全 文 ：收稿日期：２０１２－０８－２８
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７０３１３）；国家自然科学基金项目（２１２７２１３６）
通信作者：程　凡（１９７３－），副教授，博士，主要研究方向为天然药物化学．Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｃｙ１３５１＠１６３．ｃｏｍ
ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定人血草中黄连碱和白屈菜红碱的含量
徐　帮　郭玲芝　程　凡　汪鋆植　邹　坤
（天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学），湖北 宜昌　４４３００２）
摘要：目的：建立人血草干燥全草中黄连碱和白屈菜红碱含量的测定方法．方法：采用反相 ＨＰＬＣ
法．色谱柱为ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ－ＡＡ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），以乙腈－水（０．２％磷酸＋０．２％三乙
胺）体系梯度洗脱，检测波长２８０ｎｍ，流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１，柱温３０℃．结果：黄连碱在１３．２４～
２６４．８μｇ·ｍＬ
－１质量浓度范围内面积与浓度呈良好的线性关系（ｒ＝０．９９９　７）；加样回收率为
９９．４％，ＲＳＤ为１．１％（ｎ＝６）．白屈菜红碱在６．３６～１２７．２μｇ·ｍＬ
－１质量浓度范围内面积与浓度
呈良好的线性关系（ｒ＝０．９９９　８）；加样回收率为１０１．６％，ＲＳＤ为１．２％（ｎ＝６）．结论：本法简单、准
确，重复性好，可用于人血草药材的质量．
关键词：反相高效液相色谱法；　人血草；　黄连碱；　白屈菜红碱；　含量测定
中图分类号：Ｒ２９１．２　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７２－９４８Ｘ（２０１３）０４－０１０３－０３
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｐｔｉｓｉｎｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ　ｉｎ
Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ　Ｌａｓｉｏｃａｒｐｕｍ （Ｏｌｉｖ．）Ｆｅｄｄｅ　ｂｙ　ＲＰ－ＨＰＬＣ
Ｘｕ　Ｂａｎｇ　Ｇｕｏ　Ｌｉｎｇｚｈｉ　Ｃｈｅｎｇ　Ｆａｎ　Ｗａｎｇ　Ｊｕｎｚｈｉ　Ｚｏｕ　Ｋｕｎ
（Ｈｕｂｅｉ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖ．，Ｙｉｃｈａｎｇ
４４３００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｓ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ　ａｎｄ　ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ　ｉｎ　Ｓｔｙｌｏ－
ｐｈｏｒｕｍ　ｌａｓｉｏｃａｒｐｕｍ （Ｏｌｉｖ．）Ｆｅｄｄｅ．Ａ　ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ－ＡＡ（４．６ｍｍ ×
２５０ｍｍ，５μｍ）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ（０．２％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ＋０．２％ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）ｉｎ
ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｍｏｄｅ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｉｓ　ｓｅｔ　２８０ｎｍ．Ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｉｓ　１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１　ａｎｄ　ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐｅｒ－
