全 文 ：竹节参对 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１成骨样细胞增殖与分化的影响
朱盼盼１，李　飞１，陈　平２，杨中林１＊
（１．中国药科大学 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏 南京２１０００９；
２．武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉４３００２３）
摘　要：目的：研究竹节参不同提取物对体外培养成骨样细胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）增殖、分化作用的影响。方
法：采用 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞为体外药物筛选的细胞模型，用 ＭＴＴ法测定药物对成骨细胞的增殖作用，碱
性磷酸酶（ＡＬＰ）试剂盒测定ＡＬＰ的活性，考察竹节参不同提取物对 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖、分化作用的
影响。结果：１０－１　ｍｇ／ｍＬ的竹节参水提物和１０－４　ｍｇ／ｍＬ的９５％乙醇提取物能显著促进 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞
的增殖和分化（Ｐ＜０．０５）。结论：一定浓度的竹节参水提物和９５％乙醇提取物能显著促进 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１
细胞的增殖和分化，该药物具有开发抗骨质疏松药物的潜力。
关键词：竹节参；ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１；增殖；分化
中图分类号：Ｒ２８４．１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１３）０６－００１１－０３
收稿日期：２０１３－０３－１８
基金项目：国家自然科学基金项目（８１２７４０２３）
作者简介：朱盼盼（１９８７－），女，中国药科大学硕士研究生，研究方向为中药制剂。
通讯作者：杨中林（１９５０－），女，中国药科大学中药学院教授，博士生导师，研究方向为中药炮制与制剂。
　　竹节参又名竹节三七、竹节人参、白三七，为五加科植
物竹节参（Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．）的干燥根茎，属
《中国药典》多年收载的中药材品种。竹节参性温，味甘、微
苦；滋补强壮，散瘀止痛，止血祛痰；用于病后虚弱、咳嗽痰
多、跌打损伤。现代药理研究表明，竹节参主要活性成分为
皂苷类，尚含少量挥发油、多糖和氨基酸等。
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皂苷类成分是
　　（４）固相微萃取技术具有简便、快速、无溶剂的优点，可
直接与ＧＣ－ＭＳ联用，集采样、萃取、浓缩、进样于一体。对
于常用的水蒸气蒸馏法来说，提取所需要的样品量大、提取
时间长、需要大量有机溶剂进行萃取，加热时间长。固相微
萃取具有一定优势［１５］，但该法平衡温度低，许多高沸点成分
不易收集，分离出的成分不多；动态顶空吹扫捕集法灵敏度
高，远远超出了固相微萃取的检测下限，实现了挥发性物质
的微量分析，同时也不会引入有机溶剂等杂质。实验中采
用此方法检测出的成分明显多于其他两种方法，因此可将
动态顶空吹扫捕集－ＧＣ－ＭＳ分析法作为一种快速分析沉香
挥发性成分的可靠方法。
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（责任编辑：尹晨茹）
—１１—
竹节参中研究最多的成分，也是主要活性成分，其含量因产
地不同而不同，我国报道竹节参根中皂苷含量约为５．０％，
日本报道其根茎中粗皂苷含量约为２３．６％［１］。骨质疏松
（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，ＯＰ）是以骨量减少，骨组织显微结构退行性
改变为特征，骨脆性增加，易发生骨折的一种全身代谢性骨
病。骨质疏松症的西药治疗主要有骨吸收抑制剂和骨形成
刺激剂，常用药物为降钙素、维生素Ｄ、雌激素等。
然而长期大量使用外源性雌激素会增加子宫内膜增
生、子宫癌、乳腺癌、卵巢癌、静脉血栓形成等并发症发生的
危险性［２］，从而限制了雌激素的临床应用。小鼠颅骨细胞来
源的前成骨细胞 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞系是体外研究成骨过程的
经典模型［３］。本文研究竹节参提取物对成骨细胞 ＭＣ３Ｔ３－
Ｅ１的增殖、分化作用，为竹节参的抗骨质疏松作用提供体外
实验依据。
１　材料与方法
１．１　实验材料
１．１．１　实验仪器　ＨＥＲＡ　Ｃｅｌ　１５０型细胞培养箱（Ｔｈｅｒ－
ｍｏ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ），超净工作台（苏州艾可林
净化设备有限公司），ＣＯＩＣ　ＸＤＳ－１Ｂ型倒置光学显微镜（重
