全 文 ：第 34 卷第 3 期
2015 年 9 月
武 汉 轻 工 大 学 学 报
Journal of Wuhan Polytechnic University
Vol． 34No． 3
Sep． 2015
收稿日期:2015-01-22． 修回日期:2015-04-28．
作者简介:吴亚运(1990-) ，男，硕士研究生，E-mail:282595491@ qq． com．
通信作者:陈平(1958-) ，女，教授，E-mail:chenpingvip24@ 163． com．
基金项目:湖北省教育厅科学研究青年项目(Q20141704)．
文章编号:2095-7386(2015)03-0011-05
DOI:10． 3969 / j． issn． 2095-7386． 2015． 03． 003
竹节参根状茎总 ＲNA提取方法的研究与优化
吴亚运1，张绍鹏1，赵小龙1，宋 佳1，陈 平1，2
(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023;湖北道地药材分子生物学实验室，湖北 武汉 430023)
摘 要:针对竹节参根状茎质地坚硬、植物纤维多，富含多糖、酚类、蛋白质及其他多种次生代
谢产物的特点，研究竹节参根状茎总 ＲNA 提取方法。分别运用 Trizol 法、Total ＲNA Kit 植物
提取试剂法、CTAB法进行总 ＲNA的提取。借鉴人参根组织 ＲNA的提取经验，根据竹节参的
自身特点，有针对性的对 CTAB法和 Trizol法进行了优化，样品裂解后中加入 PVPP(聚乙烯聚
吡咯烷酮)和 B-巯基乙醇去除酚类，并加入乙酸钠营造出高浓度钠离子环境去除多糖，之后再
加入 70%高氯酸钠溶液去除蛋白质，并对提取的总 ＲNA进行电泳和 OD值检测与分析。优化
后的 3 种方法进行对比发现，对于竹节参总 ＲNA 的提取效果有较大差异，其中优化的 Trizol
法提取的 ＲNA电泳 28S、18S条带清晰，比值约为 2:1，经紫外光谱分析 OD260 /OD280 比值为
1． 93，OD260 /OD230 比值为 2． 07，获得了纯度高、完整性好的总 ＲNA。进一步以优化的 Trizol
法提取所得 ＲNA为模版进行反转录，并做 ＲT-PCＲ，结果表明，ＲT-PCＲ的带型特异稳定，优化
方法提取的总 ＲNA质量稳定可靠，适用于基因表达等后续分子生物学研究。优化的 Trizol 法
是一种适合于竹节参根状茎总 ＲNA抽提的简单快速有效的方法。
关键词:竹节参;ＲNA提取;ＲT-PCＲ;根状茎;多糖;多酚
中图分类号:Q 949;TQ 460． 6 文献标识码:A
Analysis and optimization of high-quality ＲNA extraction
in rhizomes of Panax japonicus C． A． Mey
WU Ya-yun1，ZHANG Shao-peng1，ZHAO Xiao-long1，SONG Jia1，CHEN Ping1，2
(1． School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;
2． Lab of MolecularPharmacology of Traditional Chinese Medicine in Hubei，Wuhan 430023，China)
Abstract:Extraction of high-quality total ＲNA from the rhizomes secondary metaboli tes of Panax japonicus is al-
ways difficult due to rich fibers and hard tissues during the sampling grinding，and high levels of polyphenolcs，pol-
ysaccharides even secondary metabolies that coprecipitate with ＲNA during the ＲNA extraction． Three extraction
