全 文 ：文章编号:0490-6756(2003)02-0371-06
温度和酸碱度对黄精凝集素 Ⅱ生物学活性
与构象的影响研究
吕辉 ,高顺 , 荣艳珍 ,赵曦 ,安洁 ,段真 ,王陈继 ,鲍锦库＊
(四川大学生命科学学院 ,成都 610064)
摘要:采用圆二色谱和荧光光谱 ,研究了黄精凝集素 Ⅱ(PCLⅡ)在不同温度及不同 pH 值时 ,
其活性和分子构象变化的关系 ,结果表明:PCLⅡ具有较强的温度和酸碱度的耐受性 ,但在
80℃,pH 2 ,pH 4和 pH 12时 ,其分子构象发生较大变化 ,活性也明显减弱.
关键词:黄精凝集素Ⅱ;温度;pH 值;圆二色性;荧光光谱;生物学活性
中图分类号:Q531　　　文献标识码:A
凝集素是一类非免疫来源具有糖结合专一性 ,且能凝集细胞和沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白.凝集
素由于对糖的专一性识别和特异性结合能力 ,而被广泛用于生物学 、医学研究等领域.应用旋光色散 、紫外差
别光谱和圆二色谱等研究凝集素的结构与功能 ,已成为一种主要方法[ 1] .黄精凝集素 Ⅱ(Polygonatum cyr-
tonema Hua.Lectin , PCLⅡ)是从黄精根状茎中分离纯化的一种糖结合蛋白 ,可以凝集兔红细胞 ,并且是一
种强的促有丝分裂原[ 2] .以下报道运用圆二色谱 、荧光光谱 ,研究温度和 pH 值对 PCLⅡ构象与活性的影响 ,
以探求黄精凝集素Ⅱ结构与活性的关系.
1　材料与方法
1.1　材料
黄精凝集素 Ⅱ按文[ 2]方法纯化 ,经 SDS-PAGE 和 FPLC 检测为单一蛋白带.新鲜兔血细胞购自市场 ,
先用生理盐溶液离心 3次 ,再用相同溶液配成 2%的血球悬液备用.
1.2　方法
1.2.1　圆二色谱的测定　参考文[ 3]的方法 ,在得到远紫外CD谱后 ,用Chen和 Yang 的方法计算各构象单
元的百分含量[ 4] ,同时测定近紫外 CD谱.
1.2.2　荧光光谱的测定　参考文[ 5]的方法测定.
1.2.3　不同温度处理的 PCL Ⅱ的 CD谱和荧光光谱的测定　将样品以生理盐水配制 ,在不同温度处理
10min后 ,自然冷却至 25℃时再行测定其 CD谱和荧光光谱.
1.2.4　不同 pH 值处理的 PCL Ⅱ的 CD 谱和荧光光谱的测定　将浓度为 1×10-3 g/mL 的样品用浓度为
0.1mol/L 用 pH 2.0的 KCl-HCl缓冲液 、 pH 4.0 和 5.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 、pH 9.0的 NaHCO3-
Na2CO3缓冲液和 pH 12 的 KCl-NaOH 缓冲液 ,配制成相应的 PCLI I溶液 ,放置过夜后 ,测定各样品 CD谱和
荧光光谱.
1.2.5　不同 pH 值及温度处理后 PCLⅡ凝集活性的测定　在”V”型微量血清稀释板上 ,用 25μL PCLⅡ(待
测液 1×10-3g/mL)与等量生理盐水溶液进行系列倍比稀释后 ,加入 25μL已制备好的兔红细胞悬液 ,振荡
收稿日期:2002-09-20
基金项目:国家自然科学基金(39770178)
作者简介:吕辉(1977-), 男 , 2000 级硕士研究生.
＊通讯联系人
2003年 4月
第 40卷第 2期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
Apr.2003
Vol.40　No.2
后于 25℃下放置 2h ,显微镜下检查凝集活性.
