全 文 ：收稿日期:2013 － 01 － 06 修回日期:2013 － 04 － 06
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30972031) ;福建省高校产学合作科技重大项目(2011N51010043)．
作者简介:何炎森(1968 －) ，男，副研究员，博士研究生． 研究方向:花卉遗传育种与生物技术． Email:heyansen@ yahoo． cn． 通讯作者陈晓静
(1954 －) ，女，教授．研究方向:园艺植物遗传育种． Email:xjchen804@ sina． com．
多花水仙花瓣抑制消减杂交 cDNA
文库的构建及分析
何炎森1，2，何玮毅3，陈晓静1
( 1．福建农林大学园艺学院 /园艺植物遗传育种研究所，福建 福州 350002; 2．福建省农业科学院闽台
园艺研究中心，福建 漳州 363005; 3．福建农林大学应用生态研究所，福建 福州 350002)
摘要:采用抑制消减杂交(SSH)技术，以多花水仙的栽培品种‘黄花水仙 2 号’黄色花瓣和‘金盏银台’白色花瓣 的 cDNA
分别作为测试子和驱动子，建立正、反向抑制消减杂交 cDNA文库．随机挑选正、反向文库各 216 个阳性克隆测序，对已知功
能的 uniESTs进行基因本体论(GO)分类分析，荧光定量 PCR 检测部分可能参与色素形成的 uniESTs．结果表明:水仙花色
差异表达正、反向消减文库经检验质量可靠，为分离花色形成相关基因奠定了基础;GO 功能分类分析显示，水仙花色差异
可能受到多个代谢途径的影响;经初步筛选得到 11 个与水仙花色形成相关的 uniESTs，为进一步克隆基因全长和功能验证
提供参考．
关键词:多花水仙;花色;抑制消减杂交
中图分类号:S682．2 + 1 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2013)03-0289-08
Construction and analysis of the suppression subtractive hybridization cDNA
libraries between yellow and white perianth of Narcissus tazetta
HE Yan-sen1，2，HE Wei-yi3，CHEN Xiao-jing1
(1． College of Horticulture / Institute of Genetics ＆ Breeding in Horticultural Plants，Fujian Agriculture and Forestry
University，Fuzhou，Fujian 350002，China;2． Mintai Horticulture Research Center，Fujian Academy of
Agricultural Sciences，Zhangzhou，Fujian 363005，China;3． Institute of Applied Ecology，
Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:The cDNA libraries derived from forward and reverse suppression subtractive hybridization (SSH)were constructed be-
tween yellow and white perianth of Narcissus tazetta． A total of 216 clones randomly selected from each library were used for sequen-
cing． The uniESTs of known function was annotated by gene ontology (GO)function classification． The expression of uniESTs in-
volved in the color formation was verified by fluorescence quantitative PCR． The forward and reverse SSH cDNA libraries were tested
to be of reliable quality and were good for separation flower color formation related genes． GO function classification results showed
that the flower color difference of narcissus might be influenced by multiple metabolic pathway． Eleven uniESTs were obtained for
further investigation of their roles in the flower color formation of narcissus．
