全 文 ：　第 29 卷 第 4 期
2008 年 7 月
武汉大学学报(医学版)
Medical Journal of Wuhan Univer sity
Vo l.29 No.4
Jul , 2008
课题来源:湖北省科技攻关项目(编号:2006AA301B59)
作者简介:周必发 ,男 , 1980- ,医学硕士生 ,主要从事中西医结合治疗糖尿病的研究
通讯作者:张莹雯 ,女 , 1963- ,医学博士 ,教授 ,硕士生导师 ,主要从事中西医结合治疗糖尿病的研究
当归补血汤对高糖条件下系膜细胞
增殖及细胞外基质表达的影响
周必发　张莹雯
武汉大学中南医院中西医结合科　湖北　武汉　430071
摘要　目的:研究当归补血汤对培养在高糖条件下系膜细胞(GMC)增殖及细胞上清液中层粘连蛋白(LN)、Ⅳ
胶原纤维(Co lⅣ)、纤维连接蛋白(FN)的表达的影响 , 探讨其在糖尿病肾病(DN)防治中的意义。方法:① 采用酶
联免疫吸附试验(ELISA)测定经体外培养的大鼠肾小球系膜细胞在各种处理因素的作用下上清液中 LN 、Ⅳ型胶
原及 FN 的表达情况;②利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法动态观察各种处理因素的作用下各组 GMC 增殖情
况。结果:高糖能明显刺激体外培养的 GMC 增殖 ,同时促进 GMC 分泌 FN 、LN 和 ColⅣ(P<0.05 或 P <0.01)。
而当归补血汤能抑制 GMC 增殖及 GMC 分泌 FN、LN 和 ColⅣ, 并呈一定量效关系(P<0.05 或 P<0.01), 即随糖
或药物浓度的增加 , GMC 增殖 、GMC 分泌 FN 、LN 和 ColⅣ的能力也相应增加或减少。结论:高糖可促进 GMC 增
殖 、细胞外基质(ECM)蛋白分泌 , 当归补血汤能明显抑制高糖条件下 GMC 增殖 、及其分泌 FN 、LN 和 ColⅣ, 说明
当归补血汤能直接抑制 GMC 增殖及分泌 ECM , 从而发挥预防肾小球纤维化及硬化的发生 、发展 , 进而延缓 DN 的
进展。
关键词　当归补血汤;层粘连蛋白;纤维连接蛋白;Ⅳ型胶原纤维
中图分类号　R587.2　文献标识码　A　文章编号　1671-8852(2008)04-0476-06
Effects of Astragalus and Angelica Mixture on the Proliferation of
Glomerular Mesangial Cells and Expression of Extracellular
Matrix Cultured in High Glucose
ZHOU Bifa , ZHANG Yingwen
Dept.o f Integrated Tradi tional Chinese and Western Med icine , Zhongnan Hospit ial o f
Wuhan Universi ty , Wuhan 430071 , China
Abstract
Objective:To investigate the ef fect of ast ragalus and angelica mix ture (Angelicae Sinensis
Decoction for Supplementing Blood , a tradi tional he rbal remedies of China)on g lomerular me-
sangial cel l(GMC)proliferat ion and the expression of laminin(LN), collagen type Ⅳ(ColⅣ),
fibronectin(FN)in vit ro under high gluco se.Methods:①Enzyme linked immunoadso rdent assay
(ELISA)was adopted to dete rmine the expression of LN , ColⅣ and FN in cultured rat glome ru-
lar mesang ial cells;②The thiazoly l blue tet razolium bromide (MT T)co lorimetric method w as
used to obse rv e the glome rular mesang ial cell proliferation.Results:In vit ro cultured glomerular
mesangial cells w ere obviously pro liferating under the stimulat ion o f high g lucose , which also
promo te LN , ColⅣand FN secretion by glomerular mesangial cell s(P <0.05 or P <0.01);but
DOI :10.14188/j.1671-8852.2008.04.003
　第 4 期 周必发 , 等.当归补血汤对高糖条件下系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响
astragalus and angelica mix ture can inhibit GMCs proliferating and secreting LN , ColⅣ and FN
in a dose-ef fect manner.Conclusion:High glucose can promote GMC proliferation and secretion
of ex t racellular matrix , but Angelicae Sinensis Decoct ion fo r Supplementing Blood could inhibi t
it , which could be helpful fo r preventing of the prog ression o f diabetic nephropathy .