2　结果与讨论
2.1　温度对 PCLⅡ凝集活性和 CD谱的影响
处理温度分别为 20℃, 40℃,60℃, 70℃和 80℃,不同温度处理后的凝集活性见表 1.PCL Ⅱ在 20℃和
40℃处理后 ,活性保持不变;在 60℃处理后活性仍然保持 83%,在 80℃处理后 ,尚保留有 33%的活性 ,说明
PCLⅡ是一种对热比较稳定的凝集素.
在天然态 PCLⅡ的远紫外 CD谱(图1a)上的224nm处 显示不常见的单一大负峰和 212nm 及234nm 处
的肩.其中 40℃和 60℃的 CD谱变化不大 ,二者几乎重合 ,与天然态相比 ,两肩消失 ,负峰极值处上移 ,即[θ]
由-5.1×103 deg·cm2·dmol-1变为-4.5×103 deg·cm2·dmol-1;70℃时 ,又出现 212nm 处的肩 , [θ]值由
-1.5×103 deg·cm2·dmol-1下移至-2×103 deg·cm2·dmol-1 ,但仍未出现 234nm 处的肩.负峰极值处上移 ,
即[θ]为-4.6×103 deg·cm2·dmol-1 ,同时 ,峰谱变宽;80℃时 , 峰谱明显变宽 ,峰谷变平 ,且负峰蓝移至
217nm处 ,极值上移 , [θ] 值变为-2.6×103 deg·cm2·dmol-1 ,与此同时 ,又重新出现 234nm 处的肩 ,而
212nm 处的肩却消失 ,同时 ,在 198nm 处出现一正峰 , [θ]为 1.7×103 deg·cm2·dmol-1.
表 1　温度对 PCLⅡ凝集活性的影响＊
温度(℃) 凝集素浓度(×10
-6g/m L)
500 250 125 62.5 31.25 15.6 7.8 3.9 1.95 0.95 0.48 0.24
20 + + + + + + + + + + + -
40 + + + + + + + + + + + -
60 + + + + + + + + + + - -
70 + + + + + + + + + - - -
80 + + + + - - - - - - - -
　　　　＊“ +”表示凝集 , “ -”表示不凝集
图 1　不同温度下 PCLⅡ的远 、近紫外圆二色谱
　　1.20℃;2.40℃;3.60℃;4.70℃;5.80℃
　　由近紫外 CD谱(图 1b)显示天然态 PCLⅡ的 CD谱 ,在 300nm , 260nm ,285nm 处分别有一肩 ,在 278nm
处有一负峰;40℃和 60℃时 ,CD谱变化不大;70℃时 ,CD谱明显变化 ,负峰的[θ]绝对值明显减少 ,300nm 处
的肩蓝移至 295nm ,峰谱变宽;80℃时 ,峰谱呈现无规则形状 ,出现多个肩和负峰 ,除 300nm 处肩蓝移至
295nm 处外 , 260nm 处的肩变为负峰 ,在其两边 257和 263nm 处出现两个肩 ,278nm 处的负峰红移至 280nm
处 ,并在 276和 288nm 处出现两个负峰.
由表 2可以看出 ,当温度升高时 , β-折叠构象单元的相对含量逐渐下降 ,而无规卷曲含量则逐渐增加 ,当
温度高于 70℃时 , PCLⅡ由一种高 β-折叠的蛋白质变为无规卷曲含量较多 ,而此时凝集活性也开始有所下
降 ,说明凝集活性中心构象已有所改变.