ａｔｕｒｅ　ｉｓ　ｓｅｔ　ａｔ　３０℃．Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ　ｉｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ　１３．２４－２６４．８μｇ·
ｍＬ－１（ｒ＝０．９９９　７）．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｓ　９９．４％ｗｉｔｈ　ＲＳＤ　１．１％．Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ
ｉｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ　６．３６－１２７．２μｇ·ｍＬ
－１（ｒ＝０．９９９　８）．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｓ　１０１．６％
ｗｉｔｈ　ＲＳＤ　１．２％．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ａｎｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｓｔｙｌｏｐｈｏ－
ｒｕｍ　ｌａｓｉｏｃａｒｐｕｍ （Ｏｌｉｖ．）Ｆｅｄｄｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＲＰ－ＨＰＬＣ；　Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ　ｌａｓｉｏｃａｒｐｕｍ （Ｏｌｉｖ．）Ｆｅｄｄｅ；　ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ；　ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅ；　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅ－
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
　　人血草Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ　ｌａｓｉｏｃａｒｐｕｍ（Ｏｌｉｖ．）Ｆｅｄｄｅ
是罂粟科金罂粟属植物，又名豆叶七，人血七、野人血
草、大金盆．产湖北西部、陕西南部和四川东部．以全
草入药，有活血、调经、舒筋、散淤、止痛等功效，用于
月经不调，跌打损伤［１－２］．人血草作为民间药在湖北省
及周边民间应用历史悠久，范围广范．本实验室前期
对人血草药材的显微特征、理化鉴别、水分、总灰分、
酸溶性浸出物、醇溶性浸出物进行了相关质量标准的
第３５卷　第４期
２０１３年８月
三峡大学学报（自然科学版）
Ｊ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖ．（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．４
Ａｕｇ．２０１３
研究［３］．研究表明，人血草的主要化学成分为四氢黄
连碱、血根碱、白屈菜红碱、黄连碱别隐品碱、原阿片
碱等生物碱类化合物．其中黄连碱和白屈菜红碱的含
量较大，且为其主要的生理活性成分［４－５］．本文采用高
效液相色谱法，对人血草药材中黄连碱和白屈菜红碱
进行了含量测定，通过试验分析，结果表明该方法简
单、准确、重现性好，可作为质量控制的方法．
１　仪器与试药
１．１　仪器
Ｖａｒｉａｎ２１０分析型高效液相色谱系统２１０型二元
梯度泵，２１０ 型紫外检测器，美国 Ｖａｒｉａｎ 公司；
ＭＥ２１５Ｓ型１／１０万电子天平，德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司；
Ｓ－３１００紫外分光光度计，韩国Ｓｉｎｃｏ公司；旋转蒸发
仪，日本ＥＹＥＬＡ．
１．２　试剂与试药
黄连碱和白屈菜红碱均为本实验室自人血草中
分离并鉴定，以 ＨＰＬＣ面积归一法测定其纯度数大
