全 文 ：毛冬青总皂苷的提取工艺及纯化鉴定研究
尹文清 1, 2 ,周中流 1 ,邹节明2 ,孟　杰 2 ,傅春燕 1
(1.广西师范大学化学化工学院 ,广西桂林 541004;2.桂林三金股份有限公司 ,广西桂林 541004)
　　摘要　目的:研究毛冬青总皂苷最佳提取工艺 , 并将总皂苷进行纯化鉴定。方法:采用正交实验 , 考察乙醇浓
度 、提取温度 、固液比及提取时间四个因素对该工艺的影响;利用 D101大孔树脂分离 , 溶剂沉淀纯化毛冬青总皂
苷。结果:确立了毛冬青总皂苷的最佳提取工艺为:提取温度为 80℃,乙醇浓度 50%, 固液比 1∶5, 提取时间 1 h;纯
化后的总皂苷经红外光谱初步鉴定与 I lexsaponin B1对照品具有相同的苷元结构。结论:优选出的最佳提取工艺条
件及纯化总皂苷的方法对进一步的工艺开发有较好的参考价值。
关键词　毛冬青;总皂苷;提取工艺;纯化;鉴定
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)09-1153-03
基金项目:桂林三金药业股份有限公司横向课题(2004)作者简介:尹文清(1968-),女,副教授 ,博士 ,硕士生导师 ,主要研究方向为天然产物研究与开发;Te l:0773-5826789, E-m ail:yinwq0000@ ya-
hoo. com. cn。
　　毛冬青 (Ilex pubescensHook. e t A rn)是冬青科
冬青属的一种植物 ,常绿灌木 ,产于广东 、广西 、安
徽 、福建 、浙江 、台湾等地 。毛冬青的根是我国江南
一些省区民间常用药 ,具有活血通脉 、消肿止痛 、清
热解毒之功效。经现代药理实验和临床应用证明 ,
是治疗心血管疾病较好的药物 〔1〕。毛冬青及其制
剂主要收载于地方药品标准中 ,中国药典 77年版也
曾收录过 ,目前该制剂主要是毛冬青片剂 、胶囊和注
射剂 ,其主要活性成分为三萜皂苷类化合物 ,具有抗
血小板聚集 、抗高胆固醇血脂 、抗血栓等多种药理活
性 〔2〕。
毛冬青根中三萜总皂苷的提取工艺尚未见报
道 ,本文拟通过正交实验研究毛冬青根中总皂苷的
最佳提取工艺条件 ,并对采用该方案提取的毛冬青
总皂苷进行分离 、纯化及鉴定 ,为本地毛冬青及毛冬
青皂苷的开发利用提供实验数据和理论指导。
1 　材料 、试剂与仪器
1.1 　材料与试剂　毛冬青干燥根由广西柳州市中
药饮片厂提供 ,药材经由广西师范大学生命科学院
唐绍清教授鉴定为冬青科植物毛冬青 Ilex pubescens
Hook. e tA rn的干燥根。三萜皂苷 Ilexsaponin B1对
照品系笔者从广西毛冬青根中分离得到的单体 ,其
它试剂均为分析纯。
1.2 　仪器　TU-1901双光束紫外可见分光光度计
(北京普析通用仪器有限责任公司 );旋转蒸发仪
(上海亚荣生化仪器厂 );电子天平 (沈阳龙腾电子
称量仪器有限公司)。
2 　实验方法
2.1　样品提取工艺　称取毛冬青干燥根粗粉 10.0
g,按表 2所示的正交条件 ,采用不同体积分数的乙
醇加热回流提取 ,合并所得浸膏加水溶解 ,依次用乙
醚 、水饱和的正丁醇萃取 ,合并并减压蒸干萃取液 ,
干燥得到毛冬青总皂苷 。
2.2　毛冬青干燥根中总皂苷类成分的定量测定　
以三萜皂苷 Ilexsaponin B1为对照品 ,根据三萜皂苷
类化合物的芳香醛-浓硫酸或高氯酸显色反应 ,用分
光光度法测定皂苷含量并计算毛冬青总皂苷提取
率。
2.3　毛冬青总皂苷的定性检测　取提取实验以及
纯化实验中制备的毛冬青浸膏进行典型的三萜皂苷
定性检测试验 ,以确定提取物是否含有皂苷 。
2.3.1 　泡沫试验:取毛冬青浸膏 ,加入 5 m l水溶
解 ,置于 10 m l比色管中剧烈振摇 ,有絮状泡沫产
生 ,并维持达 15 m in以上 ,同时做空白对照试验 ,产
生的泡沫在 1m in内消失。
2.3.2 　Liebe rmann反应:将毛冬青浸膏加醋酐溶
解 ,然后滴 1滴浓硫酸 ,摇匀 ,迅速分层 ,且在两液层
中间出现紫红色环 。
2.3.3 　TLC检测:取毛冬青浸膏加甲醇溶解 ,用毛
细管取溶液点于硅胶 G薄层板上 ,用展开剂甲醇-氯
仿-水(6.5∶3.5∶1)上层液展开 ,经 10%浓硫酸乙醇
显色 ,薄层板上呈现红色的斑点。
2.4　正交实验　选取乙醇浓度 、提取温度 、固液比
及提取时间四因素作 L9(34)正交实验 ,并对结果进
行方差分析和显著性检验。
3　结果与分析
