全 文 ：265※分析检测 食品科学 2011, Vol. 32, No. 16
高效液相色谱法测定芍药中齐墩果酸和
熊果酸含量
周春华，吕三三，张 莹，胡 玥，陶 俊*
(扬州大学园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225009)
摘 要：目的：建立高效液相色谱法测定芍药不同器官中齐墩果酸和熊果酸含量的检测方法。方法：超声波乙醇
提取样品中的齐墩果酸和熊果酸，色谱柱为Lichrospher C18柱(250mm× 4.6mm，5μm)，流动相为甲醇 -0.1%磷酸
溶液(85:15，V/V)，柱温 30℃，流速 1mL/min，检测波长 210nm。结果：齐墩果酸和熊果酸在 25～100μg/mL范
围内均呈良好的线性关系，相关系数均在 0.998(n＝ 5)以上；日内差异系数和日间差异系数分别为 1.27%～2.96%和
1.33%～3.64%，OA和UA精确性分别为 1.28%～3.52%和 0.96%～2.88%，平均回收率分别为 98.87%和 98.70%。结
论：该方法简单快速、结果准确，可为测定芍药不同组织中齐墩果酸和熊果酸含量提供一种高效快速的测定方法。
关键词：高效液相色谱法；芍药；齐墩果酸；熊果酸
Analysis of Oleanolic and Ursolic Acids in Peony (Paeonia lactiflora Pall. ) by HPLC
ZHOU Chun-hua，LU San-san，ZHANG Ying，HU Yue，TAO Jun*
(College of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract：Objective: To establish a HPLC method to determine the contents of oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) in
different organs of Paeonia lactiflora Pall.. Method: Oleanolic and ursolic acids were extracted from samples with ethanol under
the assistance of ultrasonic. The chromatographic separation was conducted on a Lichrospher C18 column (250 mm × 4.6 mm,
5μm) using a mobile phase made up of methanol and 0.1% phosphoric acid solution (85:15, V/V) at a flow rate of 1 mL/min. The
column temperature and the detection wavelength were set as 30 ℃ and 210 nm, respectively. Results: The linearity of OA and
UA was in the range of 25－ 100μg/mL with a correlation coefficient over 0.998 (n = 5). The overall intra-day and inter-day
variation coefficients were 1.46%－ 2.84% and 1.33%－ 3.32% for OA and 1.27%－ 2.96% and 1.97%－ 3.64% for UA,
respectively. The accuracy of determination of OA and UA was 1.28%－3.52% and 0.96%－2.88%, respectively. Conclusion:
The method is convenient, rapid and accurate, and can thus be used to separate and quantify OA and UA in different organs of
Paeonia lactiflora Pall..
Key words：high performance liquid chromatography (HPLC)；Paeonia lactiflora Pall.；oleanolic acid；ursolic acid
中图分类号：TS255.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)16-0265-04
收稿日期：2010-11-03
基金项目：2009年扬州大学大学生学术科技创新基金项目；“十一五”江苏省科技支撑计划(农业)项目(BE2009318)；
江苏省科技基础设施建设计划(科技公共服务平台)项目(BM2010590)
作者简介：周春华(1974—)，男，副教授，博士，研究方向为园艺植物生物活性物质。E-mail：chzhou@yzu.edu.cn
*通信作者：陶俊(1966—)，男，教授，博士，研究方向为观赏植物栽培与遗传生理。E-mail：tao jun@yzu.edu.cn
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是毛茛科芍药亚科芍药
属多年生宿根草本植物，主要分布在我国山东、浙江、
安徽、河南、四川、云南、陕西和甘肃等地。芍药
根具有较高的药用价值，是一种重要的中药材，其生
物活性物质主要有单萜类化合物、三萜类化合物、挥
发油、单宁、鞣质、黄酮类及酚类等，其中单萜类
化合物中的芍药苷是芍药中最主要的生物活性物质[1-4]。
而在药用芍药栽培中，地上部分常常被作为废弃物丢
弃，造成了资源的巨大浪费。
齐墩果酸(oleanolic acid，OA)和熊果酸(ursol ic
acid，UA)是近年来倍受人们关注的三萜类化合物，两
者互为同分异构体，通常以游离或结合成苷的形式广泛
存在于植物界。研究表明，它们主要存在于女贞子[ 5]、
山茱萸[ 6 ]、白花蛇舌草[ 7 ]、柿 [ 8 ]、枇杷[ 9 ]、枣[ 1 0 ]、山
. .