Key Words　Angelicae Sinensis Decoction fo r Supplementing Blood;Laminin;Collagen type
Ⅳ;Fibronectin
　　糖尿病肾病(diabet ic nephropathy , DN)是糖尿
病(diabetes melli tus , DM)最严重的慢性微血管并
发症之一 ,其基本病理改变为早期肾小球和肾小管
组成成分的肥大 ,及其基底膜增厚(g lomerular base-
ment membrane , GBM),肾小球系膜外基质(ext ra-
cellular matrix , ECM)进行性积聚 ,同时伴有肾小
管-间质纤维化和弥漫性肾小球间与结节性肾小球
肥大 、硬化。而肾小球系膜细胞(glomerular me-
sangial cell , GMC)是肾小球固有细胞中合成 ECM
最强的细胞 , GMC 增生 、肥大及分泌 ECM 的进行
性积聚最是导致肾小球硬化的特殊间质效应细胞 。
ECM 的主要成分由层粘连蛋白(Laminin , LN)、Ⅳ
胶原纤维(Collagen type Ⅳ , Co lⅣ)和纤维连接蛋
白(Fibronectin , FN)及蛋白多糖构成 ,因此 , LN 、
ColⅣ和 FN 等动态变化可反映 ECM 及其相关物质
的合成 ,特别在 DN 中 ,其可作为研究早期病理变化
的重要指征。DN 属中医学“消渴”证中的“下消”范
畴 ,多为肝肾亏虚 ,瘀阻络脉 ,临床多采用益气养阴 、
滋补肝肾 、生津止渴 、活血等中药治疗 。本实验通过
体外培养的大鼠 GMC ,研究了当归补血汤含药血清
对高糖条件下 GMC 增殖以及合成分泌 LN 、Co lⅣ
和 FN的影响 ,以探讨当归补血汤在预防 DN 发生 、
发展及 DN 时肾小球纤维化和硬化中的作用 ,并为
临床应用当归补血汤治疗 DN 提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　主要实验材料及试剂
1.1.1　药材及试剂　当归 、黄芪及当归补血汤(由
黄芪 、当归组成 , 5 ∶1),按要求称取后 ,水浸泡 30
min后 ,煎 3次 ,每次煎开 10 min 后过滤取汁 ,将 3
次混合 ,同样方法准备好当归 、黄芪 ,并统一浓缩至 2
kg/L 药液 ,由武汉大学中南医院中药房煎制;苯那
普利(商品名:洛汀新 ,由北京诺华制药股份有限公
司生产 ,批号:03055);MTT 凌飞科技 、RPM I 1640
Hyclon公司(美国);胎牛血清(Fetal bovine serum ,
FBS)由杭州四季青生物工程材料公司提供;LN 、Col
Ⅳ和 FN 抗体由武汉博士德公司提供;超净工作台
(苏州净化);37 ℃5%CO 2恒温培养箱(美国 T her-
mo Forma公司);G ENIOS 多功能酶标仪(奥地利
TECAN公司)。
1.1.2　实验动物　SD大鼠由武汉大学实验动物中
心提供[体重 180-200 g ,4-6周龄 ,雌雄各半 ,许可证
号:SCXK(鄂)2003-00004] 。
1.2　实验方法
1.2.1　含药血清的制备　健康SD大鼠40只 ,随机
分为 4组 ,即:正常组(不给药)、当归组(每日以 1.2
g/kg 当归灌胃)、黄芪组(每日以 2.4 g/kg 黄芪灌
胃)、当归补血汤组(每日以 3.6 g/kg 当归补血汤灌
胃)、苯那普利组(每日以 10 mg/kg 苯那普利灌胃),
正常组每日灌相同容量蒸馏水 , 1次/d ,各组自由饮
食 ,连续 7 d ,在末次灌胃 2 h 麻醉后 ,在无菌条件下
经腹主动脉采血 ,离心取血清 ,56 ℃水浴 30 min 灭
活补体 ,经 0.22 μm孔径的针头滤器过滤除菌 ,分装
冻存备用。
1.2.2　系膜细胞的培养　取正常成年 SD 大鼠 ,在
无菌条件下取肾 ,去肾胞膜 ,将皮质剪碎后用 0.25%