3.1　毛冬青总皂苷的定量测定
3.1.1 　标准溶液和标准曲线的测定:Ilexsapon in
B1对照品经香草醛-高氯酸显色后于 TU-1901双光
束紫外可见分光光度计上作最大吸收波长扫描并绘
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DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牱牣牥牴牣牥牫牬
制扫描曲线 ,显色后 ,反应产物在 550nm处有最大
吸收且反应 2 h内其吸收光度保持稳定 。
精密吸取 Ilexsaponin B1对照品溶液 (0.1500
mg /m l)0.10m l、0.20m l、0.30m l、0.40m l、0.50m l、
0.60m l于比色管中 ,加 5%香草醛冰醋酸溶液 0.20
m l,高氯酸 0.80 m l,于 60℃水浴加热 15 m in,冰水
中冷却 5 m in,分别加冰醋酸 5 m l摇匀 ,以试剂空白
对照 ,反应产物在 550 nm处测定吸收值 ,以 Ilexsa-
ponin B1为标准品绘制测定标准曲线为 Y =
0.00214X+0.0053,式中 Y为吸光度 , X为 Ilexsapo-
nin B1含量(μg), X在 15-90 μg范围内线性关系良
好 ,相关系数 r=0.9997。
3.1.2　毛冬青总皂苷的提取率测定:称取 30.0mg
按各工艺制备的浸膏 ,溶于甲醇并定容至 50 m l,测
定其毛冬青总皂苷的提取率。
　表 1 　正交实验因素水平
水平
因素
A乙醇浓度(%) B温度(℃) C固液比(g /m l) D时间(h)
1 50 60 1 /5 1
2 60 70 1 /10 2
3 70 80 1 /20 3
　表 2 　L9(34)正交实验结果
实验号 A B C D 皂苷提取率(%)
1 1 1 1 1 5.83
2 1 2 2 2 4.67
3 1 3 3 3 5.12
4 2 1 2 3 4.57
5 2 2 3 1 5.41
6 2 3 1 2 4.59
7 3 1 3 2 4.47
8 3 2 1 3 4.91
9 3 3 2 1 5.38
K1 15. 62 14.87 15. 33 16. 62
K2 14. 57 14.99 14. 62 13. 73
K3 14. 76 15.09 15. 00 14. 60
K′1 5. 21 4.96 5. 11 5. 54
K′2 4. 86 4.99 4. 87 4. 58
K′
3 4. 92 5.03 5. 00 4. 87
R 0. 35 0.07 0. 24 0. 96
3.2 　正交实验的设计及结果　用乙醇为溶剂提取
的四因素 、三水平正交实验因素水平见表 1,结果见
表 2 ,对表中皂苷提取率进行方差分析 ,结果见表 3。
表 2中出现 K 1 , K2 , K3分别代表某个因素的不同水
平的指标值加和 , K′1 , K′2 , K′3分别代表某个因素的
不同水平的指标平均值 , R代表极差。
　表 3 　正交实验方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性
乙醇浓度 0.21 2 0.105 28 *
时间 1.46 2 0.73 194.67 **
固液比 0.0867 2 0.04335 11.56
温度 0.0075 2 0.00375
　　注:F0.01 (2, 2) =91. 01, F0.05(2, 2) =19. 00, F0.1 (2, 2) =
9. 00;**P<0. 01,极显著差异
　　通过比较各因素的极差值 (R)可以看出 ,影响
总皂甙的因素顺序为 D>A >C >B ,见表 2。从表 3
可以看出 ,乙醇浓度和时间对总皂苷的提取有显著
性影响 ,考虑毛冬青总皂苷的提取率和实际生产情
况 ,最终确定的最佳提取条件为:A 1B3C1D1 ,即用 5
倍于药材的乙醇(浓度为 50%),在 80℃回流 1 h提
取毛冬青总皂苷 ,在该工艺条件下 ,所得皂苷提取率
为 5.74%。
3.3　毛冬青总皂苷的纯化　称取 600 g的毛冬青
干燥根粉末按正交实验中确定的条件提取 ,减压浓
缩至无醇味 ,加蒸馏水溶解 ,静置过夜 ,过滤 ,将滤液
稀释定容至 1000 m l,定量取 100 m l溶液 ,加到已经
预处理好的 D101大孔树脂柱上 ,先用蒸馏水洗脱 ,
除去糖类 、无机盐等不易被吸附的物质 , 然后用