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楂[11]和木瓜[12]等植物中。医学研究表明，OA和 UA均
具有抗肿瘤[13]、抗病毒[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、护肝[17]、
降血糖[18]等多种生物活性。以往关于芍药的药用研究主
要集中在根上，其化学成分主要以单萜化合物为主，迄
今为止，尚未见有关芍药三萜化合物 OA和 UA的研究
报告。预试验研究显示，芍药叶片、花朵、茎干中
均含有OA和UA等三萜类化合物，其中叶片含量最高。
植物中OA和 UA的含量分析方法主要包括薄层扫
描法(thin layer chromatography scanning，TLCS)、毛
细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)、气相色谱
法(gas chromatography，GC)和高效液相色谱法(high
performance liquid chromatography，HPLC)。其中HPLC
是最常见的分析方法，使用此方法在女贞子 [ 5 ]、山茱
萸 [ 6 ]、白花蛇舌草 [ 7 ]、柿 [ 8 ]、枇杷[9 ]、枣[ 10 ]、山楂[ 11 ]
和木瓜[12]等多种植物中均同时检测到了 OA和 UA。
本实验以OA和 UA的含量作为考察指标，利用超
声提取，建立简便、快速、准确测定芍药不同组织中
OA和 UA 含量的高效液相色谱检测方法，为芍药资源
的综合利用研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)采自扬州大学园艺与植
物保护学院芍药种质资源圃内。选取“杨妃出浴”、
“粉珠盘”和“红峰”3个品种，于 2009年 5月 1日采
集上述 3个品种叶片、花朵和茎干样品。所有采集的样品
带回实验室后立即用液氮冷冻处理，然后存放在－ 20℃冰
箱中，直至分析。
OA、UA标准品 南京替斯艾么(TCM)中药研究
所；甲醇(HPLC级) 美国 Tedia试剂公司；去离子水
由Millipore超纯水系统制备；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
26 95 高效液相色谱仪[配备 24 87 紫外检测器和
Lichrospher C 18柱(250mm× 4.6mm，5μm)] 美国
Waters公司；RE-5299旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器
厂；KQ-500B超声波清洗器 江苏昆山超声仪器有限
公司；TDL-40B 离心机 上海金鹏分析仪器有限公
司；分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；
微孔滤膜(0.22μm)。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
OA和UA的定量在高效液相色谱仪系统中进行。两
种物质均在 210nm波长处检测，流动相为甲醇 -0.1%磷
酸溶液(85:15，V/V)。流速为 1mL/min，柱温为 30℃。
1.3.2 标准品溶液的制备及标准曲线绘制
OA和 UA标准样品分别用甲醇配成 2mg/mL贮备
液。分别量取OA和 UA标准样品溶液 0.025mL置于同
一个离心管中，加入甲醇 1.975mL，摇匀，制成OA和
UA质量浓度分别为 25μg/mL的混合标准溶液，按上述
方法配制 OA 和 UA 质量浓度分别为 50、75、100μg/
mL的混合标准溶液。在进行 HPLC测定时，上述不同
质量浓度的混合标准溶液分别进样 10μL测定峰面积，用
于绘制标准曲线。
1.3.3 分析方法验证
按 1.3.2节方法制备标准溶液，对 4个质量浓度的
OA和UA标样进行HPLC测定，精密吸取每一标样溶液
10μL，按上述色谱条件连续 3次进样，根据标样质量
浓度和峰面积绘制标准曲线，进行峰面积与质量浓度的
线性回归分析。
为了测定每个标样的日内差，每个质量浓度在同
1d内注射 5针。然后连续 3d进行测定以确定日间的精
确度(即日间差)。
为了计算提取回收率，在提取前于研磨好的 3g植
物材料(“杨妃出浴”叶片)中加入 30μg OA 和 300μg
UA。此后的提取和HPLC分析均按照上述方法进行操
作，并计算回收率。
　　
A－B
回收率 /%＝————× 100
　　 C
式中：A是加入标样后检测到的含量；B是没有加
标样时检测到的含量；C 是加入标样的量。
1.3.4 待测液的制备
用天平称取 3.0g鲜样，置于研钵中，加液氮研至