372 四川大学学报(自然科学版) 第 40卷
表 2　不同温度下 PCLⅡ二级结构各构象单元的相对含量＊
温度(℃) XH(%) Xβ(%) X R(%) 温度(℃) X H(%) X β(%) XR(%)
20 17.3 45.8 36.9 70 16.7 38.7 46.2
40 16.8 43.5 39.7 80 20.5 30.2 49.3
60 16.3 42.1 41.6
　　　　　＊ X H :α-螺旋;X β :β-折叠;X R :无规卷曲;以下同
2.2　pH 值对 PCLⅡ凝集活性和 CD谱的影响
不同 pH 值下 PCLⅡ对兔红细胞的凝集活性见表 3.在 pH 2 ～ 4范围内 ,随 pH 值的减小 ,其凝集活性降
低 ,在 pH 2时 ,仍有部分活性(45%);在 pH 5.6 ～ 9范围内 ,活性变化不明显;在 pH 12时 ,仍有较强的凝集
活性 ,说明 PCLⅡ是一个对酸 、碱均比较稳定的蛋白.
不同 pH 值时 PCLⅡ二级结构各单元构象的相对含量见表 4.
与生理状态下的 CD谱相比 ,pH 2时的远紫外 CD谱(图 2a)明显变宽 ,峰谷变钝 ,谱峰从 224nm 蓝移至
213nm 处 ,负峰极值处下移 ,[θ]值变为-5.4×103deg·cm2·dmol-1 ,两肩也同时消失;pH 4时 , 234nm 处的
肩出现 ,此时负峰极值处上移 , [ θ]变为-4.5×103deg·cm2·dmol-1;pH 9 时 , 除 234nm 处的肩外 ,还在
209nm 处出现一新的肩 ,负峰的极值[θ]较天然状态几乎无变化 ,其谱峰见乎与 pH 5.6 时重合 ,209nm 处的
肩可能是 212nm 肩蓝移所致;pH 12时 ,于 209nm 和 234nm 处的肩均消失 ,其余部分 CD谱几乎与 pH 9时
重合.
表 3　pH 值对 PCL Ⅱ凝集活性的影响＊
pH
凝集素浓度(10-6g/m L)
500 250 125 62.5 31.25 15.6 7.8 3.9 1.95 0.95 0.48
2.0 H H H + + - - - - - -
4.0 + + + + + + + - - - -
5.6 + + + + + + + + + + +
9.0 + + + + + + + + + + +
12.0 H H H H H + + - - - -
　　　　　＊“ +”表示凝集 , “ -”表示不凝集 , “H”表示溶血
通过研究不同 pH 值下 PCL Ⅱ的近紫外谱(图 2b)发现 ,随 pH 值的变化 , CD谱变化十分明显.pH <5.6
时 ,随 pH 值的降低 ,负峰极值处上移 ,但负峰的位置仍在 278nm 处;当 pH>5.6时 ,随 pH 值的升高 ,负峰极
值处上移 ,负峰仍在 278nm处.在远紫外 CD谱中 ,pH 9时在 209 nm 处出现一个异常的新肩 ,此肩的出现可
能是二硫键的贡献.
图 2　不同 pH 值下 PCLⅡ的远近紫外园二色谱
　　1.pH5.6;2.pH2;3.pH4;4.pH9;5.pH12
373第 2期 吕辉等:温度和酸碱度对黄精凝集素 Ⅱ生物学活性与构象的影响研究　　
　　由表 4可以看出 ,当 pH<5.6和 pH>9时 , β-折叠构象单元的相对含量逐渐下降 ,无规卷曲含量增加 ,
而此时凝集活性则较天然状态明显降低 , 表明此时二级结构构象已有较大改变 ,从而引起了活性中心构象
的变化.