Key words:Narcissus tazetta;flower color;suppression subtractive hybridization (SSH)
水仙花是石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)多年生草本植物，我国传统十大名花之一．新通过
福建省级认定的黄花水仙 2 号弥补了中国水仙品种匮乏、花色单一的不足［1］，是一份研究水仙呈色机理及
其差异原因的理想材料．造成同种植物某一器官形成不同颜色的原因可能是基因组中与色素形成相关基
因发生突变或其启动子元件发生变化［2］，也有研究表明，与花色形成的相关基因被“关闭”之后，未必就一
定导致花色的丧失［3］，说明色泽的形成并非只是简单地受色素合成相关基因所决定，也可能取决于色素
合成途径中酶基因与调控基因间复杂的网络互作．涉及水仙花色形成相关的类胡萝卜素和类黄酮合成途
径中许多合成酶基因已被成功克隆［4 － 5］，转录因子等调控基因对水仙花色的影响尚未见报道．
抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术是一种高效快捷筛选差异基因的方法，
福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷 第 3 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2013 年 5 月
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2013.03.014
克服了传统差异显示等技术假阳性率高和灵敏度不足等缺陷［6］，其最主要优点在于能有效分离低丰度的
差异表达基因，避免了表达序列标签(expressed sequence tag，EST)分析中高丰度基因重复测序的缺点．近
年来，通过构建抑制性消减 cDNA文库筛选差异表达基因的方法在黄瓜、月季、白茶等多种园艺作物上已
得到应用［7 － 8］．水仙花色差异可能与合成酶基因和转录调控基因的差异表达有关．本试验通过构建黄色、
白色水仙花瓣组织抑制消减杂交 cDNA文库，分离差异表达候选基因，旨在为进一步研究水仙花色形成的
分子机理提供参考．
1 材料与方法
1．1 材料
多花水仙的栽培品种‘金盏银台’(白色花瓣)和‘黄花水仙 2 号’(黄色花瓣)均由福建农林大学园艺
植物遗传育种研究所提供，两个品种水仙花瓣颜色明显差异，其他生物学特征和特性基本一样．供试水仙
于 2011 年 10 月下旬种植在试验田间，2012 年 2 月取两个品种盛花初期的花瓣置于 RNAfree离心管中，保
存在 － 86 ℃的冰箱中备用．
主要试剂有 TAKARA MINIBEST Universal RNA Extraction Kit、Clontech SMARTerTM PCR cDNA Synthe-
sis Kit、Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit、DNA Fragment Purification Kit、PMD19-T Vector、JM109
感受态细胞、PrimeScript RT Reagent Kit、SYBR Premix ExTaq等，均购自宝生物(大连)有限公司．
1．2 方法
1．2．1 总 RNA的提取和 dscDNA的合成 按照 TAKARA MINIBEST Universal RNA Extraction Kit 的方法
提取总 RNA，测定光密度(D)后取 1 μL 总 RNA 进行 1%琼脂糖凝胶电泳．取等量总 RNA 参照 Clontech
SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit说明书进行 dscDNA合成．
1．2．2 文库构建 将样品含量调至 300 ng·μL －1，参照 Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit 说明
书进行抑制消减杂交，以黄色花瓣为测试子，白色花瓣为驱动子，得到正向抑制性消减文库;以白色花瓣为
测试子，黄色花瓣为驱动子，得到反向抑制性消减文库．
1．2．3 接头效率和消减效率的检测 以中国水仙肌动蛋白序列(基因库登录号:JN204912．1)为内参基因
设计引物，引物序列 F:5-GCTTGACCTTGCTGGGAGAG-3，R:5-CTCCTTGCTCATCCGATCAG-3．
1．2．4 阳性克隆的鉴定和测序 采用 DNA Fragment Purification Kit对第 2 次 PCR扩增产物进行纯化．取
100 ng产物与 50 ng PMD19-T Vector连接，热激转化至 JM109 感受态细胞中．蓝白斑筛选阳性克隆，每个
文库随机挑选 24 个阳性克隆(白斑)进行 PCR鉴定阳性克隆率．每个文库随机挑选 216 个阳性克隆送宝
生物工程(大连)有限公司测序．
1．2．5 生物信息学分析 测序结果去除载体序列和接头序列，经剪切拼接后得到 uniESTs．去除长度小于
