全 文 ：第 33 卷 第 9 期
2 0 1 5 年 9 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 33 No． 9
Sep． 2 0 1 5
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刊
DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2015． 09． 023
峨参内酯对 4 种肿瘤细胞的抑制作用及机制研究
黄艳娇，马超英，马保玉，李永超，耿耘
(西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)
摘 要:目的:探讨峨参内酯对 4 种肿瘤细胞凋亡的影响及其相关机制研究。方法:采用流式细胞仪检测峨
参内酯对肿瘤细胞周期进程的影响及对细胞凋亡的观察;阳性对照组采用紫杉醇处理、峨参内酯组采用峨参内酯
处理，空白对照组采用 0． 1%DMSO处理;采用 ELISA试剂盒检测峨参内酯对 4 种肿瘤细胞 Bcl － 2、Bax 影响;采
用 western blot法检测峨参内酯对 STAT3、P53、NF － κB蛋白表达。结果:峨参内酯对 4 种肿瘤细胞周期进程及凋
亡，随着作用时间的增加，G0 /G1 期细胞百分数逐渐降低，G2 /M期细胞百分数变化不大，而 S期细胞百分数逐渐
上升;阳性对照组、峨参内酯组与空白对照组比较，Bcl － 2 /Bax 比值明显降低，且有显著性差异(P ＜ 0． 05) ，峨参
内酯组比值显著低于阳性对照组，且有显著性差异(P ＜ 0． 05) ;阳性对照组和峨参内酯组与空白对照组比较，
STAT3 和 NF － κBP65 表达明显降低，而 P53 表达明显上升。结论:峨参内酯阻滞 4 种肿瘤细胞于 S 期且具有诱
导肿瘤细胞凋亡的作用，其机制是通过上调 Bax、P53 表达，下调 Bcl － 2、STAT3、NF － κBP65 表达而实现的。
关键词:峨参内酯;流式细胞术;细胞凋亡;细胞周期;机制研究
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2015)09-2133-03
Study on Anthricin Effects on Four Kinds of Tumor Cell Apoptosis and Its Mechanism
HUANG Yanjiao，MA Chaoying，MA Baoyu，LI Yongchao，GENG Yun
(College of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，Sichuan，China)
Abstract:Objective:To investigate the effects and mechanism of anthricin on four tumor cell apoptosis． Methods:The
flow cytometry was used to detect the effect of ginseng lactone E on tumor cell cycle progression and observation of cell ap-
optosis ． The positive control group was treated with paclitaxel treatment and anthricin group used anthricin treatment and
control group was treated with 0． 1%DMSO． The ELISA detection kit anthricin on four tumor cells＇Bcl － 2 and Bax effect
and Western blot was used to assay anthricin on STAT3，P53 and NF － κ B protein expressions． Ｒesults:Four kinds of
tumor cell cycle and apoptosis anthricin，with the time increasing，cell percentage in G0 /G1 phase decreased，cell percent-
age in G2 /M phase changed little，and the percentage of S phase cells increased gradually． Compared with the positive con-
trol group，anthricin group and blank control group，the ratio of Bcl －2 /Bax decreased significantly and there was significant
difference (P ＜0． 05)． The anthricin group＇s value was significantly lower than that of the positive control group and there