胰蛋白酶溶液消化 , 当细胞分散成单个时 ,用 FBS
终止消化 ,加适量培养基吹匀接种于含 20%的 FBS 、
10万 U/L 青霉素 、100 g/L 链霉素的 RPMI 1640培
养基中 ,分瓶后置 37 ℃、5%CO 2的饱和湿度的细胞
培养箱中培养 ,至 90%汇合时 ,用 0.25%胰蛋白酶
溶液消化传代。
1.2.3　系膜细胞鉴定　①倒置显微镜下观察其典
型的形态学特征:培养 18 d 后 ,贴壁的肾小球周围
长出梭形或星形特点的细胞 ,随着时间延长 ,细胞铺
满瓶底(见图 1 、图 2);②功能鉴定:在细胞上滴加血
管内皮素后 ,细胞呈强烈的收缩反应 ,由梭形 、星形
或不规则形变为圆形;③超微结构观察:透射电镜下
GMC也成星形或梭形 ,胞质内有少量分布的线粒
体 、粗面内质网 、高尔基复合体器外 ,还有最为特征
性的是位于胞膜下和细胞突起向内的微丝结构 ,核
居中央 ,多呈圆形成或卵圆形 ,核染色质较为稀疏
(见图 3 ,4)。
1.2.4　实验分组　NC 组(常规培养 ,仅 20%正常
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武汉大学学报(医学版) 第 29 卷
图 1　倒置显微镜下瓶壁系膜细胞长满时的状况
Fig.1　The condition of glomerular mesangial cell grow
full under inverted microscope.
图 2　倒置显微镜下系膜细胞传代后第 1天时生长状况
Fig.2 　The growth condition of glomerular mesangial
cell after the first passage under inverted micro-
scope
图 3 、图 4　透射电镜下 GMC超微结构
Fig.3 , 4　The ultramicrostructure of glomerular mesang-
ial cell unde transmission electron microscope
大鼠血清);LG组(5.6 mmo l/L D-glucose +24.4
mmol/ L 甘露醇+20%FBS)、HG组(30 mmol/L D-
g lucose+20%FBS)、DG(10%当归含药血清 +30
mmol/ L D-gluco se+10%FBS)、HQ 组(10%黄芪含
药血清+30 mmo l/L D-g lucose+10%FBS)、DHG5
组(5%当归补血汤含药血清+30 mmol/ L D-glu-
co se+15%FBS)、DHG10组(10%当归补血汤含药
血清+30 mmo l/L D-glucose +10% FBS)、DHG20
组(20%当归补血汤含药血清+30 mmol/L D-glu-
co se)、BN组(10%苯那普利含药血清+30 mmo l/L
D-glucose+10%FBS)。
1.2.5　MT T 法检测不同处理因素对肾小球系膜细
胞增殖的影响　长满的 GMC用 0.25%胰蛋白酶消
化后 ,再用培养液稀释为单个细胞悬液 ,以 4×104细
胞密度接种于 96孔培养板 。细胞完全贴壁后 ,用含
1%胎牛血清的 RPM I 1640培养液同步化细胞 24
h ,实验分组同 1.2.4 ,每组浓度设 6 个复孔 ,共种 3
个板(24 、48和 72 h 各一块板),其他条件相同 。将
培养板移入 CO2孵箱中 ,分别培养到预定时间后 ,去
上清 ,每孔加入 MT T 溶液 10 μl(5 g/L),37 ℃避光
继续孵育 4 h ,终止培养。吸去孔内上清液 ,每孔加
入 100 μl DM SO溶解液振荡 10 min ,待结晶物充分
溶解后 ,酶标仪上检测各孔光吸收值(A 492),将所得
结果列入表 1 。
表 1　各种处理因素作用于 GMC 24 , 48 和 72 h时 ,
GMC增殖情况( x±s , n=6)
