全 文 ：收稿日期: 2010-11-08
基金项目: 中国博士后科学基金特别项目 ( 200902550 ) ; 辽宁省教育厅基金资助项目 ( 2009T066 ) ; 大连科技局青年基金项目
( 2009J22DW040)
作者简介:李春雪( 1985-) ，女，硕士研究生，主要从事中药质量评价及创新药物开发; Tel: 13795117226，E-mail: lee_chunxue@ hotmail. com。
* 通讯作者:张慧，E-mail: syyycs@ 163. com;康廷国，E-mail: kangtg@ lnutcm. edu. cn。
乌骨藤总皂苷的提取工艺研究
李春雪，周成惠，倪 冲，李 斌，张 慧* ，康廷国*
( 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)
摘要 目的:优化乌骨藤总皂苷的提取工艺，建立乌骨藤总皂苷的含量测定方法。方法:采用 L9 ( 3
4 ) 正交试
验，以总皂苷含量为评价指标，确定总皂苷的提取工艺，并采用香草醛-高氯酸比色法，测定总皂苷的含量。结果:最
佳提取工艺为 70%乙醇 6 倍量，回流提取 3 次，每次 2h;总皂苷的浓度在 0. 032mg /mL ～ 0. 32mg /mL范围内呈良好
的线性关系，回收率为 98. 73%，RSD = 1. 21%。结论:确定的工艺稳定可行，适合工业化生产; 建立的含量测定方
法简便、快速、重现性好，为乌骨藤的新药开发奠定了基础。
关键词 乌骨藤;总皂苷;含量测定;提取工艺;正交试验
中图分类号: R284. 2 文献标识码: A 文章编号: 1001-4454( 2011) 02-0302-03
乌骨藤为萝藦科植物通关藤 Marsdenia tenacis-
sima( Roxb. ) Wight et Arn. 的藤茎，又名为通光散、
通关藤等，主产于云南，始载于《滇南本草》〔1〕，具有
平喘、降压及抑制肺炎球菌和流感杆菌等功效。近
年来，由于其良好的抗肿瘤活性与极低毒性，乌骨藤
的研究与开发被日益重视，其单味药材制成的注射
剂和片剂，目前是抗肿瘤的一线药物和必用药物，现
在临床广泛应用〔2〕。但迄今为止，有关其抗肿瘤的
活性成分及有效部位尚不明确，为探明上述问题，本
课题组对乌骨藤的化学成分〔3〕、药理等方面进行了
系统研究，先后证实了多糖类成分和皂苷类成分为
其有效部位〔4〕。为深入开发利用乌骨藤总皂苷，本
文采用 L9 ( 3
4 ) 正交试验，以总皂苷含量为评价指
标，对其提取工艺进行优化，采用香草醛-高氯酸比
色法，建立了规范化的含量测定方法。
1 材料与仪器
1. 1 材料 乌骨藤购于安国杏林药材公司，经本
院中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为萝藦科植物通
关藤 Marsdenia tenacissima( Roxb. ) Wight et Arn. 的
藤茎。
1. 2 试剂 乌骨藤皂苷 A( 105 ℃干燥至恒重) ，辽
宁中医药大学新药研发基地提供，纯度 98%。甲
醇、无水乙醇、正丁醇、高氯酸、香草醛等均为分析
纯。
1. 3 仪器 UV-3010 型紫外分光光度计( 日本岛
津) ; YB-IA 真空干燥箱 ( 天津市鑫洲科技有限公
司) ; HH-S型恒温水浴锅( 巩义市予华仪器有限责
任公司) 。
2 方法与结果
2. 1 乌骨藤总皂苷的含量测定
2. 1. 1 溶液的制备: 乌骨藤皂苷 A 对照品溶液的
配制:精密称取乌骨藤皂苷 A 对照品 5. 0 mg，置于
25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。供
试品溶液的制备: 取乌骨藤总皂苷粗粉约 150 mg，
用甲醇 50 mL 超声提取 30 min，滤过，置 250mL 量
瓶内，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2. 1. 2 测定波长的选择: 精密量取乌骨藤皂苷 A