methods，modified Trizol，Total ＲNA Kit plant extraction reagent method，modified CTAB were compared and im-
proved to isolate ＲNA of rhizomes from Panax． japonicus． Especiallly of CTAB and Trizol method，the PVPP(Poly-
vinylpyrrolidone)and B-Mercaptoethanol were added after plant cell lysis so as to remove polyphenolcs． And Sodi-
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um acetate trihydrate and 70% Sodium perchlorate were then added to remove polysaccharides and protein． After
these three methods，total ＲNA can be obtained with different ＲNA quality as determined by electrophoresis and
UV-spectroscopic analysis． The modified Trizol method can extract high-quality and high-integrity ＲNA as deter-
mined by UV-spectroscopic analysis showing the OD260 /OD280 at 1． 93 and OD260 /OD230 at 2． 07． The electro-
phoresis profile showed that the lightness at 28S was 2 times higher than that at 18S． Then，the ＲNA were tran-
scribed into complementary DNA (cDNA)by using poly(A)primer． The resulting cDNA were used for reverse
transcription polymerase chain reaction (ＲT-PCＲ) ，which showed the stable and specific bands． These results in-
dicate that our extracted ＲNA is suitable for gene expression analysis． The result showed that the modified Trizol
method was simple，convenient，efficient for extracting Panax japonicus rhizomes total ＲNA．
Key words:Panax japonicus C． A． Mey;ＲNA extraction;ＲT-PCＲ;rhizomes;polysaccharide;polyphenol
1 引言
竹节参(Panax japonicus C． A． Mey)是五加科人
参属植物。该植物的主要活性成分是次生代谢产物
三萜皂苷，根状茎则是其最常用的药用部位［1］。竹
节参兼具人参滋补和三七活血化瘀的功效，在我国
南方土家苗族民间医疗中被誉为“万草之王”，市场
应用前景十分广泛。目前对竹节参的药用研究主要
集中于其有效成分、结构、药理作用以及临床应用等
几个方面，这是传统中药与现代药物化学、药理学、
病理学的常规、宏观的结合项目。但在微观领域的
分子层面，利用现代基因组与基因组学即基因的结
构、表达、控制与功能分析和植物分子生物技术来影
响植物体内次生代谢产物的合成与调控等方面却趋
于空白。
要深入研究竹节参中基因遗传学基础对次生代
谢产物的影响，获取纯度高、质量好的总 ＲNA 就成
为了首要前提。由于植物细胞壁及植物组织细胞中