庆光电仪器有限公司），Ｓｙｎｅｒｇｙ２型酶标仪（Ｂｉｏｔｅｋ公司），
ＴＢ－２５型十万分之一电子天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ＵＳＡ）。
１．１．２　细胞株　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１，购于中国医学科学院基础医
学研究所。
１．１．３　药物与试剂　竹节参药材（产地：湖北恩施），９５％
乙醇（南京鼎新化工轻工有限公司），１７－β雌二醇（湖北大仝
生物化工科技有限公司），α－ＭＥＭ 培养基干粉（ＧＢＩＣＯ，批
号：１１１５８２２），ＨｙＣｌｏｎｅ胎牛血清（赛默飞世尔公司，批号：
ＮＷＫ０４８９），胰蛋白酶（ＧＢＩＣＯ，货号：２７２５００１８），四甲基偶
氮唑盐 （ＡＭＲＥＳＣＯ，货号：０７９３），二甲基亚砜（南京化学
试剂有限公司，批号：１１０３１８１０３１３），Ｗｅｓｔｅｒｎ及ＩＰ细胞裂
解液（碧云天生物技术研究所，产品编号：Ｐ００１３），碱性磷酸
酶测试盒、ＢＣＡ总蛋白定量测试盒 （南京建成生物技术有
限公司）。
１．２　实验方法
１．２．１　药物制备　取竹节参药材饮片５０ｇ，浸泡２ｈ，以１０
倍量蒸馏水８０℃浸提３次，每次２ｈ，合并提取液，浓缩，减压
干燥后得水提物。取竹节参药材饮片５０ｇ，浸泡２ｈ，以１０倍
量９５％乙醇８５℃回流提取３次，每次２ｈ，合并提取液，回收
乙醇，减压干燥后得９５％乙醇提取物。称取上述两种提取
物适量，分别配制成１０ｍｇ生药／ｍＬ的样品贮备液。
１．２．２　细胞培养　小鼠成骨细胞株 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１，采用含
１０％胎牛血清的α－ＭＥＭ培养基，在５％ＣＯ２、３７℃培养箱中
培养，２ｄ换液１次，３～４ｄ传代１次。
１．２．３　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖作用、ＡＬＰ活性测定　①
细胞数目与吸光度的线性关系考察，将 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞用
０．２５％胰蛋白酶制成细胞悬液，分别以１×１０４、２×１０４、３×
１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４ 和９×１０４ｃｅｌ／
ｍＬ密度接种于９６孔板，每孔２００μＬ，每组设６个复孔，培
养２４ｈ后，每孔中加入５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ溶液２０μＬ，３７℃孵
化４ｈ，有 蓝 紫 色 沉 淀 生 成。吸 去 培 养 液，每 孔 加 入
１５０μＬＤＭＳＯ溶解，用酶标仪于４９０ｎｍ测定吸光度。②增
殖作用测定，将 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞以２×１０４ｃｅｌ／ｍＬ密度接
种于９６孔培养板，每孔２００μＬ，培养２４ｈ后给药。实验组分
别加入水提物、９５％醇提物的终浓度分别为１０－１、１０－２、１０－３、
１０－４　ｍｇ生药／ｍＬ，阳性对照组加入等体积终浓度为１×１０－８
ｍｏｌ·Ｌ－１的雌二醇，空白对照组加入等体积的不含药的α－
ＭＥＭ培养液，每组均设６个复孔。继续培养４４ｈ，每孔中加
入５ｍｇ／ｍＬ的 ＭＴＴ溶液２０μＬ，３７℃孵化４ｈ，有蓝紫色沉
淀生成。吸去培养液，每孔加入１５０μＬ／孔ＤＭＳＯ溶解，用
酶标仪于４９０ｎｍ测定吸光度。③碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性测
定，将 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞以５×１０４ｃｅｌ／ｍＬ密度接种于２４孔
培养板，每孔１ｍＬ，培养２４ｈ后给药。实验组分别加入水提
物、９５％醇提物的终浓度分别为１０－１、１０－２、１０－３、１０－４　ｍｇ生
药／ｍＬ，阳性对照组加入等体积终浓度为１×１０－８　ｍｏｌ·Ｌ－１
的雌二醇，空白对照组加入等体积的不含药的溶剂α－ＭＥＭ
培养液，每组均设３个复孔，继续培养９６ｈ。到规定的时间
点后，弃去培养液，加入细胞裂解液裂解细胞，收集裂解液，
４℃条件下，４　０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，收集上清液。按碱性磷酸
酶（ＡＬＰ）检测试剂盒及ＢＣＡ蛋白定量法分别测定ＡＬＰ值
和蛋白含量，计算细胞内 ＡＬＰ的活性（Ｕ／ｇ·ｐｏｒｔ）。④统
计学分析，应用ＳＰＳＳ　１１．０对实验数据进行统计学分析，所
有数据均以（珚ｘ±ｓ）表示，实验组与对照组比较，采用ｔ检
验，＊Ｐ＜０．０５表示有显著性差异，＊＊Ｐ＜０．０１为有极显著
性差异。
２　实验结果
２．１　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞的增殖作用考察
２．１．１　细胞数目与吸光度的线性关系　以实验测得的６
个复孔吸光度的平均值（Ｙ）与细胞数目（Ｘ）作线性回归，得
回归方程：Ｙ＝０．０２１９Ｘ＋０．３２８６（ｒ＝０．９９８７，ｎ＝６）。由实
验结果可知，在（１～９）×１０４ｃｅｌ／ｍＬ范围内，细胞数目与吸