对照品溶液和供试品溶液各 0. 8 mL，分别置 10 mL
试管中，挥干溶剂后，分别依次加入 5%香草醛-冰
醋酸 0. 4 mL，高氯酸 0. 6 mL，摇匀，70 ℃水浴加热
15 min，取出，置冰水浴中冷却 15 min，加冰醋酸 10
mL，摇匀。另取 0. 5 mL 甲醇同法平行操作作为空
白对照，在 350 ～ 600 nm波长范围内扫描吸收曲线。
结果对照品和供试品溶液在 462 nm 波长处均有最
大吸收，空白溶剂无干扰，故确定 462 nm 为测定波
长。
2. 1. 3 5%香草醛-冰醋酸加入量选择:精密量取乌
骨藤皂苷 A对照品溶液 0. 8 mL 6 份，分别置 10 mL
试管中，挥干溶剂后，分别加入 5%香草醛-冰醋酸
0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7 mL，再各自加入高氯酸
0. 6 mL，在 462 nm测定吸光度。结果显示，5%香草
醛-冰醋酸加入量为 0. 4 mL 时，反应基本完全，故
5%香草醛-冰醋酸加入量确定为 0. 4 mL。
2. 1. 4 高氯酸加入量的选择: 分别精密量取乌骨
藤皂苷 A对照品溶液 0. 8 mL 6 份，分别置 10 mL试
管中，挥干溶剂后，加入 5%香草醛-冰醋酸 0. 4 mL，
再分别加入高氯酸 0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8 mL，
在 462 nm测定吸光度。结果显示，高氯酸加入量为
·203· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 2 期 2011 年 2 月
0. 6 mL 时，反应基本完全，故高氯酸加入量确定为
0. 6 mL。
2. 1. 5 标准曲线的制备: 精密称取乌骨藤皂苷 A
对照品 5. 0mg，置于 25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀
释至刻度，即得对照品溶液。分别精密量取对照品
溶液 0. 16、0. 40、0. 8、1. 2、1. 6 mL至 10 mL试管中，
挥干溶剂，分别依次加入 5% 香草醛-冰醋酸 0. 4
mL，高氯酸 0. 6 mL，摇匀，70 ℃水浴加热 15min，取
出，置冰水浴中冷却 15 min，加冰醋酸 10 mL，摇匀，
在 462nm 波长处测定吸光度。以乌骨藤皂苷 A 加
入量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得标准回归方程
为 Y = 4. 0643x + 0. 0051 ( r = 0. 9995 ) ，表明乌骨藤
皂苷 A 浓度在 0. 032mg / mL ～ 0. 32mg / mL 范围内
线性关系良好。
2. 1. 6 稳定性试验: 取同一批供试品溶液，按
“2. 1. 5”项下方法操作，分别在 0、15、30、60、120
min测定吸光度。结果 RSD 为 1. 13%，供试品溶液
在 2h内吸光度基本无变化，稳定性良好。
2. 1. 7 重复性试验:取同一批供试品溶液 6 份，按
“2. 1. 5”项下方法操作，分别测定吸光度，计算含
量。结果 6 份样品的 RSD为 0. 60%，重复性良好。
2. 1. 8 加样回收率试验: 精密称取乌骨藤总皂苷
粗粉约 7. 5mg，共 6 份，分别加入乌骨藤皂苷 A 2. 5
mg，置 25 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按
“2. 1. 5”项下方法操作，结果平均回收率为
98. 73%，RSD为 1. 21%。
2. 2 乌骨藤总皂苷的提取工艺
2. 2. 1 提取溶剂的考察: 取乌骨藤药材，粉碎，过
10 目筛，取本品 5 份约 25g，精密称定，置圆底烧瓶
中，分别加 8 倍量水、6 倍量 30%、50%、70%、85%