150 bp 的片段，在美国国立生物信息中心(NCBI)网站(http:/ /blast． ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi)进行
BlastN和 BlastX比对分析，设置阀值(E)＜ 10 －5为已知功能基因，E ＞ 10 －5为新基因． 通过基因本体论
(gene ontology ，GO)注释具体 uniEST所处的细胞位置、发挥的分子功能、参与的生物过程三方面的功能信
息，利用网络 GO注释绘图工具(web gene ontology annotation plot，WEGO) (http:/ /wego． genomics． org． cn /
cgi － bin /wego / index． pl)输出功能分类结果图．
1．2．6 花色合成相关差异表达候选基因的荧光定量验证 选取与色素形成紧密相关的 uniESTs进行进一
步验证，引物设计见表 1．按照 PrimeScript RT Reagent Kit说明书进行反转录总 RNA，应用 SYBR Green 荧
光染料嵌合法，分别对各样品的内参基因和目的基因进行定量，每个反应设置 3 个重复和 1 个阴性对照．
利用 2 －△△Ct法进行目的基因相对表达量分析．
2 结果与分析
2．1 总 RNA质量检测
从黄色、白色花瓣的总 RNA电泳图(图 1)可见，28S和 18S核糖体 RNA条带清晰，完整性好，无 DNA
污染和降解现象，28S ∶ 18S条带亮度的比值接近 2∶ 1．经紫外分光光度计测定，两个样品的 D260 nm /D280 nm均
为 1．8 － 2．1，说明 RNA质量完好，能够满足消减文库的构建要求．
·092· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
表 1 荧光定量 PCR验证的引物
Table 1 Primers of real-time PCR
测序号 推测功能基因 引物名称 引物序列
对照 内参基因 ACTIN-F 5-GAGACCTTCAATGTTCCTGCTATG-3
ACTIN-R 5-CTAACACCATCACCAGAATCCAAC-3
B25 黄烷酮-3-羟化酶(F3H) F3H-F 5-TGCGAGAGCTTGCTCTGATACT-3
F3H-R 5-TTGTTTCCCGAGTGCCTTCT-3
B86 对香豆酸-3-羟基化酶(C3H) C3H-F 5-GCAATCTATGTTAGGGCATCTACTG-3
C3H-R 5-GAATCGCAACCGCCTGTAAAG-3
H156 咖啡酸甲基转移酶(COMT) COMT-F 5-ATTACCTACGGAGAACCCACAAG-3
COMT-R 5-TATCGCCTTTCCATCCTTCCAC-3
B170 类胡萝卜素异构酶(CRTISO) CRTISO-F 5-CGGTGATGTTTGGATTCAGTGAC-3
CRTISO-R 5-GAACAGAAAGATTTCCTGGTAGATGG-3
B133 二氢黄酮醇还原酶(DFR) DFR-F 5-TTCATACTCGGATAGCGTCTTGG-3
DFR-R 5-GACACCTCTTCATCTCTCATTTGC-3
H2 5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR) DXR-F 5-ACCTAGTTGTCAACCCTTCA-3
DXR-R 5-GCCTCCGTTTCTTCTTTT-3
H193 黄酮醇 3-羟基化酶(F3H) F3H-F 5-TGGAAATTGCCAGATGGGATGAC-3
F3H-R 5-GCTCAAGAACCACCTCTAACG-3
H86 黄酮合酶Ⅱ(FNSⅡ) FNSⅡ-F 5-TGATGTTCAAGATTGTAAGATGCTACC-3
FNSⅡ-R 5-TCACTAACCCTCTCCCATTCAAAG-3
H116 类黄酮 O-甲基转移酶(FOMT) FOMT-F 5-ATGTCTCTAAAATGTGCCGTTGAG-3
FOMT-R 5-GCAAGGAGAGCGAAGAGAGAAG-3
H135 1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-磷酸合酶(HDS) HDS-F 5-ATGGTTCTGTTCTTATGTCTGTGTC-3
HDS-R 5-ACTGTTGCTAAATCCTTGAATGGC-3
B142 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A合酶(HMGS) HMGS-F 5-CGCCGTGACGAAATCTTTGG-3
HMGS-R 5-TCAACACCCGTTCAGCCTATC-3
H185 NAC转录因子(NAC) NAC-F 5-TCAGCCGCCTTCATTCTTGC-3
NAC-R 5-GATCCTTCCATGCCCGTTACC-3
H32 八氢番茄红素合成酶(PSY) PSY-F 5-TGAGAGGAGAAGAGCCATTTGG-3