内含物多，成分复杂且含有包括 ＲNAse 在内的多种
酶等因素的影响，使得植物组织 ＲNA的提取相比于
其它类型的组织样本较为困难。竹节参属人参属，
与人参相比较，在其根状茎中不但含有多糖、多酚、
色素、蛋白质等人参组织中常见的与 ＲNA结构相似
或是易与 ＲNA发生反应并产生沉淀的“特有物质”
，而且竹节参根状茎组织质地更加坚硬、植物纤维更
多、ＲNA的富含丰度更小，使得竹节参 ＲNA 的提取
难度相比于人参组织更大［2］。鉴于此，笔者在人参
根组织总 ＲNA提取方法和经验的基础上，结合竹节
参的自身特点，尝试了优化的 Trizol 法、Total ＲNA
Kit植物提取试剂法、优化的 CTAB 法 3 种从竹节参
根状茎组织中提取总 ＲNA 的方法。经过多次试验
和对提取结果的综合比较，发现优化的 Trizol 法能
够快速简单有效的提取出高质量的总 ＲNA。每克
新鲜组织 ＲNA产量在 100—120 μg 之间，电泳分析
28sＲNA 荧光亮度约为 18sＲNA 亮度的 2 倍，
OD260 /280 值介于 1． 8—2． 0 之间，OD260 /OD230
值介于 2． 0—2． 2 之间。这就成为开展 ＲT-PCＲ、
ＲACE、CDNA文库构建，进行基因克隆和基因表达
分析等后续分子生物学实践操作的基础。
2 材料与试剂
2． 1 实验材料
6 年生竹节参植株，采自湖北省恩施市人参培
养基地。取新鲜竹节参根茎由自来水冲洗，70%乙
醇浸泡消毒，无菌水冲洗后经消毒滤纸吸干水分，于
液氮中快速冷冻并保存于 － 80 ℃。
2． 2 实验试剂
(1)CTAB提取液:2% CTAB(Hexadecyl trimeth-
yl ammonium Bromide ) ;2% β-Mercaptoethanol;2%
PVP (Polyvinylpyrrolidone ) ;100mmol /L Tris-Hcl
(pH8． 0) ;30mmol /L EDTA;2． 0mmol /L Nacl;氯仿-
异戊醇(24:1) ;4mol /L LiCl。(2)SSTE:1mmol /L
EDTA(pH8． 0) ;1． 0mol /L Nacl;0． 5% SDS;10mmol /
L Tris-Hcl(pH8． 0)。(3)用于总 ＲNA 提取操作使
用的塑料制品如 Eppendorf管(以下简称 EP管)、枪
头等用 0． 1%DEPC水，37 ℃处理 12 h，然后高压灭
菌后备用。玻璃器皿于 180 ℃干热灭菌 6 h，电泳槽
用 3%双氧水处理。总 ＲNA 提取操作中的配置的
溶液(Tris除外)均需经 0． 1%DEPC水，37℃处理 24
h，高压灭菌后方可使用。含 Tris的溶液用经高压灭
菌的 0． 1%DEPC处理的水配置。(4)Trizol购自 In-
vitrogen公司;Total ＲNA Kit试剂盒购自北京艾德莱
生物科技有限公司;PVP、DEPC、SDS 购自 AMＲES-
CO公司其它生化试剂均为国产分析纯。
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3 期 吴亚运，张绍鹏，赵小龙，等:竹节参根状茎总 ＲNA提取方法的研究与优化
3 实验方法和检测
3． 1 优化的 CTAB法
(1)提取操作开始前先将 CTAB 提取液分装，
每管 100 μL，置于水浴锅中 65 ℃预热 30 min。(2)
称 0． 1 g竹节参根状茎样本于经液氮预冷的研钵中
充分研磨至粉末，快速转移样本粉至装有 100 μL
CTAB提取液的 EP 管中，立即涡旋振荡 30 s，65℃
水浴锅中水浴 5min。(3)每管加入 100 uL 氯仿 /异
戊醇(24:1)充分振荡后，12 000 r /min 离心 20min，
转移上清液到新的 EP 管中，重复氯仿 /异戊醇(24:
1)抽提一次。(4)转移上清液到新的 EP管，加入上
清液 1 /2 体积的 4mol /L 氯化锂，－ 4℃过夜沉淀。
(5)4℃ 12 000 r /min 离心 20 min，弃上清液保留沉
淀。(6)向管中加入 500 μL 75%乙醇漂洗除去氯
化锂，室温 12 000 r /min 离心 2 min 弃上清液后加