was significant difference (P ＜ 0． 05)． The positive control group and anthricin group compared with the control group，
STAT3 and NF － κ BP65 expression significantly decreased while P53 expression increased significantly． Conclusion:An-
thricin can block four kinds of tumor cells in S phase and induce apoptosis in tumor cells and its mechanism is through the
up － regulation of Bax and P53 expression and down － regulation of Bcl －2，STAT3 and NF － κ BP65 expression．
Key words:anthricin;flow cytometry;apoptosis;cell cycle;mechanism research
收稿日期:2015 － 04 － 17
基金项目:国家自然科学基金项目(81073036)
作者简介:黄艳娇(1988 －) ，女，云南个旧人，硕士研究生，研究方
向:中药及复方的物质作用基础。
通讯作者:马超英(1962 －) ，男，山西黎城人，教授，硕士研究生导
师，研究方向:中药作用机理。E-mail:mcy195888@ 126．
com。
峨参是一种川产道地中药材，本课题组前期研究结果
显示［1］，峨参中提取的峨参内酯具有较好的抗肿瘤活性，
本研究进一步探讨峨参内酯对细胞凋亡的影响及其相关机
制，现报道如下。
1 材料
1． 1 实验药物及细胞 肺癌 A549 细胞、宫颈癌 Hela 细
胞、肝癌 HepG2 细胞、骨肉瘤 MG － 63 细胞(均来自于四川
大学华西药学院) ，峨参内酯(由本课题组成员提取分离得
到，经结构鉴定确认)。
1． 2 主要仪器及试剂 (1)主要试剂:人 Bcl － 2 关联 x蛋
白酶联免疫分析试剂盒(产品编号:KYM10330EIA －
2024H)、人 B细胞淋巴瘤因子 2 酶联免疫分析试剂盒(产
品编号:ISC10330EIA － 2029H)、DMEM 培养基(来自于美
国 Hyclon公司)、PBS溶液(自制)、胰蛋白酶酶(来自于美
国 Hyclon 公司)、青霉素 /链霉素混合液(来自于美国 Hy-
clon公司)、6 孔培养板(美国 Coster公司)、胎牛血清(来自
于美国 Hyclon公司)、MTT(来自于美国 Sigma 公司)、二甲
基亚砜(来自于美国 Sigma公司)、PI染液(来自于美国 Sig-
ma公司)。
(2)主要仪器:L420 型离心机(来自于长沙湘仪离心机
有限公司)、BSW － 880 超净工作台(来自于江苏苏净集团
有限公司)、3110 型 CO2 恒温孵箱(来自于美国 Thermo 公
司)、倒置相差显微镜(来自于日本索尼公司)、FE20K 恒温
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水浴箱(来自于江苏太仓市实验设备厂)、漩涡混合器(其
林贝尔有限公司)、酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有
限公司)。
2 方法
2． 1 流式细胞术检测细胞周期进程及细胞凋亡 常规培
养细胞，取对数生长期的 HeLa、MG － 63、HepG2、A5494 种
肿瘤细胞，经胰酶消化，计数，按 1 × 106个 /孔分别接种到
25 mL培养瓶中，在 37 ℃、5% CO2 条件下培养 24 h后，吸
弃旧培养基，峨参内酯组加入含有峨参内酯的新培养基至
终体积 5 mL，终浓度为 40 μg /mL;阳性对照组加入含有紫
杉醇的新培养基至终体积 5 mL，最终浓度为 1 μg /mL;空
白对照组加入含有 0． 1% DMSO 的新培养基至终体积 5
mL;培养 48 h后，胰酶消化，收集细胞，采用 pH7． 4 预冷的
PBS清洗 1 ～ 2 次，弃上清，加入预冷的 70%乙醇 1 mL给予
固定，保存于 4 ℃，过夜。上机检测前，加 PBS重悬细胞，离
心 5 min，加 1 mL PI染液(50 μg /mL) ，室温避光 30 min，流
水细胞仪检测分析细胞周期 DNA含量，从而确定细胞周期
的分布;细胞凋亡时有 DNA的断裂丢失，细胞 DNA含量少
于二倍体，FCM检测时出现在 G1 期前，称为 Sub － G1 期，
细胞凋亡率为其占细胞总数的比例。
2． 2 Bcl － 2、Bax影响 常规培养细胞，分组及加药方法同
上，培养 48 h后峨参内酯对 4 种肿瘤细胞 Bcl － 2、Bax作用
严格按照 ELISA试剂盒说明书标准进行操作。
2． 3 western blot 法检测峨参内酯对 STAT3、P53、NF － κB
蛋白表达 细胞培养方法同上，细胞总蛋白的提取采用 PI-