的乙醇，回流提取 2 次，滤过，合并提取液，稀释至相
同体积，备用。精密量取上述备用液各 50 mL，蒸
干，并置真空干燥箱中，100 ℃干燥置恒重，测定出
膏率。另精密称取上述干膏 150mg，甲醇 50 mL 超
声提取 30min，滤过，置 250 mL量瓶内，加入甲醇稀
释至刻度，按“2. 1”项下的乌骨藤含量测定方法进
行测定，结果显示，70%和 85%乙醇回流提取所得
总皂苷含量较高，85%醇提出膏率与 70%醇提的出
膏率相当，但考虑到 70%的乙醇易于回收再利用，
降低工业成本，适于生产，故选用 70%乙醇回流提
取。
2. 2. 2 正交试验优化提取工艺: 以乙醇用量、提取
时间、提取次数为影响因素，根据预实验的结果每个
因素设定 3 个水平，以出膏率和总皂苷的含量为指
标，按照 L9 ( 3
4 ) 正交表进行试验，因素与水平见表
1。取乌骨藤药材粉碎，过 10 目筛，精密称取药材粉
末 25g各 9 份，按表 2 的条件进行提取，滤过，稀释
至相同体积。按“2. 1”项下的乌骨藤含量测定方法
测定含量，按“2. 2. 1”项下测定出膏率，结果见表 2。
方差分析结果见表 3。从表 2、表 3 可知，以出膏率
和总皂苷的含量为指标影响乌骨藤总皂苷的提取率
的因素顺序均为 C ＞ B ＞ A。其中 C 即提取次数对
乌骨藤总皂苷的提取影响最大;直观分析结果显示，
乌骨藤总皂苷最佳提取工艺为 A1B2C3，即用 6 倍量
的乙醇，提取 3 次，每次 2h。
表 1 因素水平表
水平 A溶剂倍数 /倍 B提取时间 /h C提取次数 /次
1 6 1 1
2 8 2 2
3 10 3 3
表 2 正交试验结果
试验号 A B C D 出膏率 /%
总皂苷
含量 /
( mg /g)
1 1 1 1 1 7. 13 26. 17
2 1 2 2 2 9. 65 28. 95
3 1 3 3 3 10. 43 30. 28
4 2 1 2 3 9. 05 27. 28
5 2 2 3 1 10. 83 31. 16
6 2 3 1 2 9. 49 27. 88
7 3 1 3 2 9. 23 28. 85
8 3 2 1 3 8. 98 26. 44
9 3 3 2 1 9. 07 27. 86
出膏率
K1 9. 07 8. 47 8. 53 9. 01
K2 9. 79 9. 82 9. 25 9. 45
K3 9. 09 9. 66 10. 16 9. 48
R 0. 72 1. 35 1. 63 0. 47
含量
K1 28. 46 27. 43 26. 83 28. 39
K2 28. 77 28. 85 28. 03 28. 56
K3 27. 71 28. 67 30. 09 28. 00
R 1. 05 1. 41 3. 26 0. 56
表 3 方差分析结果
指标 方差来源 偏差平方和 自由度 F比 显著性
出膏率 A 1. 00 2 2. 34
B 3. 27 2 7. 64
C 4. 00 2 9. 35
误差 0. 43 2
含量 A 1. 77 2 3. 56
B 3. 57 2 7. 18
C 16. 38 2 32. 89 ＊＊
误差 0. 50 2
注: F0. 05 ( 2，2) = 19. 00，＊＊P ＜ 0. 05
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2. 2. 3 验证试验:精密称取药材 250g，按照正交试
验的结果及结合实际优选出的提取方案，平行放大
操作 3 次，按“2. 1”项下的乌骨藤含量测定方法测
定含量，按“2. 2. 1”项下测定出膏率，结果见表 4。3
批出膏率的 RSD = 1. 3%，总皂苷含量的 RSD =
1. 14%，表明按最佳提取工艺取得的总皂苷收率稳
定，故确定的工艺稳定可行，适合工业化生产。
表 4 验证试验结果
批次 总皂苷含量 /( mg /g)
RSD /
%
出膏率 /
%
RSD /
%
1 30. 92 10. 44