50%的乙醇水溶液进行洗脱 ,合并洗脱液并浓缩至
干 ,所得浸膏用少量甲醇溶解 ,边搅拌边滴加 1∶1的
丙酮-乙醚 ,当刚析出白色沉淀时 ,立即停止加入 ,静
置 12 m in后离心分离 ,小心取上层清液加入 10倍
体积的丙酮-乙醚 (1∶1)溶液沉淀 ,干燥得到毛冬青
总皂苷。
3.4　毛冬青总皂苷的鉴定
3.4.1 　定性检测:按照毛冬青总皂苷的定性检测
方法进行试验 ,泡沫试验和 TLC检测现象明显 ,结
合 Liebermann反应呈阳性 ,说明纯化后的毛冬青浸
膏中含有三萜皂苷元。
3.4.2 　红外光谱检测:取毛冬青提取纯化后的样
品毛冬青总皂苷与 Ilexsapon in B1对照品用 KB r压
片 ,在红外光谱仪上进行扫描 ,所得谱图见图 1。从
图 1A 的红外光谱中可以看出 , 在 3424.9 cm-1、
2928.1 cm-1、1693.5 cm-1 、1456.4 cm-1 、1384.7 cm-1
左右有典型的吸收;从图 1B中同样可以看出 , 在
3409.3 cm-1、2933.7 cm-1 、1690.0 cm-1、1456.0 cm-1、
1384.5 cm-1左右有较明显的吸收峰 ,毛冬青总皂苷
的红外吸收在毛冬青皂苷单体 Ilexsaponin B1对照
品中都可以找到 ,表明它们之间有相同的三萜皂苷
元骨架。
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图 1　红外光谱图
A. I lexsapon in B1对照品　B.毛冬青总皂苷
4 　讨论
4.1 　本实验以毛冬青干燥根为提取原料 ,从提取
的角度来说 ,干燥根中所含的皂苷比新鲜植物中要
高 ,提取过程中也节约了溶剂。
4.2 　目前 ,国内尚无毛冬青皂苷类成分的法定对
照品 ,本文所用的对照品系笔者从广西毛冬青干燥
根中分离得到的含有二糖基三萜皂苷 Ilexsaponin
B1,其晶体经核磁共振图谱 、红外 、紫外和质谱扫
描 ,结合旋光度和熔点测定 ,确认其纯度达到 98%
以上。
4.3 　另外 ,芳香醛-浓硫酸或高氯酸显色反应是测
定皂苷类成分的常用方法 ,但该测定方法专一性不
强 ,其它非皂苷类成分也可以显色而使本测定结果
偏高。
4.4 　通过正交实验 ,选出最佳工艺:提取时间为 1
h,乙醇体积数为 50%,提取温度为 80℃,固液比为
1∶5。所得毛冬青总皂苷的提取率为 5.74%。正交
实验的方差分析表明 ,提取时间和乙醇的浓度是影
响提取效果的显著因素 ,因此 ,在提取过程中要注意
控制提取时间和乙醇的浓度 。
4.5　按最佳工艺提取所得的总皂苷 ,经纯化检测 ,
结果表明毛冬青总皂苷与 Ilexsaponin B1对照品具
有相同的三萜皂苷元骨架。
参 考 文 献
[ 1] 熊友香 ,李昶 , 罗宪堂 . 毛冬青的化学成分 、药理作用研
究进展 . 中药材 , 2002, 25(5)371-374.
[ 2] Kazuyuki H idaka, M iyoko Ito, Yoko M atsuda, e t a l. New
triterpene sapon ins from I lex pubescens. Chem. Pharm.
Bull, 1987, 35(2):524-529.
(2007 - 01 -17收稿)
《中药材》杂志征稿内容
1.1 　药用植物栽培 ,包括野生药材变家种 ,引种药材和异地药材的引种驯化 ,道地药材的研究 ,培育优良品
种 ,防治病虫害 ,改革耕作制度 ,提高产量 、质量 ,组织培养 ,药用真菌的栽培及 GAP基地的建设等 。
1.2 　动物药研究 ,包括药用动物的饲养和管理 ,资源 、生态 、习性的调查与观察。野生变家养与异地引种品
种的驯化;用新技术 、新方法提高动物药的产量与质量 ,动物药的药理 、药化和临床实验等 。
1.3 　中药材鉴别 ,加工炮制和商品养护。
1.4 　中药资源的合理开发和利用。
1.5 　中药化学 ,药理与临床试验 。
1.6 　国外药材的生产研究成果和动向。
1.7 　新技术 、新方法在中药材上的应用。
1.8 　药材专业户 、药材经营部门谈生产 、经营管理经验 ,药材产销预测及市场动态等。
1.9 　基础理论讲座 ,文献综述 ,专论 ,考证 ,译文 ,中药剂型改革 ,制剂 ,用药 ,药膳 ,经验以及报道中药店
(房)的文章等。
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