表 4　不同 pH 值时 PCLⅡ二级结构各构象单元的相对含量
pH XH(%) X β(%) X R(%) pH XH(%) X β(%) X R(%)
2.0 9.7 24.3 66 9.0 12.3 51.4 36.3
4.0 11.0 35.1 53.9 12.0 10.1 38.5 51.4
5.6 17.3 45.8 36.9
2.3　温度和 pH 值对 PCLII荧光光谱的影响
2.3.1　温度对 PCLII 荧光光谱的影响　PCLII 样品经不同温度处理后 ,其荧光光谱的变化见图 3.40℃时 ,
荧光光谱与天然态(20℃)相比 ,295nm 和 280nm 处的峰位均只发生微小的蓝移 ,相对荧光强度分别增加至
45.6和 66.2 ,说明其分子结构变化不大;60℃时 ,峰位无变化 ,相对荧光强度略有增加 ,由表 1可知 , PCLII
的活性变化不大 ,说明分子结构中 Trp 残基微环境有一定变化 ,但并未影响到活性中心的构象;70℃时 ,
295nm 处的峰位无变化 ,相对荧光强度增至 48.3 ,280nm 处的峰位略有红移 ,相对荧光强度增至 69.4 ,但此
时PCLII的活性变化不大 ,表明分子活性中心的结构并未改变;80℃时 , 295nm 处的峰位红移至 330.5nm
处 ,相对荧光强度增加至 52 ,280nm 处的荧光光谱变化也较明显 ,峰位红移至 329.6 nm , PCLII活性有较大
下降 ,说明此时 Trp和 Ty r 已发生能量的转移 , Trp残基疏水环境发生了较大改变 , PCLII 的活性中心构象
也有一定程度破坏.
图 3　温度对 PCLII 荧光光谱的影响
a:280nm 发射谱;b:295nm 发射谱
1.20℃;2.40℃;3.60℃;4.70℃;5.80℃
图 4　pH 对 PCLI I荧光光谱的影响
a:280nm 发射谱;b:295nm 发射谱
1.pH 5.6;2.pH 2;3.pH 4;4.pH 9;5.12
374 四川大学学报(自然科学版) 第 40卷
2.3.2　溶液 pH 值对荧光光谱的影响　用不同 pH 值处理 PCLII 后 ,其荧光光谱变化如图 4.pH 9 时 ,
PCLII 的 295nm 和 280nm 处的荧光光谱峰位与天然态(pH5.6)相比变化不大 ,相对荧光强度略有下降;在
pH 4时 ,其 295nm 处的荧光光谱峰位略有红移 ,相对荧光强度下降为 36.5 ,说明此时 PCLII 分子中的 Trp
残基微环境略有改变 ,分子活性也有部分丧失;在 pH 2时 ,PCLII 在 295nm 处的荧光峰位红移至 326.1nm ,
相对荧光强度下降至 22.1;pH 12时 , PCLII的光谱变化明显 ,295nm 处的荧光峰位红移至 326.3nm ,相对
荧光强度下降至 14.3 ,280nm 处的峰位红移至 324.5 nm ,相对荧光强度下降至 26.4 ,说明 Trp残基在 pH 2
和pH 12时周围疏水环境被破坏或 Trp残基所处特殊构象被破坏 ,分子活性部分丧失 ,表明 Trp残基微环境
的改变使 PCLII的分子活性中心构象发生了变化[ 5] .
2.4　讨论
从计算结果看 , PCLⅡ是一种高 β-折叠的蛋白质 ,但与典型的 β-折叠蛋白质 CD谱不同 ,所以是一种 CD
谱异常的特异蛋白质.因为蛋白质在 224 ～ 227nm 之间呈现负峰的情况极少 ,此负峰位置与高 β-折叠的
Con A在 224nm 处呈现异常负峰相似[ 6](但Con A在 212nm 处的负肩却不明显),却明显地与岩豆凝集素
(MDL)典型的高 β-折叠构象不同[ 7] .
通过不同温度的实验表明 ,PCL Ⅱ是一种热稳定性较强的凝集素 ,从 CD 谱和荧光光谱的变化可见 ,
40℃和 60℃时 ,与天然态相比较 ,其二级结构构象单元的 α-螺旋 、β-折叠和无规卷曲变化均不明显 ,荧光强
度和峰位均无明显变化;当温度升至70℃时 ,其各二级结构单元中的 α-螺旋和无规卷曲均有较多增加 ,而 β-
折叠则显著减少 ,而此时荧光光谱变化仍较小 ,表明此时 Trp残基微环境变化不大 ,PCL Ⅱ分子中的活性中
心并无较大破坏 ,分子活性无明显变化;当温度为 80℃时 , α-螺旋和无规卷曲显著增加 , β-折叠则明显减少 ,
结合此时 PCLⅡ活性的明显下降 ,表明此时分子结构较为松散 ,可以推测活性中心以 β-折叠为基础 ,它的减
少正是导致失活的原因 ,而荧光光谱中峰位明显红移 ,证明了此时分子结构明显变化 ,推测这时位于分子表
面浅沟或疏水袋中的 Trp残基已暴露出来 ,且处于亲水环境中.