粉末状，放入 10mL离心管中，加入 5mL乙醇，在超
声波清洗器中提取 30min，15℃、8000× g离心 10min。
每样品总共提取 2次，合并两次滤液，35℃旋转蒸发至
干燥。残留物溶于 1.5mL甲醇中，并转移至 2mL离心
管中。在HPLC上样前用 0.22μm微孔滤膜过滤。每个
样品重复 3 次。
1.3.5 样品测定
将处理后的样品溶液进行液相色谱分析，进样量
10μL，采用外标法定量，测定 3个品种芍药叶片、花
朵和茎干中 OA 和 UA 的含量。
2 结果与分析
2.1 HPLC鉴定OA和UA
OA和UA标样在 210nm波长处均能检测到，且在
210nm左右有最大吸收峰。在甲醇(A)和 0.1%磷酸溶液
(B)配比为 85:15(V/V)时，OA和UA能有效地洗脱，而
且能被同时检测。在流速为 1mL/min时，OA和 UA的
保留时间分别为 26.086、27.229min(图 1a)。这种HPLC
体系能成功分离芍药叶片中的 OA和 UA(图 1b)。
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图 1 OA、UA标准品(a)和芍药叶片提取液(b)的 HPLC图谱
Fig.1 HPLC chromatograms of mixed oleanolic acid and ursolic acid
standards (a) and peony leaf extract (b)
0.008
0.006
0.004
0.002
0.000
OA
A
U
时间 /min
2 6 10 14 18 22 26 30 34
UA
a
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
OA
A
U
时间 /min
2 6 10 14 18 22 26 30 34
UA
b
2.2 检测方法确认
2.2.1 线性关系
两种标准品配制 4 种不同质量浓度(25、50、75、
100μg/mL)的溶液，分别重复 5次测试。校准曲线均呈
线性关系，峰面积(Y)与标准品质量浓度(X)的回归方程
为：YOA＝1217.2X(r＝ 0.998)，YUA＝1499.6X(r＝0.998)，
表明OA和UA在 25～100μg/mL范围内均呈良好线性关
系，可用于定量分析。
2.2.2 重复性和精确度
3种标样的重复性和精确度采用上述方法，通过 4
种不同的质量浓度来分析测定(表 1)。OA和UA的日内
差异系数分别为 1.46%～2.84%和 1.27%～2.96%，日间
差异系数分别为 1.33%～3.32%和 1.97%～3.64%。方法
的精确性用测定值与所有质量浓度理论值的偏差来
表示，OA 和 UA的精确性分别为 1.28%～3.52%和
0.96%～2.88%。
2.2.3 回收率实验分析
为了计算提取回收率，在提取前于研磨好的 3g植
物材料中加入 30μg OA和 300μg UA。然后按上述方
法进行提取、检测和分析。通过计算分析值和加入量
的比例分别来计算 3 种成分的回收率。结果表明，O A
和UA的回收率分别为 98.87%和 98.70%(表 2)。
注：A.样品在同 1d 内连续分析 5 次；B.样品连续分析超过 3d 以上。
标样
标准质量浓度 / 分析值 / 差异系 精确
(μg/mL) (μg/mL) 数/% 度/%
25 24.12± 1.05 1.46 －3.52
OA
50 48.33± 1.54 2.13 －3.34
75 76.69± 1.99 1.98 2.25
日内差 A
100 98.72± 2.16 2.84 －1.28
25 25.33± 1.13 1.27 1.32
UA
50 48.56± 1.47 1.95 －2.88
75 74.28± 1.96 2.96 －0.96
100 101.29± 2.35 2.14 1.29
25 24.62± 1.23 1.33 －1.52
OA
50 46.08± 1.72 2.57 2.16
75 76.33± 2.05 1.48 2.31
日间差 B
100 96.95± 2.74 3.32 －3.05
25 24.47± 1.14 2.06 －2.12
UA
50 50.48± 1.58 2.38 0.96
75 73.75± 2.14 1.97 －1.67
100 98.11± 2.81 3.64 －1.89
表 1 OA和 UA重复性和精确性分析(n=5)
Table 1 Repeatability and accuracy of OA and UA analysis (n=5)
标样 加入量 /μg 分析值 /μg 回收率 /%
OA 30 29.66± 0.77 98.87± 2.59