PSY-R 5-GCGGAAGGTGTAATATGAGAAGC-3
H69 WD40 转录因子(WD40) WD40-F 5-AAATAAACCACCTTCCATCATCACTC-3
WD40-R 5-TGGGACAGATATAAAGCAGGCTAG-3
H16 WRKY转录因子(WRKY) WRKY-F 5-TGTGCTCGCCCTCATAAGTTG-3
WRKY-R 5-CCTACTTCAGATGCTCATTTGCC-3
M:DL2000 DNA Marker;1:白色
花瓣;2:黄色花瓣．
图 1 总 RNA电泳检测图
Fig． 1 Electrophoretogram of detection of total RNA from perianths
2．2 抑制消减杂交后第 2 次 PCR结果和消减效率检测
从正、反向消减杂交后第 2 次 PCR 产物的电泳图
(图 2)可见，在消减后的样品中，只有带两个不同接头
的差异片段能大量富集，与未消减相比，经过消减杂交
的 cDNA 电泳条带亮度减弱，说明消减效果不错．消减
杂交后的 PCR产物弥散在 300 － 1000 bp． 平行试验中
对照样本(试剂盒提供)消减效果的电泳图与操作手册
一致，也可以判断此次消减效果较理想．
以消减杂交前后的产物中内参基因的丰度差异来
判断文库的消减效率．对正、反向消减和未消减待测子
cDNA池分别扩增 18、23、28、33 个循环，PCR 产物的电
泳图(图 3)显示:正、反向消减的在 28 次循环后才隐约
出现条带，而未消减的待测子在 23 次循环后已出现明
显的条带，说明本试验的消减效率不错．
·192·第 3 期 何炎森等:多花水仙花瓣抑制消减杂交 cDNA文库的构建及分析
2．3 测序结果分析
从正、反向文库中各随机挑选 24 个阳性克隆进行 PCR鉴定，从产物的电泳图(图 4)观察到插入片段
的大小主要集中在 250 － 750 bp，正、反向文库的阳性克隆率都为 24 /24．在随机挑选正、反向消减杂交文
库各 216 个阳性克隆的测序结果中，正向正常的单克隆 188 个，属于非单克隆和测序反应失败的有 28 个，
测序成功率为 87% ．去除载体及接头序列后，经剪切拼接后得到 157 个符合要求的 uniESTs．反向正常的
单克隆 196 个，属于非单克隆和测序反应失败的有 20 个，测序成功率为 90% ．去除载体及接头序列后，经
剪切拼接后得到 170 个符合要求的 uniESTs．
M:Ф X174 － Hae III digest;1、2 分别为杂交、未杂交二次 PCR产物(白色花瓣为测试子，黄色花瓣为驱动子) ;3、4 分别为杂交、
未杂交二次 PCR产物(黄色花瓣为测试子，白色花瓣为驱动子) ;5、6 分别为杂交、未杂交平行试验中对照二次 PCR产物．
图 2 正、反向文库消减杂交的第二次 PCR产物电泳图
Fig． 2 Electrophoretogram of subtracted products after second round PCR
M:DL2000 DNA Marker;1 － 4 和 5 － 8 分别为白色花瓣消减和未消减的 18、23、28、33 个循环 PCR产物;
9 － 12 和 13 － 16 分别为黄色花瓣消减和未消减的 18、23、28、33 个循环 PCR产物．
图 3 正、反向文库消减效率的检测电泳图
Fig． 3 Electrophoretogram of detection of subtraction efficiency of the forward and reverse SSH libraries
M:DL2000 DNA Marker;1 － 24:随机挑选的阳性克隆的 PCR产物．
图 4 正、反向消减文库阳性克隆的随机检测电泳图
Fig． 4 Electrophoretogram of detection of randomly picked positive clones from the forward and reverse SSH libraries
·292· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
2．4 差异表达 EST的功能分类
在 NCBI网站上对正向 157 个 uniESTs、反向 170 个 uniESTs进行 BlastN和 BlastX比对分析，发现正、
反向文库中分别有 134 和 149 个 uniESTs 与已鉴定、推测或未知的水仙、郁金香、大蒜、水稻、玉米、拟南
芥、葡萄等植物蛋白质有显著的同源性;正、反向文库中分别有 23 和 21 个 uniESTs新基因，与数据库中的
核酸、蛋白质序列均没有显著同源性．
通过 GO注释具体 uniEST的分子功能，利用 WEGO 工具对正、反向文库中已知功能的 uniESTs 进行
功能分类．从输出的分析结果(图 4)可以看出:在细胞成分功能的分类中，反向文库中独有与胞外区相关
的 uniESTs;在分子功能的分类中，反向文库中独有与酶调节活性相关的 uniESTs;在生物学过程功能的分
类中，正、反向文库中都涉及到组织结构形成、生物学调控、细胞过程、定位、代谢过程、色素淀积、生殖过