Tab.1　GMC proliferation when treated for 24 , 48 and 72 h
分组 24 h 48 h 72 h
NC 0.234±0.028■ 0.323±0.050 0.424±0.044
LG 0.248±0.031■ 0.425±0.049■ 0.726±0.047
HG 0.439±0.046 0.743±0.059▼ 1.346±0.045▼*
DG 0.252±0.042 0.525±0.054 0.754±0.035■﹡
HQ 0.247±0.041 0.514±0.049■ 0.735±0.040■﹡
BN 0.246±0.035 0.502±0.041 0.746±0.033■﹡
DHG5 0.264±0.043 0.585±0.038 1.129±0.048
DHG10 0.243±0.045 0.423±0.035■ 0.715±0.042■
DHG20 0.240±0.041 0.421±0.036■ 0.693±0.026▼
　■P<0.05 , ▼ P<0.01 ,同时间点与 HG 相比;
﹡ P<0.05 , *P<0.01 ,与 DHG20相比
1.3.2　统计学处理　实验数据用 SPSS 13.0 统计
软件进行统计分析 ,以均数±标准差表示( x±s),多
组数据间比较用 ANOVA 分析 ,以 P <0.05为差异
有统计学意义。
2　结果
2.1　GMC增殖情况　从实验结果可以看出 ,在无
糖及低糖条件下 ,GMC 有一定的增殖能力 ,但各组
间无显著性差异(P >0.05);在高糖作用下其增殖能
力明显增强 ,而且随着作用的时间的延长 ,GMC 增
殖更明显(P<0.05或 P <0.01),说明高糖有促进
细胞增殖作用;从实验还可以看出 ,不同的含药血清
对高糖条件下 GMC 增殖有一定的抑制作用 , 以
DHG20组最为明显 , 并成时间和剂量关系(P <
0.05或 P<0.01),说明较高浓度的当归补血汤能抑
制高糖条件下的 GMC增殖。
2.2　酶联免疫吸附测定(Enzyme l inked immunoad-
sordent assay , ELISA)法测量培养细胞上清液中
LN、FN及 ColⅣ的含量　结果见表 2。
2.3　在不同因素的作用下各组细胞上清液中 FN 、
LN 和 ColⅣ表达情况　从实验结果可以看出 ,在正
常情况下 ,体外培养的 GMC 能分泌 ECM 成分 ,但
分泌的量不随时间而发生太大变化 ,但在高糖环境
下 GMC分泌 FN 、LN 和 ColⅣ的量明显增加 ,其分
泌表现为逐渐升高的趋势 ,并在 72 h 内维持更高水
平 ,各组间差异显著(P<0.05或 P<0.01),说明高
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　第 4 期 周必发 , 等.当归补血汤对高糖条件下系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响
糖对GMC分泌 ECM 有明显的促进作用;从实验结
果还可以看出 ,不同的含药血清对高糖条件下 GMC
分泌细胞外基质成分有一定的抑制作用 ,以 DHG20
组最为明显 ,并成时间和计量关系 P<0.05或 P <
0.01)。其它药物治疗组在 48 h和 72 h与 HG相比 ,
也能明显抑制 FN 、LN 和 ColⅣ表达(P <0.05),与
DHG20组相比 ,其抑制作用有差别(P <0.05),而其
它药物治疗组间未见明显差异(P>0.05)。
表 2　各种处理因素作用于 GMC在 24 , 48 和 72 h时 ,培养液中 LN、FN及 ColⅣ的含量(μg/ L , x±s , n=3)
Tab.2　LN , FN and ColⅣ secreation by GMC treated for 24 , 48 and 72 h
组别 24 h 48 h 72 h