于９８％；甲醇和乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试
剂均为分析纯．人血草全草分别采集自中国湖北省神
农架、五峰、长阳，经本实验室杨进副教授鉴定为
Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ　ｌａｓｉｏｃａｒｐｕｍ（Ｏｌｉｖ．）Ｆｅｄｄｅ．原植物及
药材标本现保存于天然产物研究与利用湖北省重点
实验室（三峡大学）．
２　方法与结果
２．１　色谱条件
ＹＭＣ－Ｐａｃｋ　ＯＤＳ－ＡＡ色谱柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，
５μｍ）；流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ
－１；检测波长２８０ｎｍ；进样
量２０μＬ；柱温３０℃；流动相为乙腈（Ｂ）－水相（０．２％
磷酸＋０．２％三乙胺）（Ａ）梯度洗脱，０～１ｍｉｎ，２０％
Ｂ，８０％Ａ；１～１０ｍｉｎ，４０％Ｂ，６０％Ａ；１０～２０ｍｉｎ，
５０％Ｂ，５０％Ａ；２０～３０ｍｉｎ，１００％Ｂ．
２．２　试验溶液的制备
２．２．１　对照品溶液的制备
精密称取对照品黄连碱６．６２ｍｇ和白屈菜红碱
３．１８ｍｇ，置于１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至
刻度，摇匀，制成混合对照品贮备液．以０．２２μｍ微孔
滤膜过滤，低温避光保藏备用．
２．２．２　供试品溶液的制备
取人血草药材粉末（过４０目筛，５０℃烘干）约３．０
ｇ，精密称定，置于２５０ｍＬ圆底烧瓶中，加入６倍量的
９５％乙醇溶液，加热回流２次，每次６０ｍｉｎ，收集醇溶
液，蒸干，残渣用５０ｍＬ三蒸水溶解，用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１
磷酸调ｐＨ至３～４，静置过夜，过滤，用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１
氢氧化钠溶液调ｐＨ至７～８，用等量氯仿萃取３次，
收集氯仿液，回收氯仿，残渣用甲醇溶解于５ｍＬ容量
瓶中，摇匀，定容，得供试品溶液．以０．２２μｍ微孔滤
膜过滤，低温避光保藏备用．
对照品以及供试品的色谱图如图１所示．
１．黄连碱；２．白屈菜红碱
图１　对照品和供试品的 ＨＰＬＣ图
２．３　线性关系试验
分别吸取对照品贮备液０．２，０．４，０．６，１，２，４ｍＬ
置于１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按
２．１项下色谱条件测定，各进样２０μＬ，以色谱峰面积
（Ｙ）为纵坐标，以黄连碱和白屈菜红碱的浓度（Ｘ）为
横坐标，进行线性回归．黄连碱和白屈菜红碱的回归
方程分别为：
Ｙ ＝１　１３２．３　Ｘ－３４，ｒ＝０．９９９　７
（线性范围为１３．２４～２６４．８μｇ·ｍＬ
－１） （１）
Ｙ ＝２　０８８．４　Ｘ－２３，ｒ＝０．９９９　８
（线性范围为６．３６～１２７．２μｇ·ｍＬ
－１） （２）
２．４　精密度试验
精密吸取对照品贮备液６份，按２．１项下色谱条
件连续进样，进样量２０μＬ，每个浓度进样３次，测定
黄连碱和白屈菜红碱的色谱峰面积，计算ＲＳＤ（ｎ＝
６）分别为１．８％，１．６％．
２．５　重复性试验
４０１ 三 峡 大 学 学 报（自 然 科 学 版）　　　　　　　　　　　　　　２０１３年８月
　　取人血草药材粉末５份，每份约３．０ｇ，精密称
定．按２．２．２项下方法平行制备，按２．１项下色谱条
件进行分析，测定黄连碱和白屈菜红碱的色谱峰面
积，计算ＲＳＤ（ｎ＝５）分别为２．５％，２．３％．
２．６　稳定性试验
精密吸取供试品溶液２０μＬ，分别于０，４，１２，２４，
３６，４８ｈ进样分析，测定黄连碱和白屈菜红碱的色谱
峰面积，计算ＲＳＤ（ｎ＝６）分别为１．３％，１．２％，结果
表明４８ｈ内供试品溶液稳定性良好．
２．７　回收率试验
取已知含量的样品６份，每份约２．０ｇ，精密称
定．各样品分别加入对照品贮备液适量，按２．２．２项
下方法平行制备，按２．１项下色谱条件，分别进样２０
μＬ进行测定．计算回收率结果见表１．
表１　黄连碱和白屈菜红碱加样回收率（ｎ＝６）
成分
取样量
／ｇ
样品中量
／ｍｇ
加入量
／ｍｇ
测得量
／ｍｇ
回收率
／％
平均值
／％
ＲＳＤ
／％
黄
连
碱
０．９９９　０　 ９．７０６　 ４．９８２　１４．７０７　１００．２