实验结果表明 , PCL Ⅱ是一种对酸 、碱较为稳定的凝集素.pH 4时 ,二级结构中 β-折叠和 α-螺旋较
pH5.6时均有所下降 ,而无规卷曲则有所增加 ,表明此时分子结构较为松散 ,荧光光谱的变化也支持这种结
论 ,此时 PCLⅡ活性有所下降;pH 2时 ,CD谱的变化较大 ,此时二级结构单元中无规卷曲增加 , β-折叠由
45.8%减少至 24.3%,表明此时分子结构更为松散 ,荧光光谱峰位略有红移 ,相对荧光强度有明显下降 ,分
子中 T rp残基微环境也发生了一些变化 ,PCL Ⅱ分子的活性中心结构已有所改变 ,PCLⅡ活性显著下降;在
pH 9时 , β-折叠增加 ,活性不变 ,表明活性主要是由 β-折叠决定 ,此时荧光谱变化较小 ,表明分子活性中心
Trp残基微环境没有太大变化;在 pH 12时 , β-折叠减少 , 无规卷曲有所增加 ,表现为活性下降 ,这也表明
PCLⅡ的 β-折叠对凝集活性的重要性 ,此时荧光光谱峰位明显红移 ,相对荧光强度显著下降 ,表明此时分子
结构较为松散.
参考文献:
[ 1] 鲁子贤 , 等.圆二色性和旋光色散在分子生物学中的应用[ M].北京:北京科学出版社 , 1987.
[ 2] 鲍锦库 , 曾仲奎 ,周红.生物化学杂志 , 1996 , 12(2):165.
[ 3] 鲍锦库 , 曾仲奎 ,周红 , 等.中国生物化学与分子生物学报 , 1998 , 14(6):715-720.
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[ 5] 鲍锦库 , 吴传芳 ,吕辉 , 等.四川大学学报(自然科学版), 2000 , 37(6):930-936.
[ 6] Herman M S.Biopolymers , 1978 , 17:2107-2120.
[ 7] 曾仲奎 , 郑健.生物化学杂志 , 1994 , 10(1):103-110.
375第 2期 吕辉等:温度和酸碱度对黄精凝集素 Ⅱ生物学活性与构象的影响研究　　
The Effect of Different Temperatures and pH Value on the Conformation and
Biological Activity of Polygonatum Cyrtionema Hua Lectin Ⅱ
LU Hui , GAO Shun , RONG Y an-zhen ,ZHAO Xi , AN J ie ,
DUAN Zhen , WANG Chen-j i ,BAO Jin-ku
(College of Life Science ,Sichuan Universi ty ,Chengdu 610064 ,China)
Abstract:Circular dichroism(CD)and fluorescence spect ra were used to elucidate the relationship betw een the
activi ty and molecular conformation of Polygonatum cyrtonema Hua., Lect in Ⅱ(PCL Ⅱ)under dif ferent tem-
perature and pH Value.The results show ed that PCLⅡ was stable in various temperature and pH betw een pH 4
～ 9.5 and below 80℃, but the molecular structure and biological activity changed much under pH 2 ,pH 4 ,pH
12 and 80℃, and the activity of PCLⅡ became weak.
Key words:Polygonatum cy rtonema Hua Lectin Ⅱ;temperature;pH Value;ci rcular dichroism;fluorescence
spectrum;biological activity
376 四川大学学报(自然科学版) 第 40卷