全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷 第 5 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2013 年 9 月
收稿日期:2012 － 11 － 20 修回日期:2013 － 01 － 05
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30972031) ;高校产学合作科技重大项目(2011N5101)．
作者简介:鲁娜(1987 －) ，女，硕士．研究方向:植物分子生物学． Email:752047071@ qq． coom．通讯作者陈晓静(1954 －) ，女，教授，博士生导
师．研究方向:园艺植物遗传育种． Email:xjchen804@ sina． com．
多花水仙花朵全长 cDNA文库的构建
鲁 娜1，2，陈晓静1，2，申艳红1，2，何玮毅3
(1．福建农林大学园艺学院;2．福建农林大学园艺植物遗传育种研究所;
3．福建农林大学应用生态研究所，福建 福州 350002)
摘要:采用 SMAＲT技术，以多花水仙‘黄花水仙 2 号’盛开期花朵为材料，构建其全长 cDNA文库，并对文库质量进行鉴定．
结果表明，所构建初始文库的滴度为 6．30 × 105 cfu·mL －1，扩增后文库的滴度为 1．58 × 108 cfu·mL －1，重组率为 84%，插入
片段大小集中在 500 － 2000 bp之间，平均长度约 970 bp，符合 cDNA文库的质量标准．可见，所构建的文库比较完整，能够
反映黄花水仙花朵盛开期基因的表达情况．
关键词:多花水仙;花色;SMAＲT技术;cDNA文库
中图分类号:S682．2 + 1 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2013)05-0518-05
Construction of a full-length cDNA library for flowers of Narcissus tazetta
LU Na1，2，CHEN Xiao-jing1，2，SHEN Yan-hong1，2，HE Wei-yi3
(1． College of Horticulture;2． Institute of Genetics and Breeding in Horticultural Plants;3． Institute of
Applied Ecology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract:The flowers of Narcissus tazetta L． cultivar Huanghua at full-bloom stage were used as material to construct a full-length
cDNA library using switching mechanism at 5end of ＲNA transcript (SMAＲT)strategy and the quality of the library was detected．
The results show that the titer of the primary library was 6．30 × 105 cfu·mL －1，the recombinant rate was 84% ． The insert frag-
ments concentrated in 500 － 2000 bp with an average size was about 970 bp． These results indicate that the cDNA library construc-
ted in this report accords with cDNA library quality standards and is relatively complete． It can reflect the genes expression in full-
blossom of N． tazetta cultivar Huanghua．
Key words:Narcissus tazetta;flower color;SMAＲT strategy;cDNA library
多花水仙(Narcissus tazetta L．)为石蒜科水仙属多年生草本植物，在中国已有一千多年的栽培历史，具
有很高的观赏价值和经济价值［1］．但多花水仙花色单一，栽培品种少，野生资源流失严重，且长期的营养
繁殖，导致现有品种退化和品质下降，严重阻碍了水仙花在国内外市场的发展［2 － 4］．目前，中国水仙新品种