UA 300 296.12± 6.23 98.70± 2.08
表 2 OA和 UA回收率分析(n=3)
Table 2 Mean spike recoveries for OA and UA in a blank sample (n=3)
2.3 芍药不同器官OA和 UA含量分析
由表 3可知，芍药不同器官中 OA和 UA含量差别
很大，以 杨妃出浴 、 粉珠盘 和 红峰 3个品种为
例，3 个品种不同组织中均检测到 O A 和 U A，且 U A
含量均高于OA。对于叶片和花朵来说，3个品种中OA
和 U A 的含量均以“杨妃出浴”最高，“粉珠盘”最
低，“红峰”介于其中。而对于茎干来说，3 个品种
中 O A 和 U A 的含量则以“粉珠盘”最高，“红峰”最
低，“杨妃出浴”介于其中。从 3种不同器官OA和UA
的总量来看，叶片明显高于花和茎干，其中“杨妃出
浴”叶片中OA和UA总量最高，为 119.56μg/g，“粉
珠盘”最低，为 5 4 . 5 4μg / g。
μg/g
成分 部位 杨妃出浴 红峰 粉珠盘
叶片 9.66 2.76 2.58
OA 花朵 3.57 0.13 0.11
茎干 1.37 0.25 1.89
叶片 109.90 93.30 51.96
UA 花朵 3.63 2.62 1.31
茎干 1.69 0.49 8.88
表 3 芍药不同器官 OA和 UA的含量
Table 3 OA and UA contents in different organs of peony
3 讨论与结论
3.1 芍药中OA和 UA分析体系的建立
常用的流动相系统有甲醇 -水和乙腈 -水两种。甲
“
“
“
“
“
“
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醇和乙腈的体积分数一般在 85%～90%[19]。在流动相加
入少量冰醋酸(0 .08%～0.1%)、磷酸(0 .1%)、三乙胺
(0.06%～0.1%)有利于改善峰形，提高分离度[20]。本实
验曾对甲醇 -磷酸缓冲液(88:12，V/V)、甲醇 -水(85:15，
V/V)和甲醇 -0.1%磷酸溶液(85:15，V/V)这 3种不同流动
相做过对比筛选，结果发现采用甲醇 -磷酸缓冲液做流
动相时，由于盐的存在，色谱柱容易堵塞。采用甲醇 -
水做流动相，OA和 UA的分离度小于 1，且峰形不好，
在水中加入 0.1%磷酸，其分离度较高，峰形也得到较
好的改善。对流动相的流速进行选择发现，流速对出
峰时间影响较大，在流速 0.6mL/min时，出峰时间大约
在 50min左右，而当流速升到 1mL/min时，出峰时间缩
短到 30min左右。许多文献[7-9,11-12]中OA和UA的保留时
间在 18～29min之间，本实验OA和 UA的保留时间分
别为 26.086、27.229min，和文献结果基本一致。在本
实验建立的色谱条件下，芍药不同器官中 OA和 UA的
分离良好，方法简便快速，结果准确可靠。同时用该
方法对柿子果肉和果皮中OA和UA含量进行了测定，发
现其峰形和分离度也较好，说明该方法有一定的普适性。
3.2 芍药不同组织器官中OA和UA的含量
研究表明，OA和 UA在同种植物的不同组织器官
中的含量存在着很大差异。王丽萍等[21]研究发现，川鄂
山茱萸总苞片的UA含量(1.1044%)最高、果实(0.0899%)
最低，茎干、叶片和花介于中间，同一器官的不同组织
部位中的OA和UA的含量也有差别。刘名权等[22]研究显
示，毛泡桐叶片中的OA含量(0.222%)约为叶柄(0.025%)的
9倍，叶片中UA的含量(0.61%)约为叶柄(0.21%)的 3倍。
周春华[23]研究表明枇杷花萼片的OA和UA含量最高，分
别为 0.68、3.65mg/g，花瓣中 OA和 UA的含量最低，
分别为 0.12mg/g和 0.60mg/g，雌雄蕊和穗梗中OA和UA
的含量介于萼片和花瓣之间。
本研究显示，芍药不同器官OA和 UA含量差别很
大，3 个芍药品种“杨妃出浴”、“粉珠盘”和“红
峰”的 OA 和 UA 含量均以叶片最高。OA 在叶片中的
含量分别是茎干的 72.7、1.3、11.4倍，花的 2.7、23.5、
21.2倍；UA在叶片中的含量分别是茎干的 30.2、39.7、
35.6倍，花的 65.0、5.8、190 .4倍。
3.3 本研究建立了高效液相色谱测定芍药不同器官中
OA和 UA 含量的方法，该测定方法操作简便易行，结
果稳定可靠，可以快速准确地对芍药不同器官中 OA和
UA进行定量分析，可为芍药资源的综合开发利用研究
提供参考。
参 考 文 献 ：
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