LN FN ColⅣ LN FN ColⅣ LN FN ColⅣ
NG 19.7±3.5■ 14.3±2.0 8.3±2.4■ 21.7±3.8■ 21.0±3.6■ 14.3±2.1■ 23.3±3.8▼ 25.9±4.1▼ 20.3±1.7▼
LG 20.4±3.2■ 14.4±2.2 8.6±2.1■ 22.3±4.4■ 21.4±3.5■ 15.7±2.3■ 24.6±4.6▼ 26.7±3.5▼ 21.5±2.3▼
HG 28.2±3.9 15.4±2.3 10.5±2.2 31.4±4.2 26.5±3.8 20.5±2.1 35.4±4.5 37.5±3.8 31.2±2.5
DG 22.2±4.3■ 14.7±2.3 9.4±2.4 25.6±4.3■ 23.5±3.4■ 17.5±2.2■ 27.6±4.5■ 32.4±3.5▼ 26.7±2.7■
HQ 21.9±2.2■ 14.6±2.3 9.3±2.6 25.4±4.3■ 23.4±3.5■ 17.4±2.4■ 27.6±4.4▼ 32.5±3.6▼ 26.5±2.7■
BN 23.4±4.2■ 14.7±2.3 9.4±2.4 25.5±4.3■ 23.4±3.5 17.5±2.3■ 26.9±4.5■ 32.5±3.4■ 26.5±2.5■
DHG5 24.7±3.5 14.9±2.3 10.0±2.3 26.1±4.3 24.7±3.3 18.5±2.3 29.5±4.5 33.3±3.7 29.2±2.6
DHG10 22.3±3.4■ 14.6±2.4 9.4±2.4 25.4±4.3■ 23.8±3.4■ 17.4±2.2■ 27.4±4.3■ 32.4±3.9■ 26.6±2.4■
DHG20 21.8±2.5▼ 14.6±2.2 9.3±2.2 23.9±4.3▼ 22.5±3.3▼ 16.7±2.4▼ 25.4±4.4▼ 28.3±3.5▼ 23.3±2.6▼
　　　■P<0.05 , ▼P<0.01 , 与同时间点 HG 组相比;﹡ P<0.05 , *P<0.01 , 与DHG20相比
3　讨论
DN 为 DM 的微血管并发症之一 , 近年来 , DN
已成为发达国家终末期肾功能衰竭(end-stage renal
disease , ESRD)的首要病因 ,我国 DN 的发病率也
逐年上升。DN的发生 、发展是多因素综合作用的结
果 ,其中糖代谢紊乱 、肾脏血流动力学的改变 、多种
细胞因子的作用以及遗传背景均起重要作用 。依照
国际糖尿病联合会(International Diabe tes Federa-
tion)糖尿病肾病统计地图频率表明 DN 以惊人的比
率在增加。全世界有 2.46亿人受累 ,如果现在的形
式没有得到控制 ,到 2025 年 ,这个数据将达到 3.8
亿 。流行病学表明超过 90%是 2 型糖尿病 ,这与大
量的人口老化 、饮食和肥胖以及久坐的习惯相关[ 1] 。
目前 DN 的确切的发病机理还不十分清楚 ,其基本
病理改变是:早期表现为尿中排出微量白蛋白 ,继之
出现临床蛋白尿 ,肾小球高灌注 、高跨膜压;随着病
情的进展可逐渐发展为肾小球毛细血管 GBM 增
厚 ,GMC增殖 、ECM 进行性积聚 ,系膜区扩张 、巨噬
细胞增多及泡沫细胞形成 、足细胞减少 ,同时伴有肾
小管-间质纤维化和弥漫性肾小球间与结节性肾小
球肥大 、硬化 。ECM 的进行性积聚是由于正常成分
的过度增生 ,表现为局部调控系统中 ECM 降解酶表
达减少 、活性降低以及降解酶抑制物的表达增加和
活性增强 ,是导致 DN 肾硬化的中心环节[ 2] 。GBM
为一连续的无细胞结构 , LN 、Col Ⅳ及 FN 是构成
GBM 的主要成分 ,且能影响细胞黏附 、迁移 、生长和
分化。LN 、Co lⅣ和 FN 由上皮细胞 、内皮细胞和系
膜细胞合成和分泌。 LN 是一种大分子非胶原性糖
蛋白 ,主要由肾小球上皮细胞 、内皮细胞及系膜细胞
产生。LN能与黏附分子特异性结合 ,可介导上皮细
