A2、
C2、D2 对通光藤苷 G 提取率的影响达极显著水平，B2 对通光藤苷 G 提取率的影响达显著水平(表 3)。
表 3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of the quadratic polynomial model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性
模型 9.065×10-3 14 6.475×10-4 17.85 <0.0001 **
A 2.167×10-4 1 2.167×10-4 5.98 0.0309 *
B 9.075×10-5 1 9.075×10-5 2.50 0.1397
C 7.521×10-4 1 7.521×10-4 20.74 0.0007 **
D 4.219×10-3 1 4.219×10-3 116.33 <0.0001 **
AB 6.250×10-6 1 6.250×10-6 0.17 0.6854
AC 7.225×10-5 1 7.225×10-5 1.99 0.1835
AD 4.225×10-5 1 4.225×10-5 1.77 0.2583
BC 9.000×10-6 1 9.000×10-6 0.25 0.6274
BD 4.900×10-5 1 4.900×10-5 1.35 0.2677
CD 1.960×10-4 1 1.960×10-4 5.40 0.0384 *
A
2 4.481×10-4 1 4.481×10-4 12.36 0.0043 **
B
2 2.196×10-4 1 2.196×10-4 6.06 0.030 *
C
2 3.557×10-4 1 3.557×10-4 9.81 0.0087 **
D
2 3.378×10-3 1 3.378×10-3 93.15 <0.0001 **
残差 4.352×10-4 12 3.626×10-5
失拟项 4.305×10-4 10 4.305×10-5 18.45 0.0525 不显著
净误差 4.667×10-6 2 2.333×10-6
总和 9.500×10-3 26 R2=0.9542 Radj2=0.9007
注：“*”表示有显著影响，“**”表示有极显著影响。
第 1 期 王泽锋,等：响应面法优化乌骨藤通光藤苷 G 提取工艺 ﹒11﹒
2.7 响应面分析
通过 Box-Behnken 试验得到的多元二次回归模型作响应面图。响应面图形是响应值对各试验因素
A、B、C、D 所构成的三维空间曲面图。在其他试验因素不变的情况下，选择两个交互的因素对通光
藤苷 G 提取率的影响进行分析。根据回归方程，考察拟合响应曲面的形状，分析乙醇浓度、料液比、
提取时间、提取次数 4 个因素对通光藤苷 G 提取率的影响[7,11—12]。响应曲面越陡表明该因素对通光藤
苷 G 提取率的影响越显著；反之，响应曲面平缓则表明该因素对通光藤苷 G 提取率影响较小[13—15]。从
图 2 可以看出，在交互项对通光藤苷 G 提取率的影响中，提取时间与提取次数、乙醇浓度与提取次数
之间交互作用明显，其他因素对通光藤苷 G 提取率的影响不显著，但各因素与通光藤苷 G 提取率呈较
明显的二次抛物线关系，表明回归方程拟合性较好。

CA B
提
取
率
/%

提
取
率
/%

提
取
率
/%

乙醇浓度/% 液料比 乙醇浓度/% 提取时间/h 乙醇浓度/% 提取次数
ED F
提
取
率
/%

提
取
率
/%

提
取
率
/%

提取时间/h 液料比 液料比 提取时间/h
提取次数 提取次数

图 2 乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数对通光藤苷 G 提取率影响的响应面图
Fig. 2 Response surface plots of the yield of tenacissima G showing the effect of ethanol concentration,
liquid-material ratio, extraction duration, times of extraction
A.乙醇浓度与液料比；B.乙醇浓度与提取时间；C.乙醇浓度与提取次数；D.提取时间与液料比；E.液料比与提取次数；
F.提取时间与提取次数
2.8 最佳工艺条件
用 Design Expect 8.0 软件对二次多项式回归方程进行计算，得到乌骨藤中通光藤苷 G 提取的最佳
条件为乙醇浓度 81.50%，料液比 1∶19.50(W/V)，提取时间 1.58 h，提取次数 2.15 次，预测的提取率为
0.255%。但考虑到实际操作的局限性，将通光藤苷 G 提取的工艺条件修正为：乙醇浓度 80%，料液比
1∶20，提取时间 1.5 h，提取 2 次。在此条件下得到通光藤苷 G 实际提取率为 0.253%，与理论预测值
接近，表明建立的数学模型对乌骨藤通光藤苷 G 的提取工艺具有实用价值。
3 结论
传统的数理统计学方法一般采用正交试验设计，不能在进行试验的整个区域上找到影响因素和响
应值之间明确的函数表达式，并且无法找出试验中因素与影响值的最佳组合条件。响应面分析法能有
效避免正交设计只能处理离散的水平值的缺点[16]。本文在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对
乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数 4个因素进行优化，由Design-Expert 8.0软件进行Box-Benhnken
中心组合设计分析，对乌骨藤通光藤苷 G 提取工艺条件进行了有效的优化，并得出最佳的工艺参数。
第 45 卷 ﹒12﹒
结果表明，数据模型拟合度较高，结果可靠。此外还可分析出各因素对通光藤苷 G 提取率影响的主次
顺序为提取次数 D＞提取时间 C＞乙醇浓度 A＞料液比 B。模型中一次项 C、D 对通光藤苷 G 提取率
的影响达极显著水平，交互项 CD 对通光藤苷 G 提取率的影响达显著水平，二次项 A2、C2、D2 对通光
藤苷 G 提取率的影响达极显著水平，B2 对通光藤苷 G 提取率的影响达显著水平。利用响应曲面分析法
中的 Box-Behnken 模型，对乌骨藤中通光藤苷 G 提取工艺最佳条件进行确定，得出最优影响因子数值。
修正后的工艺条件确定为乙醇浓度 80%，料液比为 1∶20，提取时间 1.5 h，提取次数 2 次。在该条件
下对乌骨藤通光藤苷 G 进行 3 次平行提取试验，通光藤苷 G 的实际提取率为 0.253%，理论值与实际
值相差较小。由此说明，本试验通过响应面法优化所得到的通光藤苷 G 最佳提取工艺条件是可靠的，
为乌骨藤中 C21 甾体苷类化合物的提取工艺优化提供参考。
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