入 500μL SSTE 溶解沉淀并将溶液转移到新的 EP
管中，向管中加入 500μL 氯仿 /异戊醇(24:1)混匀，
12 000 r /min 离心 20 min，取上清液到新的 EP 管
中，加入上清液 2 倍体积的无水乙醇 － 20 ℃沉淀 2
h，4 ℃ 12 000 r /min 离心 20 min沉淀 ＲNA，弃上清
液，加入 400 μL 70%乙醇洗涤沉淀，4℃ 12 000 r /
min 离心 10 min。再加入 400μL 无水乙醇洗涤沉淀
4℃ 12 000 r /min 10 min。(9)将得到的沉淀置于通
风橱中晾干，加入 30 μL DEPC水，－ 80℃保存［3］。
3． 2 优化的 Trizol法
(1)称 0． 1g 竹节参根状茎样本于经液氮预冷
研钵中充分研磨至粉末，快速转移样本粉末至装有
1mL Triaol裂解液的 EP管中，涡旋混匀后室温静置
10min。(2)4 ℃ 12 000 r /min 离心 10 min 弃沉淀，
收集上清液至新的 EP 管中。(3)向 EP 管中加入
200 μL 氯仿，50μL 乙酸钠(2mol /L) ，15μL B-巯基
乙醇，2% pvp5μL 涡旋混匀，冰浴 10 min，使反应
充分进行。(4)4 ℃ 12 000 r /min 离心 15 min，收集
上清液至新的 EP 管中，加入 70%高氯酸钠 200 μL
充分混匀后 4 ℃ 12 000 r /min 离心 10 min 弃沉淀
转移上清液至新的 EP管中。(6)向 EP管中加入与
上清液等体积的异丙醇和 200 μL 乙酸钠(3mol /L)
颠倒混匀 － 20℃沉淀 1h(7)4℃ 12 000r /min 离心
10 min 弃上清液 后用 1mL 75%乙醇洗涤沉淀在温
度为 4 ℃时，12 000 r /min 离心 5 min 弃上清液(重
复一次)。(8)将得到的沉淀置于通风橱中晾干，加
入 30 μL DEPC水，－ 80℃保存［3］。
3． 3 Total ＲNA Kit植物提取试剂法
(1)称 0． 1g 竹节参根状茎样本于经液氮预冷
研钵中充分研磨至粉末，快速转移样本粉末至装有
1mL TＲNsol裂解液的 EP 管中，涡旋混匀。(2)每
1mL TＲNsol中加入 200 μL 氯仿，剧烈震荡 15s，冰
上放置 5 min。室温 12 000 r /min 离心 10 min。(3)
将上层水相体积 80%转移至新的 EP 管中，加入水
相体积 70%的无水乙醇，混匀。(4)将混合液全部
注入 GBC吸附柱中，12 000 r /min 离心 30 s。(5)离
心后弃掉收集管中的废液，向 GBC 吸附柱中加入
500 μL wash buffer 1 室温 12 000 r /min 离心 1 min
后弃废液。(6)向 GBC 吸附柱中加入 600 μL wash
buffer 2，室温 12 000 r /min，离心 30 s 弃废液。(7)
再向 GBC吸附柱中加一次 600 μL wash buffer 2 离
心 30 s 弃废液 将 GBC 吸附柱放入新的收集管中。
(8)室温 12 000 r /min 空离 1 min弃废液，以彻底去
除吸附柱中的漂洗液。(9)将 GBC吸附柱放入新的
收集管中，向柱中加入 30 μL DEPC 水，室温放置 2
min，12 000 r /min 离心 1 min得到 ＲNA，－ 80℃保
存。
3． 4 竹节参总 ＲNA质量检测
3． 4． 1 ＲNA完整性检测
ＲNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在 1 × TBE中进
行，琼脂糖浓度为 1% (每 100mL 凝胶中加入 2
μLEB)。反应条件为:5 μL 上样量，180V 恒压，
20min，而后于紫外凝胶成像仪中观察总 ＲNA 完整
性。
3． 4． 2 ＲNA纯度及产率检测
运用紫外分光光度计测定总 ＲNA 样本在 230
nm、260 nm、280 nm 处的吸光。取 1 uL 总 ＲNA 溶
液，溶于 1mL 经 DEPC 处理的去离子水中，检测其
吸光度值。无污染的总 ＲNA 其 OD260 /OD280 为