光度ＯＤ值呈较好的线性关系。见图１。
图１　细胞数目与吸光度的线性关系
２．１．２　对 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖的影响　由表１可知，
１０－１　ｍｇ／ｍＬ的水提物和１０－４　ｍｇ／ｍＬ的９５％乙醇提取物明
显促进 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１增殖，增殖率明显高于空白对照组（Ｐ＜
０．０５）。其他各浓度的竹节参提取物对 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１无明显
增殖作用。说明１０－１　ｍｇ／ｍＬ 的水提物和１０－４　ｍｇ／ｍＬ 的
９５％乙醇提取物能加速成骨细胞的增殖。见表１。
２．２　对 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞分化的影响
由表２可知，１０－１　ｍｇ／ｍＬ的水提物和１０－４　ｍｇ／ｍＬ的
９５％乙醇提取物明显提高ＡＬＰ活性，ＡＬＰ活性明显高于空
白对照组（Ｐ＜０．０５）。但是其他各浓度的竹节参提取物对
—２１—
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞的 ＡＬＰ活性无明显提高作用。实验结果
说明１０－１　ｍｇ／ｍＬ的水提物和１０－４　ｍｇ／ｍＬ的９５％乙醇提取
物能够明显的促进成骨细胞的分化。
表１　竹节参各提取物对 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖的影响
（ｎ＝６）
Ｇｒｏｕｐ　 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
（珚ｘ±ｓＤ）
Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ（％）
Ｎｏｒｍａｌ ——— ０．２６９±０．０１１ ———
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 １×１０－８　ｍｏｌ／Ｌ　 ０．２８２±０．００６　 １１．３７＊＊
１×１０－１　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２８９±０．０１１　 ９．８３＊
ａｑｕｅｏｕｓ　 １×１０－２　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２７４±０．００８　 ２．１４
ｅｘｔｒａｃｔ　 １×１０－３　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２７４±０．０１１　 ２．２２
１×１０－４　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２７５±０．０１７　 ２．７３５
１×１０－１　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２７０±０．００７　 １．７０９
９５％ｅｔｈａｎｏｌ　 １×１０－２　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２７０±０．００４　 １．２８２
ｅｘｔｒａｃｔ　 １×１０－３　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２７０±０．００８　 １．３６８
１×１０－４　ｍｇ／ｍＬ　 ０．２８６±０．０１１　 ８．４６２＊
Ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。
表２　竹节参各提取物对成骨细胞分化的影响 （ｎ＝３）
Ｇｒｏｕｐ　 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ＡＬＰ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ
Ｕ／ｇ·ｐｏｒｔ（珚ｘ±ｓＤ）
Ｎｏｒｍａｌ ——— ０．７７３±０．０４７
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 １×１０－８　ｍｏｌ／Ｌ　 ０．９５９±０．０３７＊＊
１×１０－１　ｍｇ／ｍＬ　 ０．９１６±０．０５８＊
ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ
１×１０－２　ｍｇ／ｍＬ　 ０．７７５±０．０７４
１×１０－３　ｍｇ／ｍＬ　 ０．８９８±０．０８８
１×１０－４　ｍｇ／ｍＬ　 ０．８９８±０．１２４
１×１０－１　ｍｇ／ｍＬ　 ０．７３５±０．０９２
９５％ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔ
１×１０－２　ｍｇ／ｍＬ　 ０．８２８±０．１８３
１×１０－３　ｍｇ／ｍＬ　 ０．８０８±０．２０１
１×１０－４　ｍｇ／ｍＬ　 ０．９０４±０．０６５＊
Ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。