的研究主要集中在花色基因的改良上［5］，与水仙花色形成相关的类胡萝卜素和类黄酮生物合成途径中的
主要合成酶基因已被克隆［6 － 11］，为利用基因工程改良水仙的花色提供了基础，但应用在水仙花色新品种的
研究尚未见报道．对已克隆基因的功能、表达调控以及不同基因间的互作等基础性研究还有待进一步深入．
随着构建 cDNA 文库技术的不断成熟与完善，通过构建 cDNA 文库研究某一组织在特定时期或者经
过特殊处理后基因的表达、基因的功能以及发现新基因，越来越多地受到研究人员的青睐．从 cDNA 文库
中能够筛选到所需要的目的基因，并直接用于该基因的表达［12］，被广泛应用于动物、植物、细菌等各个领
域． SAＲMT技术以其所需材料少、时间短、实验过程简单易操作、全长率高等优点，受到众多研究者的关
注［13 － 14］．到目前为止，有关水仙花 cDNA文库方面的研究尚未见报道．根据本实验室多年来对多花水仙的
一系列研究，结合水仙花开花过程中花被和副冠颜色的变化，将水仙开花过程分为 4 个研究阶段: (1)花
苞期(副冠、花被仍为绿色)、(2)花蕾期(副冠开始转色，花被仍为绿色)、(3)始花期(花被开始转色)、
(4)盛花期(形成各自不同的花色)． 水仙花盛花期花朵的颜色已经形成，且最为亮丽，花色素积累也最
多［15］;另外从本实验室已完成的研究获知，与多花水仙花色形成相关的类胡萝卜素和类黄酮生物合成途
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2013.05.023
径关键酶基因(PSY、PDS、ZDS、LCY-Β、CHI、CHS、F3H) ，大部分在盛花期都有表达［10 － 11，16］． 为此，本试验
采用 SMAＲT技术，以多花水仙‘黄花水仙 2 号’盛开期花朵为材料，构建其全长 cDNA 文库，用于分离参
与水仙花花色形成的关键基因，比较不同花色品种同一基因的 cDNA全长差异，在翻译水平上分析同一花
色品种的 cDNA序列及其基因组序列的异同，旨在为不同花色水仙育种亲本的选择提供参考，从而为进一
步利用基因工程培育具有新型花色水仙花品种奠定基础．
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料及取样 本试验所选材料为福建农林大学园艺学院园艺植物遗传育种研究所选育的‘黄
花水仙 2 号’，花被和副冠均为黄色，且花被颜色较副冠稍浅． 取盛开期花朵，用镊子去除花药和花柱，将
花被和副冠放入 1．5 mL的离心管中，迅速放进液氮中速冻，存放于 － 80 ℃，备用．
1．1．2 试剂 ＲNA 提取试剂盒为多糖多酚植物总 ＲNA 快速提取试剂盒，购自百泰克生物有限公司;
cDNA文库构建试剂盒 In-Fusion SMAＲTerTM Directional cDNA Library Construction Kit 和 PCＲ 试剂盒
Avantage 2 PCＲ Kit均购自 Clontech公司;大肠杆菌 ElectroMAXTM DH10BTM Cells购自 Invitrogen 公司;其
他试剂均为国产或进口分析纯．
1．1．3 引物合成 引物合成和测序均委托上海博尚生物技术有限公司完成．
1．2 方法
1．2．1 总 ＲNA的提取与检测 按照多糖多酚植物总 ＲNA 快速提取试剂盒的说明书提取黄花水仙花瓣
和副冠的总 ＲNA．取 2．0 μL ＲNA用 1．0%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后用 EB 染色，在紫外凝胶成像
仪上观察并拍照．取 1．5 μL ＲNA，在紫外分光光度计上测定光密度(D) ，并计算浓度．
1．2．2 双链 cDNA 的合成 参照试剂盒的说明书，取 ＲNA 样品约 1 μg，在 3 In-Fusion SMAＲTer CDS
Primer、5 × First-Strand Buffer、DTT、dNTP Mix、SMAＲTer V Oligonucleotide、ＲNase Inhibitor、SMAＲTScribeTM
Ｒeverse Transcriptase的参与下完成第一链的合成．
以长距离 PCＲ (long-distance PCＲ，LD-PCＲ)合成双链 cDNA，在预热的 PCＲ仪上进行扩增反应． PCＲ
反应程序:95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 6 min，23 个循环．反应结束后，取 5 μL PCＲ产物进行
1．0%琼脂糖凝胶电泳检测．
1．2．3 cDNA链分级分离、与载体连接及转化 按照试剂盒说明书的步骤，将得到的 cDNA 用 CHＲOMA