1． 8—2． 0，OD260 /OD230 为 2． 0—2． 2。并可通过吸
光度值得出 ＲNA浓度:即每单位 OD260 的 ＲNA 浓
度为 40 μg /mL，ＲNA 产率公式: (μg /g)=［OD260
×稀释倍数 × 40 μg /mL × Vrna(mL) ］/材料质量。
3． 4． 3 ＲT-PCＲ
以 TaKaＲa公司 AMV反转录酶操作说明，合成
cDNA第一链，再以常规的 PCＲ 法扩增 cDNA 第二
链。PCＲ(25 μL)体系包括:2 μL cDNA，15mmol /L
MgCl2，1U Taq 酶，0． 2mmol dNTP，正向和反向引物
各 1mmol，根据 NCBI 人参 16S 核糖体 ＲNA 基因序
列设计其特异引物 D1、D2(引物序列为，正向引物
D1:5’-GCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’;反向引物
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D2:5’-TGTAGCCCAGGTCATAAGG-3’，上海桑尼生
物科技有限公司合成)。扩增条件为:cDNA 模版先
于 94 ℃变性 3 min，再经 35 个循环扩增(94℃变性
55 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min) ，最后 72℃延
伸 8min。扩增完成后取 4 组产物每组 5 μL 于 1%
琼脂糖凝胶电泳检测。
4 结果与分析
4． 1 总 ＲNA电泳检测
采用 1%琼脂糖凝胶电泳对总 ＲNA 的完整性
进行检测(见图 1)。
生物体内总 ＲNA中 rＲNA 含量最多，所以提取
组织的总 ＲNA 中得到最多的就是 rＲNA。rＲNA 在
植物组织中较多的是 5 s、18 s 和 28 s，其中 28 s 和
18 s含量多于 5 s，所以电泳检测中的关键特征条带
实际上就是 28 s 和 18 s 这两条带。28 s 大约为
4KNT而 18 s为 2KNTt，在细胞内 28 S 和 18 S 的分
子数相同的(来源于同一个转录本) ，28 S 的质量应
该是 18 S质量的 2 倍，电泳时插入 28 S中的核酸燃
料数量为 18 S的 2 倍，所以条带的荧光亮度也是 2
倍。据图 1 中结果表明，优化的 CTAB 法提取的总
ＲNA，18 s、28 s 两条带十分模糊，在条带周围存在
明显的拖带现象，说明得到的 ＲNA降解严重。Total
ＲNA Kit植物提取试剂法得到的总 ＲNA 能够看到
两条带，但是 28 s 和 18 s 条带的荧光亮度几乎相
等，未呈现出 2 倍的关系，说明提取得到的 ＲNA 有
部分降解。优化的 Trizol 法提取的总 ＲNA，在电泳
后呈现出两条明显的条带，28 s 和 18 s 两条特征条
带的荧光亮度接近 2 ∶ 1，表明总 ＲNA 没有降解，也
无明显的 DNA和蛋白质污染。
图 1 电泳图
4． 2 总 ＲNA质量检测
采用紫外分光光度计对总 ＲNA 的纯度及产率
进行检测结果见表 1。
纯净 ＲNA的 OD260 /OD280 比值的正常范围是
1． 8—2． 0，比值小于 1． 8 说明可能存在蛋白质或酚
类等有机物的污染，比值大于 2． 0 说明可能有残留
的 B-巯基乙醇。纯净 ＲNA 的 OD260 /OD230 比值
的正常范围是 2． 0—2． 2，比值大于 2． 2 说明 ＲNA已
水解为单核酸，比值小于 2 说明可能存在次生代谢
产物(如萜类)干扰，通过吸光度值得出 ＲNA 浓度
即每单位 OD260 的 ＲNA为 40 μg /mL，而 ＲNA产率
(ug /g)=［OD260 × 稀释倍数 × 40 μg /mL × Vrna
(mL) ］/材料质量。由表 1 中结果表明，优化的 Tr-
izol法提取的总 ＲNA纯度较好，适宜于后续的实验
研究。
表 1 纯度与产率
方法
OD
230 nm 260 nm 280 nm
OD260 /OD280
OD260 /
OD230
产率 /(μg /g)
优化的 CTAB法 0． 007 0． 012 0． 008 1． 50 1． 71 48