胞及内皮细胞黏附于基膜 ,影响细胞的生长 、分化和
运动。ColⅣ为基膜胶原 ,存在于上皮细胞 、血管内
皮细胞的基膜以及角膜上皮中 ,是基膜网状结构的
主要成分 ,Co lⅣ分别由两条 ColⅣ(αl)和 1条 Co lⅣ
(α2)组成三螺旋结构 。ColⅣ是 DN 时 ECM 增殖的
主要成分 ,与正常肾脏和原发肾脏增殖性病变不同 ,
主要沉积在肾小球 、肾小管基底膜和包曼氏囊 。LN
可以和 Co lⅣ型胶原等其它基质成分结合 ,完成肾小
球基膜的构建 ,是维持基膜正常功能结构的主要成
分 。由于其合成与降解代谢不平衡 ,造成肾小球硬
化的发生 、进展 ,在早期是以合成增加为主 ,晚期则
降解减慢。而 ECM 的主要成分由 FN 、Ⅳ、Ⅴ型胶
原蛋白 、LN 及蛋白多糖构成 ,在正常肾组织中 LN 、
Co lⅣ和 FN 表达量较低 ,不会引起肾脏病理变化 ,
但在病理情况下很多因素都可直接或间接促进
GMC增殖并合成分泌 Col Ⅳ、LN 和 FN ,导致肾小
球纤维化和硬化 ,促进 DN 发生与发展 。当病情失
去控制时 ,肾结构的不断损坏 ,最后进展为慢性肾功
能不全甚至肾功能衰竭。
1991年 Ayo 等[ 3] 首先选用 10 mmol/ L 作为正
常对照观察高糖培养环境对鼠肾小球 MCs的影响 ,
并认为虽然这种葡萄糖浓度高于正常时血清中的浓
度 ,但是 MCs体外生长所必须的 。但以后其他实验
室的研究均选用 5或5.6 mmol/ L 作为正常对照组 ,
本实验也选用 5.6 mmo l/L 的葡萄糖作为正常对照
479
武汉大学学报(医学版) 第 29 卷
组 ,实验发现 , GMC 在 5.6 mmo l/L 的葡萄糖的作
用下 ,在各个观察点其增殖速度没有明显变化(P>
0.05);有研究表明 10 mmo l/L 以上的高浓度葡萄
糖对 MC 有促进增殖作用 ,其中以 25 mmo l/L 糖对
系膜细胞增殖作用最明显(P <0.01),并认为在 72
h和 96 h时 ,由于葡萄糖过高作用时间过长抑制系
膜细胞的增殖[ 4] ;而肖[ 5] 等认为 30 mmol/L 糖在实
验的 24 h至 96 h里对系膜细胞增殖有促进作用 ,具
有统计学意义(P<0.05或 P <0.01), 72 h内随着
作用时间的延长 ,促进增殖作用越明显),这与本实
验研究结果相一致;但肖等[ 5] 通过实验还发现 40
mmol/ L 浓度的葡萄糖在 48 h 内对 GMC 增殖有促
进作用 ,具有统计学意义(P <0.05),48 h后作用减
弱 ,甚至转为抑制 。与正常葡萄糖组比较 ,高糖培养
组 GMC 明显增殖 ,同时 G 0/G 1期细胞比例明显减
少 ,而 S期及 G2/M 期细胞比例明显增加 ,具有统计
学意义(P<0.01);本实验结果还表明:在 72 h ,高
糖组(30 mol/ L)系膜细胞其增殖与其它组相比明显
增高(P<0.05 或 P <0.01),说明高糖可以促进系
膜细胞增殖 ,这与杨等[ 6] 研究结果相一致 ,实验还发
现高糖(30 mmo l/L)下调了 Cx43 的表达 , 促进了
GMC 的衰老[ 7] 。有人提出肾小球硬化症(G lomeru-
losclero sis)和 DN 归因于高糖诱导的系膜细胞凋
亡[ 8] 。
相关研究还发现:在高糖作用下 ,由于一些信号
通路的激活 ,导致系膜细胞内一些核酸增多 ,从而导
致系膜细胞合成 FN [ 9] 和 ColⅣ增多[ 10] ,系膜细胞在
高糖环境中(25 mmo l/L)暴露 3 h后 ,检测到细胞内
明显增多的 ROS 产物 Co l Ⅰ(Co l Ⅰ , 123.0%±
6.0%),ColⅣ(ColⅣ , 126.8%±6.9%)[ 10] ;孙等[ 4]
发现 ,长期高糖培养下系膜细胞内活性氧族(Reac-
tive oxygen species , ROS)升高 ,细胞内游离钙离子
浓度增高 ,同时线粒体膜电位降低 ,认为糖尿病肾病