SPIN + TE1000 柱子进行分级分离，去除小于 500 bp 的 cDNA 片段． 将得到的各管 cDNA 取 3．0 μL 进行
1．0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化大于 500 bp 的片段．取最后得到的大于 500 bp 的 cDNA 1．5、2．0
μL，分别与载体 pSMAＲT2IFD于 50 ℃连接 15 min．将连接产物电转化入大肠杆菌 DH10B感受态细胞中，
于 225 r·min －1、37 ℃培养 1 h，即获得初始文库．
1．2．4 文库滴度的测定与文库的扩增 取 10 μL文库菌液，用 LB 液体培养基分别稀释 100 倍、10000 倍
后，各取 10、50 μL涂于预热的含有氨苄的琼脂平板上，吸收 15 min，于 37 ℃培养过夜．根据平板上的克隆
数，计算文库滴度 /(cfu·mL －1)．计算公式为:文库滴度 =(克隆数 /涂板体积)×稀释倍数．
采用平板来扩增原始文库．根据文库的滴度，计算需要的平板数目，将菌液稀释后均匀涂在平板上，于 37
℃培养 18 －20 h．然后每个平板加 3 mL含 25%甘油的 LB液体培养基，将菌液刮下来，分装，置 －80 ℃保存．
1．2．5 插入片段长短及重组率的检测 从文库中随机挑取单克隆于含氨苄的 LB 液体培养基中，于 220 r
·min －1、37 ℃摇至菌液浑浊． 取 1 μL 菌液作为模板进行 PCＲ 检测． PCＲ 反应体系如下:1． 0 μL 模板
DNA、19．5 μL 去离子水、2． 5 μL 10 × Advantage 2 PCＲ Buffer、0． 5 μL 50 × dNTP Mix、0． 5 μL Forward
Screening Primer (20 μmol·L －1)、0．5 μL Ｒeverse Screening Primer (20 μmol·L －1)、0．5 μL 50 × Advanta-
ge 2 Polymerase Mix． PCＲ反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，3 个循环;95 ℃ 30 s，
68 ℃ 3 min，30 个循环;4 ℃保存．反应结束后进行 1．0%琼脂糖凝胶电泳检测．
915第 5 期 鲁娜等:多花水仙花朵全长 cDNA文库的构建
2 结果与分析
2．1 黄花水仙总 ＲNA的提取与检测
ＲNA经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图 1)显示，28S和 18S ＲNA的条带清晰，整齐，可以看到很淡
的 5S条带，且 28S rＲNA与 18S rＲNA的条带亮度之比接近 2∶ 1，说明所提取的 ＲNA 完整性比较好，无降
解．经紫外分光光度计测定，其 D260 nm /D280 nm为 2．1，D260 nm /D230 nm为 2．14，浓度为 768．4 ng·μL
－1，说明所提取
的ＲNA中无多糖、蛋白质、酚类等的污染．综上表明，所提取的ＲNA纯度和完整性均已满足构建文库的要求．
2．2 黄花水仙双链 cDNA的合成
ＲNA经过逆转录酶合成单链 cDNA，然后通过 LD-PCＲ 合成双链 cDNA． 经 1．0%琼脂糖凝胶电泳检
测，结果(图 2)显示，所合成的双链 cDNA呈弥散状，大多数集中在 500 bp以上，说明合成的双链 cDNA完
整性很好，符合构建文库的要求，可以进行下一步试验．
2．3 黄花水仙 cDNA的分级分离
将合成的 cDNA通过 CHＲOMA SPIN + TE1000 分级分离，共收集到大小不同的 cDNA 片段 16 管，每
管各取 3 μL进行 1．0%琼脂糖凝胶电泳检测．结果(图 3)显示，7 － 10 管的 cDNA片段大小均大于 500 bp，
合并 7 － 10 管的 cDNA，舍去 11 － 16 管，以避免小片段 cDNA优先与载体连接，从而影响文库的质量．
M:DL2000Maker;1 － 16:双链 cDNA．
图 3 双链 cDNA片段的分级分离
Fig． 3 Double strand cDNA size fractions
2．4 黄花水仙 cDNA文库质量的检测
2．4．1 文库的滴度 文库的滴度反映的是文库容量的大小，文库的库容量就是指来源于该组织信息量的
多少．通过统计菌落的数目以及公式的计算，黄花水仙 cDNA文库的滴度为 6．30 × 105 cfu·mL －1，扩增后
文库的滴度为 1．58 × 108 cfu·mL －1，说明本试验构建的 cDNA文库是有效的文库．
2．4．2 插入片段大小及重组率的检测 连接产物经转化涂板后，随机挑取 32 个单克隆到含有抗生素的