程、刺激反应、病毒复制等生物学途径，其中，正向文库中与色素淀积途径相关的 uniESTs 比反向文库多;
反向文库中独有与内部组织构造形成、细胞成分生物合成、多有机体过程等相关的 uniESTs，正向文库中独
有与死亡相关的 uniESTs．
图 5 正、反向消减文库 uniESTs的功能分类图
Fig． 5 The function classification map of uniESTs from the forward and reverse SSH libraries
2．5 花色合成相关差异表达候选基因的荧光定量二次筛选
WEGO工具分类分析结果显示，正、反向文库中与色素途径相关基因同源的 uniESTs主要包括类胡萝
卜素途径、类黄酮途径和转录调控因子． 其中，涉及类胡萝卜素代谢途径的基因有八氢番茄红素合成酶
(PSY)、类胡萝卜素异构酶(CRTISO)、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)、1-羟基-2-甲基-2-丁烯基-4-磷
酸合酶(HDS)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A合酶(HMGS) ;涉及类黄酮代谢途径的基因有二氢黄酮醇还原
酶(DFR)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、黄酮醇 3-羟基化酶(F3H)、黄酮合酶Ⅱ(FNSⅡ)、类黄酮-O-甲基转
移酶(FOMT)、咖啡酸甲基转移酶(COMT)、对香豆酸-3-羟基化酶(C3H) ;涉及转录调控的基因有 WRKY、
NAC、WD40 等转录因子等．
为了初步验证所获得与色素途径相关 uniESTs的真实性，对上述可能与色素合成相关的 15 个uniESTs
进行荧光定量验证．结果(图 6)显示，内参基因在两个品种花瓣中的表达量基本一致，证实了试验的可靠
性．候选基因 COMT(H156)、F3H(H193)、FNSⅡ(H86)、HDS(H135)、FOMT(H116)、NAC(H185)、PSY
(H32)、WRKY(H16)等在黄色花瓣中的表达水平比白色花瓣高，而 F3H(B25)、C3H(B86)、CRTISO(B170)在
白色花瓣中的表达水平比黄色花瓣高，说明这 11个 uniESTs可以作为水仙花色差异的候选基因．而从反向文
库中分离的 DFR(B133)在白色花瓣中的表达水平却比黄色花瓣低，DXR(H2)、HMGS(B142)、WD40(H69)在
黄色和白色花瓣中的表达水平没有明显差异，因此推测 B133、H2、B142、H69为假阳性克隆．
·392·第 3 期 何炎森等:多花水仙花瓣抑制消减杂交 cDNA文库的构建及分析
图 6 候选 uniESTs在黄色、白色花瓣中的相对表达量
Fig． 6 Relative expression of the candidate uniESTs in yellow and white perianth
3 讨论
由于材料本身的遗传背景、RNA完整性、消减效率等因素都会造成消减结果存在一定的假阳性，通常
采用反向 Northern斑点杂交法、PCR-SelectTM Differential Screening Kit 和表达谱芯片等方法进一步去除假
阳性．反向 Northern斑点杂交法需要制备探针及对每个克隆进行 PCR，再进行人工点膜，工作量较大． 同
时，由于 ESTs片段的大小不一，而杂交时间、温度都一样，对低丰度差异表达基因的灵敏度不够，也可能造
成部分差异表达信息的丢失． PCR-SelectTM Differential Screening Kit 用 32P-dGTP 同位素标记探针，在普通
实验室的使用受到限制［9］．表达谱芯片技术受到水仙花基因组了解程度的限制，非商品化芯片制作成本
太高．随着生物信息学的快速发展和测序费用的大幅下降，对消减文库的二次筛选、生物信息学分析、时空
表达分析的顺序改变或环节减免是一个值得探讨的问题［10］．实时荧光定量 PCR 通过荧光信号实时监测
整个 PCR过程，并利用标准曲线对未知基因进行定量分析，在差异表达基因的筛选上比反向 Northern 斑
点杂交和 RT-PCR 具有特异性强、灵敏性高、精确性高等优势［11］．为提高差异表达基因的研究效率，在消
减文库质量较好的前提下，和前人研究一样采取先测序再筛库的方法［12 － 13］，即先对消减文库进行测序、生
物信息学分析和功能分类，再对色素形成相关的 uniESTs进行实时荧光定量 PCR二次筛选．
本试验成功构建了不同颜色水仙花瓣的正、反向抑制消减杂交文库，对已获得注释的 uniESTs 进行
GO功能分类分析发现，正、反向文库中的差异表达基因均涉及多条代谢途径． 有些代谢途径似乎与花色
形成没有直接相关，可能是由于数据库中的一些基因具有多种功能注释所造成的，也不排除两个转录本之
间遗传背景差异的影响．消减文库经荧光定量 PCR 二次筛选，发现 15 个花色相关候选 ESTs 中有 4 个为
消减文库假阳性克隆，11 个为差异表达基因．差异表达基因中有许多与色素生物代谢相关的结构基因和