是存在一条病理学链:高血糖-糖化氧化-系膜细胞肥
大/基质集聚 。
也有人证实 , 单核细胞趋化蛋白-1(monocy te
chemoatt ractant pro tein-1 , MCP-1)诱导了 FN 的产
生是 TGF-β1和 NF-κB 所依赖的 。在糖尿病鼠 ,降
低 MCP-1 能减少肾小球 FN 的产生和肾脏皮质
TGF-β1和纤维连接蛋白 mRNA 及其蛋白的水
平[ 11] ;孙等[ 12] 的研究还发现高糖条件下 MMP-2
mRNA 表达与培养液 MMP-2 活性下降 ,高葡萄糖
浓度加用 C肽培养 48 h 使大鼠肾小球系膜细胞培
养液Ⅳ型胶原蛋白水平降至正常 ,表明 C 肽具有预
防高糖培养所致系膜细胞外基质成分积聚的作用;
M ima
[ 13] 等的研究还发现 ,AngⅡ通过 S rc-的磷酸化
和 Smad1-的磷酸化诱导Ⅳ型胶原纤维的合成和增
殖 ,它能够被奥美沙坦 、PP2所抑制。当归补血汤能
明显抑制高糖诱导的 GMC 过度增殖 ,可明显降低
细胞上清液中 FN 、LN和 Co lⅣ的含量(P <0.05或
P<0.01),这种对基质蛋白表达的抑制作用与药物
作用时间和浓度有关 。实验还发现 ,在培养的系膜
细胞中 ,高糖组(25 mmo l/L g lucose-DMEM)S 期的
细胞百分比明显增加 , G 0/G 1期的细胞百分比明显
减少 , Ⅳ胶原纤维 、LN 、TGF-β1mRNA 的表达也增
加[ 19] 。另外 , DN 时 , 糖基化终末产物(A dvanced
glycation endoproducts , AGEs)与 GMC 的特异性
受体结合 ,促使肾小球系膜细胞产生和释放 ECM 成
分如 FN 、Col Ⅳ、LN 和硫酸肝素糖蛋白等 ,ECM 成
分经非酶糖基化 ,具有抗基质降解酶的能力 ,以致在
体内降解减少。这些物质堆积可引起肾小球基底膜
增厚 ,系膜扩张 ,肾小球肥大和肾小球硬化[ 5] ,另外
TGF-β1还可通过各种途径引起 ECM 变构 , 刺激
ECM 成分 ,如 Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅳ、Ⅵ 型胶原 , FN , LN mRNA
表达增加 ,硫酸乙酰肝素(HspG)的 mRNA 表达减
少 ,导致 HspG 与Ⅳ型胶原的比率相对降低 ,从而破
坏肾小球滤过膜的电荷屏障及分子屏障[ 14] ,最终促
进 DN 的进展 。
DN属中医学的“消渴” 、“水肿” 、“关格”等范畴。
病变特点为肝肾阴虚为其本 ,肺胃燥热为其标 ,痰 、
湿 、浊 、瘀为其因 ,气血损伤 ,脉络瘀阻为其变 ,阴阳
具虚 、脏腑损伤及水湿潴留为其果。当归补血汤源
于金代李杲的《内外伤辨惑论 ·暑伤胃气论》 ,全方
由黄芪 、当归(5∶1)组成 ,是中国传统的补气兼养血
的代表方剂 ,主治劳倦内伤 、气弱血虚 、阳浮外越 ,能
增强免疫 ,调节血液系统及血糖含量 ,保护心血管系
统 、护肝及抗氧化等作用。研究表明 ,黄芪的主要成
分为甙类 、多糖 、氨基酸及微量元素等。当归中含有
多种氨基酸 、挥发油 、阿魏酸及微量元素等[ 15] 。实
验表明 ,当归补血汤能够改善 DN 大鼠GBM 不规则
增厚 ,足细胞排列紊乱且发生融合 ,肾小管上皮细胞
肿胀 ,大量空泡变性 ,线粒体体积增大 、形态变圆 ,线
粒体嵴脱落 。降低血糖 、胆固醇 、甘油三酯 ,提高高
密度脂蛋白 ,逆转肾脏肥大 ,肾重/体重的增加 ,改善
系膜增生 。有效地降低肾小球和肾小管 TGF-β1
mRNA 表达量 , TGF-β1可过促进 Samd3 的活化而
促进纤维连接蛋白的产生[ 16] 。TGF-β1还可通过各
种途径引起 ECM 主构 ,刺激 ECM 成分 ,如 Ⅰ 、Ⅱ 、
480
　第 4 期 周必发 , 等.当归补血汤对高糖条件下系膜细胞增殖及细胞外基质表达的影响
Ⅳ、Ⅵ型胶原 ,纤维连接素 , LN mRNA表达增加 ,硫