ＲA裂解液，蛋白浓度采用 BCA法测定，10%的 SDS －聚丙
烯酰胺凝胶电泳后，然后将其半干转印至 PVDF膜，再利用
5%脱脂奶粉中封闭 1． 5 h，加一抗在 4 ℃条件下过夜;洗膜
后加入二抗稀释液(1 ∶ 1000) ，在室温条件下孵育 60 min。
采用 ECL显色曝光，使用凝胶成像系统扫面分析。
2． 4 统计学方法 运用统计学分析处理软件 SPSS 22． 0
进行数据处理，差异具有统计学意义以 P ＜ 0． 05 表示。
3 结果
3． 1 峨参内酯对 HepG2、Hela、MG － 63、A549 细胞周期进
程的影响 结果显示，与对照组比较，经 40 μg /mL 峨参内
酯作用于人肝癌 HepG2、Hela、MG －63、A549 细胞 48 h后，
G0 /G1 期细胞百分数逐渐减少，且有显著性差异(P ＜
0. 05) ，而 S期的细胞百分数逐渐增加，且有显著性差异(P
＜ 0． 05) ，G2 /M期的细胞百分数变化无显著性差异;与紫
杉醇组比较，峨参内酯组 G0 /G1、G2 /M、S 期细胞百分数无
显著性差异(P ＞ 0． 05) ，故峨参内酯能造成 HepG2、Hela、
MG －63、A549 细胞 S期阻滞，见表 1 ～表 4。
表 1 峨参内酯对 HepG2 细胞周期进程的影响(%，珋x ± s)
组别 G0 /G1 期 G2 /M期 S期
峨参内酯组 52． 37 ± 1． 20* 23． 53 ± 0． 83 22． 47 ± 1． 24*
阳性对照组 43． 86 ± 2． 74* 25． 37 ± 1． 39 31． 08 ± 1． 62*
对照组 64． 29 ± 2． 94 28． 48 ± 1． 02 7． 82 ± 0． 56
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05。
表 2 峨参内酯对 Hela细胞周期进程的影响(%，珋x ± s)
组别 G0 /G1 期 G2 /M期 S期
峨参内酯组 54． 82 ± 1． 38* 19． 65 ± 0． 54 25． 84 ± 0． 98*
阳性对照组 51． 23 ± 0． 76* 20． 19 ± 1． 09 28． 67 ± 1． 06*
对照组 62． 37 ± 3． 19 23． 47 ± 0． 73 14． 85 ± 0． 62
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05。
表 3 峨参内酯对 MG －63细胞周期进程的影响(%，珋x ± s)
组别 G0 /G1 期 G2 /M期 S期
峨参内酯组 53． 98 ± 1． 42* 20． 46 ± 0． 52 25． 71 ± 1． 08*
阳性对照组 51． 22 ± 2． 07* 21． 09 ± 0． 98 27． 85 ± 1． 14*
对照组 69． 28 ± 3． 08 21． 45 ± 0． 69 9． 83 ± 0． 67
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05。
表 4 峨参内酯对 A549 细胞周期进程的影响(%，珋x ± s)
组别 G0 /G1 期 G2 /M期 S期
峨参内酯组 53． 28 ± 1． 40* 21． 45 ± 0． 71 24． 97 ± 1． 24*
阳性对照组 50． 81 ± 1． 85* 23． 58 ± 0． 47 25． 71 ± 1． 02*
对照组 70． 92 ± 2． 86 16． 73 ± 0． 39 11． 97 ± 0． 73
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05。
3． 2 峨参内酯对 HePG2、Hela、MG － 63、A549 细胞凋亡的
影响 在细胞周期 G0 /G1 期前能够检测到 sub － G1 峰。
随着药物作用时间的增加，其凋亡率也不断增加，与对照组
比较，40 μg /mL峨参内酯组、阳性对照组的 4 种肿瘤细胞
凋亡率均显著升高(P ＜ 0． 05) ，见表 5。
表 5 3 组药物对 4 种肿瘤细胞凋亡率的比较(%，珋x ± s)
组别 HePG2 Hela A549 MG － 63
峨参内酯组 8． 41 ± 0． 87* 12． 38 ± 1． 14* 7． 84 ± 0． 45* # 17． 89 ± 4． 05*
阳性对照组 10． 56 ± 1． 01* 15． 78 ± 3． 47* 24． 77 ± 8． 15* 23． 72 ± 6． 81*
对照组 1． 32 ± 0． 17 0． 87 ± 0． 26 1． 78 ± 0． 35 2． 83 ± 0． 91
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05;与阳性对照组比较，#P ＜ 0． 05。
3． 3 峨参内酯对 4 种肿瘤细胞 Bcl － 2、Bax作用观察 阳
性对照组、峨参内酯组与空白对照组比较，作用 4 种肿瘤细
胞 48 h后 Bcl － 2 /Bax 比值明显降低，且有显著性差异(P
＜ 0． 05) ;峨参内酯组作用 Hela细胞 48 h后 Bcl － 2 /Bax比