LB液体培养基中，37 ℃下摇菌至浑浊，作为模板进行 PCＲ 检测，1．0%琼脂糖凝胶电泳结果如图 4 所示．
图 4 显示，插入片段大小集中在 500 － 2000 bp之间，平均长度约 970 bp，插入片段较长，重组率为 84%，符
025 福建农林大学学报(自然科学版) 第 42 卷
合文库的要求．综上所述，本试验构建的 cDNA文库质量符合要求，可以用于与花色形成相关基因的分离．
3 讨论
cDNA文库的构建与分析是分子生物学的基本方法之一［17］．张利义等［18］为了研究苹果类黄酮代谢的
分子机制，利用 SMAＲ法构建‘变叶海棠’苹果幼叶的全长 cDNA 文库，并通过测序获得了一条查尔酮合
成酶(CHS)基因．李慧玉等［19］构建了 NaCl胁迫下柽柳的 cDNA文库，并对从文库中获得的 EST序列进行
拼接，获得了 7 条刚毛柽柳 AQP(thAQP)的单一序列．而本试验将 cDNA文库的构建应用于水仙花尚属首
例． cDNA文库的种类及构建方法很多，根据文库的特征差异，cDNA 文库主要包括以下几种:经典 cDNA
文库、标准 cDNA文库、全长 cDNA文库、差减 cDNA文库、酵母双杂交文库、mＲNA差异显示文库、限制性
cDNA文库等［20］．如何根据研究目的来正确选择 cDNA的类型和构建方法是非常关键的．本试验之所以选
择构建全长 cDNA文库，是因其可以快捷高效地获得大量包含完整阅读框(包含 3和 5非翻译区)的全长
基因序列，这不仅能大大提高基因测序和生物信息学分析的进程，还利于后期蛋白质表达及功能分析［21］．
Clontceh公司的 In-Fusion SMAＲTerTM Directional cDNA Library Construction Kit 试剂盒，进一步改进了运
用 SMAＲT法［22］构建文库的实验步骤，通过 SMAＲTer 方法合成的 cDNA 两端具有已知序列的粘性末端，
这样就与试剂盒中提供的 pSMAＲT2IFD载体的两端序列互补，与 In-Fusion HD Cloning Kit 试剂盒配套使
用，将与载体的连接时间从十几个小时缩短到 15 min，并能准确无误地将合成的 cDNA 插入载体中．与原
来的方法比较，省去 SfiⅠ酶切和蛋白酶 K消化的步骤，使整个试验过程更简单易行，在更短的时间内构建
高质量的全长 cDNA文库，提高研究工作的效率．
ＲNA的质量是决定 cDNA文库质量的关键．本试验所提取的黄花水仙总 ＲNA的完整性和纯度均满足
构建文库的需要．总 ＲNA没有经过 mＲNA的纯化，减少纯化过程中 mＲNA的破坏、降解和丢失，最大限度
地保证 mＲNA的完整，也使试验步骤简化［23 － 24］．重组率、插入片段长短以及文库的滴度是衡量文库质量
的重要标准［24 － 25］． cDNA的分级分离以及与载体的连接步骤可直接影响文库的质量． cDNA 分级分离时，
要去除小于 500 bp的 cDNA片段，否则小片段会优先与载体连接，从而导致文库插入片段过短，影响文库
的全长率．与载体连接的效率与 cDNA的浓度有关，为确定最佳的连接效率，本试验设置两个浓度梯度，但
重组率只有 84%，说明 cDNA浓度与载体的比例还是没有把握好，可多设几个浓度梯度．
一般来说，合格的文库滴度至少要达到 1 × 105 cfu·mL －1，重组率至少达到 80%以上［26］;如果要求筛
选到某低丰度 mＲNA 的概率为 99%，那么文库所包含的克隆数应至少达到 1．7 × 105 cfu·mL －1［24］．本试
验所构建的黄花水仙 cDNA 文库，未扩增文库的滴度为 6． 30 × 105 cfu·mL －1，扩增后文库的滴度为
1．58 × 108 cfu·mL －1，重组率为 84%，插入片段大小集中在 500 － 2000 bp 之间，平均长度约 970 bp，符合
125第 5 期 鲁娜等:多花水仙花朵全长 cDNA文库的构建
cDNA文库的质量标准．插入片段较长，说明所构建的文库比较完整，能够包含黄花水仙在开花过程中绝
大多数基因表达的 cDNA信息，不仅可用于筛选分离花色的相关基因，还可以用来分离花香、花型的相关
基因，为进一步研究黄花水仙花色的形成机制奠定很好的基础．此外，本试验也为构建水仙其他花色品种
类型的花朵 cDNA文库提供很好的技术借鉴．本实验室将进一步通过文库的筛选和测序，找出影响水仙花
色形成的关键基因，结合其启动子研究关键基因的功能，并利用一些研究差异表达基因的方法来探讨水仙
花花被和副冠不同颜色形成的原因，旨在为进一步利用基因工程培育具有新型花色水仙花品种奠定基础．
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(责任编辑:施晓棠)
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