色素生物合成调控有关的转录因子，说明水仙花色的差异可能既有结构基因的参与，又有一些调节基因的
调控［14］．
类胡萝卜素是许多花和果实的主要色素，其生物合成的第一步是由 PSY 基因催化牻牛儿基牻牛儿基
焦磷酸(GGPP)转化为八氢番茄红素，PSY基因是作物与果实类胡萝卜素代谢途径中的一个关键调节酶．
水仙属植物花朵中色素的主要成分为类胡萝卜素，花色的深浅取决于类胡萝卜素所含两种色素 β-胡萝卜
素和叶黄素的含量［15］．从正向文库中分离到与 PSY基因同源的 uniEST，盛花初期 PSY 基因在黄花水仙 2
号黄色花瓣中的表达量是金盏银台白色花瓣的 40 多倍，推测 PSY 基因的差异表达对水仙花色的差异起
到极其重要的作用． 在类胡萝卜素代谢途径中，八氢番茄红素转化为番茄红素是八氢番茄红素脱氢酶
(PDS)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)和 CRTISO 3 个酶共同作用的结果，CRTISO基因对 β-胡萝卜素和叶黄素
的合成及花色形成起很重要的作用［16］，在反向文库中分离得到与 CRTISO 基因同源的 uniEST，CRTISO 基
·492· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
因在水仙花色形成中的功能值得深入研究．
植物体内类胡萝卜素前体物的生物合成存在甲羟戊酸(MVA)和 2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)
2 条不同的代谢途径． MEP代谢途径定位于质体，主要参与二萜、单萜、类胡萝卜素、异戊二烯等的生物合
成［17］，质体 MEP途径中的 DXS基因和 HDR基因是类胡萝卜素代谢的限速因子［18 － 19］，花色不同可能与类
胡萝卜素前体物异戊烯基焦磷酸(IPP)或二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的生物合成途径不同有关．从正
向文库中筛选分离到质体 MEP途径中与 HDS基因同源的 uniEST，水仙花中 HDS 基因的差异表达对花色
形成的影响值得进一步研究．
许多植物花色的变化是由类黄酮物质种类和含量的变化引起的，水仙的花色合成途径可能以类胡萝
卜素代谢途径为主，类黄酮代谢途径为辅．在正向文库中发现与类黄酮代谢途径关键酶 F3H和 FNS 同源
的 uniESTs(H193、H86) ，皆属于细胞色素 P450 单加氧酶，它能在辅因子 NAD(P)H 和 O2 的作用下，催化
单加氧反应，合成花和种皮中的重要成色物质———花色素和原花色素的前体［20］． 在反向文库中发现与
F3H同源 uniEST，F3H 基因的功能是催化(2S)-柚皮素(4，5，7-三羟黄烷酮)生成花色素苷的前体
(R2，R3)-二氢山奈酚． F3H基因失去活性［21］，或者其下游基因 DFR、ANS 不起作用都可能影响花色素苷
的积累．定量验证表明，此基因在白花中的表达量是黄花的 4 倍，多花水仙 F3H基因与花色的关系尚待进
一步研究．
转录因子通过与结构基因启动子的顺式作用元件结合，激活类黄酮色素物质合成途径中多个基因的
表达［22］．目前，已克隆和鉴定植物体内调控色素生物合成途径的转录因子，分别属于编码 MYB、MYC、
bZIP、WD40、锌指等蛋白类型的基因家族，它们大多控制花色、种皮颜色等表型性状［23］，与植物表皮细胞
形态分化有着密切的关联．在拟南芥中 WRKY转录因子 TTG2 基因与 WD40 转录因子 TTG1 基因、MYB转
录因子 TT2 基因、bHLH 型转录因子 TT8 基因一起调控原花色素的合成［24］． 从正向文库中分离到与
WRKY、NAC转录因子同源的 uniEST，对 WRKY、NAC转录因子的研究目前尚处于基因克隆、结构鉴定和
表达分析等层面上，对其具体调节哪些下游目标基因和受到哪些上游因子的调控还不是很清楚［25 － 26］．这
两个转录因子是否参与花瓣颜色的形成值得进一步验证．在正向文库中发现与 COMT基因同源的 uniEST
和在反向文库中与 C3H基因同源的 uniEST，这两个基因涉及木质素的合成途径，COMT 基因促进 S-木质
素的合成［27］，而 C3H基因促进 H-木质素的合成［28］．这两个基因的差异表达可能影响木质素的含量或单体
组成致使花瓣表皮细胞结构变化从而间接影响水仙的花色，有必要通过电镜观察花瓣的组织结构来分析．
鉴于所获的正、反向文库的库容量很大(正向有效库容约 3 × 105，反向有效库容约 2 × 105) ，目前正在
对文库进行规模测序和筛选，旨在获得更多与色素形成相关的候选基因片段．总之，不同颜色水仙花瓣正、
反向抑制消减杂交文库的成功构建有助于深入研究水仙花色的形成机理，为进一步通过基因手段改良水
仙花色奠定一定的基础．
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( 责任编辑:施晓棠)
·692· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