Total ＲNA Kit植物提取试剂法 0． 009 0． 017 0． 010 1． 70 1． 89 68
优化的 Trizol法 0． 014 0． 029 0． 015 1． 93 2． 07 116
4． 3 ＲT-PCＲ
以优化的 Trizol法提取的竹节参根状茎总 ＲNA
反转录合成 cDNA为模版，人参 16S 核糖体 ＲNA基
因特异引物 D1、D2 为引物进行 ＲT-PCＲ，预期扩增
的目的片段长度为 500 bp。实验结果表明(图 2) ，
已成功扩增出预计的目的片段，且目的片段条带清
晰、长度相适，琼脂糖凝胶上亦未出现非特异产物。
由此说明，优化的 Trizol 法提取得到了适宜于开展
分子克隆和基因表达等后续分子生物学实验与研究
所需的高质量 ＲNA。
5 讨论
在竹节参根状茎总 ＲNA的提取过程中，由于其
质地坚硬，富含植物纤维，磨样困难。且根状茎组织
中多糖、多酚含量高，在生长成熟过程中积累了许多
的水解酶和色素，使得常规的提取方法无法从竹节
参中获得高质量的 ＲNA。探究其原因，是由于没有
特殊针对性的试剂来去除这些杂质，导致 ＲNA的损
41
3 期 吴亚运，张绍鹏，赵小龙，等:竹节参根状茎总 ＲNA提取方法的研究与优化
图 2
失。本研究中提取总 ＲNA效果最好的方法，优化的
Trizol法，在多次常规方法操作经验的基础上，有针
对性的增加选用了除杂试剂、改进了实验操作步骤。
检验结果表明，实验提取得到了高质量的总 ＲNA。
酚类物质:在氧化条件下易被氧化成醌类。在
常规实验操作中，有醌类物质的存在就会使处理液
变为褐色，且颜色会随氧化程度的增加而加深，结果
就是醌类与 ＲNA发生不可逆结合并产生沉淀，导致
ＲNA的大量损失。针对这种情况，在本次操作中加
入了 PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)和 B-巯基乙醇。B-
巯基乙醇是强还原剂，能够产生还原环境防止多酚
被氧化。PVPP 是多酚类化合物的螯合剂，其中的
O = C-N =基有很强的结合多酚化合物的能力。这
两种试剂相互协作，B-巯基乙醇产生还原环境，使多
酚保存原状并与 PVPP 充分结合，由后续的抽提步
骤将它们去除［4］。在实验操作中发现，单一的加入
B-巯基乙醇或是 PVPP都无法有效的抑制多酚物质
的氧化，两种试剂一起加入效果最好。多糖类:多糖
在竹节参的根状茎中含量接近 50%，它的理化性质
与 ＲNA相似，使得它们很难分离。在提取过程中，
常规的氯仿分层抽提在除多糖的同时也会有 ＲNA
的损失。在沉淀 ＲNA 时，会产生大量白色沉淀，这
些沉淀难溶于水或是溶解后产生黏稠状溶液，由于
多糖可抑制多种酶的活性，受到多糖污染的 ＲNA根
本无法用于下一阶段的分子研究［5］。针对这种情
况，在本次操作中加入了大量的乙酸钠，营造出高浓
度的钠离子环境，在这种条件下，多糖会溶解在高浓
度的盐溶液中而 ＲNA则会析出，通过氯仿和醇的抽
提，可〗以很好的去除多糖杂质。在常规提取过程
中，蛋白质是另外一个重要的障碍，在 Trizol 裂解液
中，含有异硫氰酸胍、B-巯基乙醇等蛋白质变性剂，
后续步骤中的氯仿也能变性蛋白质［6-7］。但 Trizol
法的工作容量是有限度的，当蛋白质含量较为丰富
时，有的蛋白质就不会沉淀在中间层，而是溶解在上
层液中。在竹节参根状茎 ＲNA提取常规操作中，即
使反复的加入氯仿分层抽提多次，依然可以清晰看
到中间层的白色蛋白质沉淀，并且加入异丙醇后，会
产生白色絮状沉淀，说明依然有蛋白质残留。针对
这种情况，在本次试验操作中加入了 70%高氯酸钠
溶液，在此溶液中 ＲNA 的溶解度大于蛋白质，使蛋
白质能在离心后沉淀下来。取上清液后加入 2 倍体
积无水乙醇，ＲNA会在其中沉淀而残留的蛋白质会
溶解在无水乙醇中，再次离心保留沉淀，就能较好的
除去蛋白质。横向对比文中的 3 种方法，在相同的
实验条件下。优化的 Trizol 法，操作更简便、耗时更
短，样本处理液始终处于强变性剂中。这些特点降
低了 ＲNA在提取过程中被降解的概率，进一步确保
了实验结果的有效性。
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