１．０００　１　 ９．７１４　 ４．９８２　１４．６２８　 ９９．３
１．０００　７　 ９．８４３　 １０．２５６　１９．９７１　 ９８．７
０．９９９　８　 ９．６４１　 １０．２５６　１９．９６４　１００．７
１．００１　４　 ９．８２５　 ２０．３４５　２９．９５４　 ９７．８
１．０００　６　 ９．７７３　 ２０．３４５　３０．０８９　 ９９．７
９９．４　 １．１
白
屈
菜
红
碱
０．９９９　２　 ０．８１９　 ０．４２６　 １．２６１　 １０１．９
０．９９９　５　 ０．８２６　 ０．４２６　 １．２５０　 ９９．７
１．０００　３　 ０．８５３　 １．０５２　 １．９３８　 １０３．２
０．９９９　４　 ０．８０６　 １．０５２　 １．８６４　 １００．８
１．０００　６　 ０．８７１　 ２．１３５　 ３．０１９　 １０１．５
０．９９９　１　 ０．７９６　 ２．１３５　 ２．９５１　 １０２．５
１０１．６　１．２
２．８　样品测定
取不同产地的人血草药材各３份，每份约３．０ｇ，
精密称定，按２．２．２项下方法平行制备，按２．１项下
色谱条件进样分析测定，根据标准曲线计算样品中黄
连碱和白屈菜红碱的质量分数．结果见表２和表３．
表２　不同产地人血草样品中黄连碱质量分数
供试品
来源
含量
／（ｍｇ·ｇ
－１）
平均含量
／（ｍｇ·ｇ
－１）
ＲＳＤ
／％
神农架
９．９８２
９．６５５
９．８４１
９．８２６　 １．６７
五峰
９．５８１
９．３３９
９．３５２
９．４２４　 １．４４
长阳
９．６９８
９．３８２
９．６３３
９．５７１　 １．７４
表３　不同产地人血草样品中白屈菜红碱质量分数
供试品
来源
含量
／（ｍｇ·ｇ
－１）
平均含量
／（ｍｇ·ｇ
－１）
ＲＳＤ
／％
神农架
０．９０８
０．９３２
０．９３８
０．９２６　 １．７１
五峰
０．８５９
０．８８５
０．８６９
０．８７１　 １．５１
长阳
０．７４２
０．７４８
０．７６９
０．７５３　 １．８８
３　讨　论
为了能在适宜的分析时间内获得指标成份的完
全分离，在实验中对流动相体系进行了反复摸索，分
别用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－醋酸水、乙腈－磷酸水、乙
腈－三乙胺水、乙腈－磷酸－三乙胺水等体系进行洗脱，
发现甲醇－水洗脱基线不平稳，分离度差，乙腈－醋酸
水、乙腈－磷酸水和乙腈－三乙胺水的分离效果同乙腈－
水体系的分离效果相比并没有进一步改善，而以乙
腈－磷酸－三乙胺水为最佳，黄连碱和白屈菜红碱的峰
形较好，分离度较高．本实验采用的供试品溶液为氯
仿萃取的粗提液，为保护色谱柱选用流动相梯度洗
脱，可将强保留物质洗脱下来．
氯仿萃取之前的ｐＨ 为７～８，若溶液ｐＨ 过高，
碱性太强容易产生乳化现象，对生物碱的提取不利．
本试验同时测定黄连碱和白屈菜红碱，在选定的
色谱条件下，方法的精密度及重复性良好，稳定性强，
准确度高，故可作为人血草药材质量控制的标准．
参考文献：
［１］　中国科学院中国植物编辑委员会．中国植物志：第３２卷
［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９９．
［２］　方志先，廖朝林．湖北恩施药用植物志（上）［Ｍ］．武汉：
湖北科学出版社，２００６：３８３．
［３］　朱靖静，杨　进，邹　坤，等．人血草质量标准研究［Ｊ］．
中国民族民间医药，２００９，１５：２２－２４．
［４］　Ｓｌａｖｉｋ　Ｊ，Ｈａｎｕｓ　Ｖ，Ｓｌａｖｉｋｏｖａ　Ｌ．Ａｌｋａｌｏｉｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｒａ－
ｖｅｒａｃｅａｅ．９１．Ａｌｏｋａｌｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ　ｌａｓｉｏｃａｒｐｕｍ
（Ｏｌｉｖ．）Ｆｅｄｄｅ［Ｊ］．Ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９１，５６（５）：１１１６－１１２２．
［５］　中华本草编委会．中华本草：第９卷［Ｍ］．上海：上海科
学技术出版社，１９９９：６７２．
［责任编辑　周文凯］
５０１第３５卷　第４期　　　　　　　　　　　　　徐　帮，等　ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定人血草中黄连碱和白屈菜红碱的含量