值显著低于阳性对照组，且有显著性差异(P ＜ 0． 05) ，见
表 6。
表 6 峨参内酯作用 4 种肿瘤细胞 48 h后
Bcl － 2 /Bax比值分析
细胞类型 对照组 阳性对照组 峨参内酯组
HepG2 2． 20 ± 0． 52 2． 05 ± 0． 43* 2． 08 ± 0． 41*
Hela 2． 21 ± 0． 63 2． 09 ± 0． 39* 1． 92 ± 0． 34* #
MG － 63 2． 13 ± 0． 49 2． 02 ± 0． 36* 2． 03 ± 0． 39*
A549 1． 80 ± 0． 47 1． 47 ± 0． 26* 1． 56 ± 0． 31*
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0． 05;与阳性对照组比较，#P ＜
0． 05。
3． 4 峨参内酯对 STAT3、P53 以及 NF － κBP65 表达的影响
与空白对照组相比，阳性对照组和峨参内酯组，STAT3 蛋白
的表达有所下降，见图 1;与空白对照组相比，阳性对照组和
峨参内酯组，P53 蛋白的表达有所上调，见图 2;与空白对照
组相比，阳性对照组和峨参内酯组，NF － κBP65蛋白的表达有
所下降，见图 3。β － actin的表达作为一个质量控制。
4 讨论
有学者研究报道结果显示［2］，细胞增殖、分化及凋亡
均为细胞周期依赖性，使肿瘤细胞周期蛋白的表达受到抑
制，上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达，均能够选
择性地抑制肿瘤组织细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，从
而使肿瘤细胞周期蛋白异常增殖阻止，进而使正常细胞受
到保护，是治疗肿瘤的新思路。本文研究结果显示，峨参内
酯能够诱导 4 种肿瘤细胞在 S期阻滞。由于细胞凋亡机制
复杂，通常应用几种甚至多种方法综合判断，本实验也经多
种方法确定峨参内酯诱导 4 种肿瘤细胞凋亡。通过前期峨
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图 1 峨参内酯对 STAT3 表达的影响［条带从左至右分别为:
1空白对照，2紫杉醇对照(1 μg /mL)，3峨参内酯(40 μg /mL)］
图 2 峨参内酯对 P53 表达的影响［条带从左至右分别为:1空
白对照，2紫杉醇对照(1 μg /mL)，3峨参内酯(40 μg /mL)］
图 3 峨参内酯对 NF － kB P65 表达的影响［条带从左至右分别
为:1空白对照，2紫杉醇对照(1 μg /mL)，3峨参内酯(40 μg /mL)］
参内酯 MTT法检测显示细胞增殖均受到显著抑制，且呈时
间 －浓度依赖性［1］;通过对 Bcl － 2、Bax 作用观察发现，可
通过上调 Bax、下调 Bcl － 2 诱导肿瘤细胞凋亡;通过流式细
胞术 PI单标检测峨参内酯、13 号、15 号及 0 号衍生物 sub
－ G1 峰，显示具有诱导细胞凋亡的作用。
STAT3 由于其与肿瘤的关系较为密切，越来越受到人
们的重视，STAT3 可以被许多细胞因子、生长因子和其它刺
激所激活，比其它 STAT蛋白有着更为重要的生理功能，它
可能主导着胚胎早期发育过程，此外 STAT3 可以在许多信
号传递过程系统中被激活［3 － 4］。本研究结果显示，与对照
组相比，紫杉醇对照组和峨参内酯组，STAT3 蛋白的表达有
所下降，猜测峨参内酯抑制 A549、HepG2、MG － 63、HeLa细
胞增殖的途径可能与抑制 STAT3 信号通路，与抑制 STAT
蛋白磷酸化有关。
P53 与调控细胞周期、有丝分裂、凋亡和 DNA 修复密
切相关，可抑制肿瘤细胞生长。DNA 损伤、纺锤体前提物
质损伤、致癌信号等都可能激活 P53 的表达［5］。P53 磷酸
化后可使有丝分裂阻滞在 G1 或 G2 期，修复损伤 DNA［6］。
本研究结果显示，与对照组相比，紫杉醇对照组和峨参内酯
组，P53 蛋白的表达有所上调，猜测峨参内酯抑制 A549、
HepG2、MG －63、HeLa细胞增殖的途径可能与活化 P53 抑
癌基因，激活 P53 蛋白的表达有关。
NF － κB是一种与肿瘤发生发展重要相关的核转录因
子，可以通过抑制促凋亡因子和促进抑凋亡基因，使细胞免
于凋亡［7］。Bcl － 2 是 NF － κB下游一个重要基因，NF － κB
被活化，Bcl － 2 表达也相应上调［8］。本研究结果显示，与
对照组相比，紫杉醇对照组和峨参内酯组，NF － κBP65 蛋
白的表达有所下降，推测峨参内酯促进 A549、HepG2、MG －
63、HeLa 细胞凋亡的途径可能与抑制 NF － κBP65 蛋白的
活化，同时抑制 Bcl － 2 活性，使凋亡增强有关。
综上所述，峨参内酯阻滞 4种肿瘤细胞于 S期且具有诱
导肿瘤细胞凋亡的作用;峨参内酯可通过上调 Bax、下调 Bcl
－2，从而诱导肿瘤细胞凋亡;同时峨参内酯可通过上调
P53，下调 STAT3、NF － κBP65蛋白表达诱导肿瘤细胞凋亡。
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