2 31. 28 1. 13 10. 21 1. 32
3 30. 58 10. 20
3 讨论
3. 1 茴香醛-硫酸法和香草醛-高氯酸法是两种测
定总皂苷含量的常用方法，两种方法各有优缺点，茴
香醛-硫酸法的优点是茴香醛试剂性质比较稳定，可
以用于大量样品的测定。香草醛-高氯酸法的缺点
是香草醛试剂不如茴香醛稳定，只适合于少量样品
的测定，否则需要现配现测。曾尝试采用两种显色
剂进行测定，结果显示，茴香醛-硫酸法的对照品溶
液与供试品溶液的最大吸收波长有所偏差，综合考
虑本实验最终确定采用香草醛-高氯酸法，该方法具
有良好的稳定性、重复性，适用于乌骨藤总皂苷的含
量测定。
3. 2 含量测定实验比较了正丁醇萃取、甲醇回流
提取和甲醇超声提取 3 种方法。结果发现正丁醇萃
取法总皂苷的损失率较大，甲醇回流提取与甲醇超
声提取总皂苷含量相当，但甲醇回流提取对含量测
定有干扰，超声提取方法简单易行，故采用甲醇超声
提取方法。
3. 3 乌骨藤总皂苷抗肿瘤作用明确，本文含量测
定方法的确立为乌骨藤药材的质量控制提供了一定
依据。
参 考 文 献
［1］邢旺兴，陈斌，宓鹤鸣，等 . 乌骨藤辨考［J］. 中药材，
2003，26( 7) : 524-526.
［2］王垦，郭志雄 . 消癌平注射液联合 NP方案治疗晚期肺
癌 56 例近期疗效观察［J］. 肿瘤基础与临床，2009，22
( 1) : 47-48.
［3］张慧，翟延君，初正云，等 . 乌骨藤中五环三帖类化合物
的分离鉴定［J］. 分析化学，2007，35( 9) : 1377-1380.
［4］李斌，刘歆韵，张慧，等 . 乌骨藤多糖的提取工艺［J］.
中药材，2009，32( 11) : 1751-1754.
HPLC测定橙皮酊中橙皮苷的含量
李国成，刘春霞* ，丁 亮
( 中山大学孙逸仙纪念医院药学部，广东 广州 510120)
摘要 目的:建立反相高效液相色谱法测定橙皮酊中橙皮苷的含量。方法:采用 Agilent Eclipse XDB-C18色谱
柱( 250 mm ×4. 6 mm，5μm) ，以甲醇-冰醋酸-水( 25∶ 5∶ 70，V /V /V) 为流动相，流速 1 mL /min，检测波长 283 nm，柱
温 30 ℃。结果:橙皮苷进样浓度在 5. 76μg /mL ～ 43. 20 μg /mL范围内与峰面积呈良好线性关系，平均回收率( n =
9) 为 98. 3%，RSD为 1. 7%。结论:所建的 HPLC方法快捷、准确，可作为橙皮酊的质量控制方法。
关键词 橙皮苷;橙皮酊; HPLC
中图分类号: R284. 1 文献标识码: A 文章编号: 1001-4454( 2011) 02-0304-03
收稿日期: 2010-08-05
作者简介:李国成( 1968-) ，男，硕士，副主任药师，主要从事医院药事管理与药品检验方面研究; Tel: 020-81332451，E-mail: lgcwx@
163. com。
* 通讯作者:刘春霞，Tel: 020-81332427，E-mail: lcxgz@ 163. com。
橙皮酊是由橙皮提取的酊剂，一般为橙黄色的
澄明液体，味苦，有橘香气。它具有健胃、理气、祛痰
的功效，可用于治疗脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多
等疾病。在药剂中，橙皮酊主要作为芳香矫味剂、健
胃剂和祛痰剂使用。祛痰合剂、枸橼酸盐合剂等医
院常用制剂的配方中都常含有橙皮酊。橙皮酊的有
效成分为橙皮苷，它是二氢黄酮衍生物。大量的研
究发现橙皮苷具有显著的抗氧化、抗炎、祛痰平喘、
延缓衰老等作用，同时对心血管、肾脏系统都具有显
著的药理活性。本研究旨在相关报道〔1-4〕的基础上
建立测定橙皮酊中橙皮苷含量的反相高效液相色谱
法，为含橙皮酊制剂的原料选择标准和内在质量控
·403· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 2 期 2011 年 2 月