３　讨论
成骨细胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）是骨形成的主要功能细胞，它既分
泌骨基质参与骨形成，还参与破骨细胞吸收功能的调节，在
骨代谢过程中起着重要作用［４］。成骨细胞在骨形成过程中经
历增殖、分化和矿化三个阶段［５］。碱性磷酸酶（Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓ－
ｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ或ＡＫＰ）由成骨细胞产生，富含于胞浆中，它既
可作为成骨细胞的功能标记物，又可反映其分化成熟程度［６］。
本文选用经典的前成骨细胞模型 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞为研究对
象，其具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性
磷酸酶活性、Ⅰ型胶原合成和基质矿化等［６－７］。
本实验采用将竹节参提取物与 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１共同培养的
方法，考察不同提取物对 ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１的增殖分化作用。实
验结果表明竹节参水提物及９５％醇提物均可显著促进
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１的增殖与分化，且对增殖、分化影响大小与其浓
度有密切关系。由此可推断竹节参中含有一些药效物质，
既可促进细胞的增殖，又能进一步促进细胞成熟分化。因
此加速成骨细胞的增殖与分化，增强成骨细胞活性，可能是
竹节参抗骨质疏松作用的部分机制。
本实验在细胞水平上证实了竹节参的抗骨质疏松活
性，结果表明竹节参具有开发成抗骨质疏松药物的潜质，但
发挥作用的主要有效物质以及具体作用途径有待于进一步
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ｃｉｐｒｏｃａｌ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
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ｄｅｒｅｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｅｗ　ｂｏｒｎ　ｍｏｕｓｅ　ｃａｌｖａｒｉａ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏ，１９８３，
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（责任编辑：余　婷）
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ｃｕｓ．ＭＴＴ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ｂｙ　ａｑｕｅｏｕｓ　ａｎｄ　９５％ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ　ｉｎ　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１
ｃｅｌｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｌｋａｌｉ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＬＰ）ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　１０－１　ｍｇ／ｍＬ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｎｄ　１０－４　ｍｇ／ｍＬ　ｏｆ　９５％ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ｃｅｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｎｄ
９５％ｅｔｈａｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１．Ｔｈｉｓ　ｈｅｒｂ
ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎｔｏ　ａ　ｎｅｗ　ｄｒｕｇ　ｆｏｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｐａｎａｘ　Ｊａｐｏｎｉｃａｓ；ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１；Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
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