酸乙酰肝素(HspG)的 mRNA 表达减少 , 导致
HspG与Ⅳ型胶原的比率相对降低 ,从而破坏肾小
球滤过膜的电荷屏障及分子屏障导致 DN 的发生发
展[ 14] ,进而减轻 ECM 积聚和肾脏肥大[ 17] ;此外当归
补血汤加味能减少蛋白尿 、降低血脂 、血压[ 18] ;防治
肾间质纤维化可能与调控肾小管上皮细胞 TGF-β1/
Smads信号转导途径相关[ 19] ;黄芪当归按照一定比
率能降低 FN 、LN 在肾间质中积聚[ 20] ;归芪方能改
善血糖及脂质代谢紊乱 ,并能降低尿微量白蛋白及
β2-微球蛋白排泄率 , 缓解肾损伤 , 还可抑制肾脏
TGF-β1mRNA 的表达 、促进肾脏肝细胞生长因子
(Hepatocyte grow th facto r , HGF)蛋白的合成[ 21] 。
与高糖组比较 , 2.0和/或 20 μmol/ L 的黄芪总皂甙
Ⅰ(Astrag alus saponin Ⅰ , AS Ⅰ)培养的 GMC 中
TGF-β1mRNA 的水平 、Ⅳ胶原纤维 、层粘连蛋白在
统计上明显降低[ 22] 。
在正常情况下 ,体外培养的 GMC 有一定的增
殖能力和分泌 ECM 的能力 ,但各组间无明显差异 ,
但在不同浓度的糖作用下 ,其增殖能力及分泌 FN 、
LN 和 ColⅣ都增强 ,并随着作用时间的延长和糖浓
度的增加这种效应更加明显 ,以此我们推测在这一
过程中 ,高糖活化了系膜细胞内的某些信号通路 ,如
非酶糖基化 、Ang Ⅱ以及炎症细胞因子等的活化 ,导
致 FN 、LN和 Co lⅣmRNA 转录增加分泌增多以及
GMC 增殖 ,最终导致间质的纤维化肾小球的肥大 ,
加速了 DN 的发生与发展。而当归 、黄芪 、苯那普利
和当归补血汤能够抑制高糖条件下 GMC 的增殖及
分泌细胞外基质成分 ,其中以 DHG20 组的作用最
为明显 ,并成时间和剂量关系 ,结合相关研究 ,我们
推测当归补血汤的这种作用是通过改善细胞内环
境 ,抑制了细胞内的非酶糖基化 、氧化应激 、炎症因
子等的表达而实现的 。说明 GMC 可能是当归补血
汤预防和治疗 DN 的作用的靶点 ,对于阐明 DN 的
发病机理及当归补血汤在 DN 时肾小球硬化及肾脏
间质纤维化机制具有十分重要的意义 。
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(下转第 488页)
481
武汉大学学报(医学版) 第 29 卷
的抑制作用:在细胞培养实验中 ,0.2-200μmol/L 塞
来昔布作用 24 h ,均能抑制 Lew is细胞增殖 ,抑制程
度随药物浓度增加而显著增强 。在 100 , 200 μmo l/
L 两种浓度 , 90%以上的细胞被抑制 ,相互之间差异
无显著性 ,说明在一定浓度范围内 ,增加药物剂量并
不能增加疗效。20 μmo l/L 组与 100 μmo l/L 组比
较 ,差异无显著 。因此 20 μmol/L 为塞来昔布最佳
浓度组 。损伤修复实验显示 , 20 μmol/ L 塞来昔布
显著抑制 Lew is 肺癌细胞迁移速度;在进一步的移
植瘤实验中 ,本研究发现 ,塞来昔布实验组的小鼠移
植瘤增长速度减慢 ,瘤体质量显著性低于对照组 ,抑
瘤率为 51.4%,同时移植瘤组织中 V EGF mRNA
表达水平以及小鼠血清 MMP-9 浓度为显著性降
低 。这提示出塞来昔布具有抑制 Lew is肺癌细胞增
殖的作用 ,其抗肿瘤形成机制之一是抑制瘤体组织
中 VEGF 的表达 ,同时通过降低 MMP-9浓度有望
抑制肿瘤的转移。
因此 ,本研究显示塞来昔布可以显著抑制 Lew-
is肺癌细胞的增殖 、迁移能力 ,同时对 Lewis肺癌移
植瘤亦有明显抑制作用 ,其效应可能通过抑制 COX-
2酶活性介导 ,进而抑制 VEGF 和 MMP9的表达 。
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