全 文 ：安徽大学学报 ( 自然科学版) J o u n a rl o A fn h u i U n iv e r si ry N a tu a rl sei n e e eE i dtio n N o . 3 9 9 15
南欧紫荆 ( C e r ei sS il i qu a st u rm L)种子中
甘露聚糖酶的分离 、 纯化及其动力学性质 `
陶 乐 平
(安徽大学生物系 合肥 3 20 039)
摘 要 南欧紫荆萌发种子的提取液 , 经硫酸钱分级沉淀 , D E A E 一纤维素柱层析 , iB 。
一 G e l P一 6 0 和 S e p h a d e x G 一 1 0 0 柱层析 , 得到了酶活为 9 8 . 6拌 /m g 的甘露聚糖酶 。 柱层析和
聚丙烯酞胺凝胶电泳均表明其为均一性物质 。 南欧紫荆甘露聚糖酶由两个分子量为 2 万的相
同亚基组成 , 可将以甘露聚搪为主链的多种半纤维素水解为含 4~ 6 个单糖残基的寡糖片断 。
它的最适 p H 为 5 , 最适温度为 37 ℃ 。 Z n Z 十对该酶活性有强烈的激活作用 , C u , + 和 M n Z+ 则为
这种甘露聚糖酶的竞争性抑制剂 。 动力学性质研究表明酶的活性明显地依赖于底物浓度 , 且
只有一个活性中心 。 南欧紫荆甘露聚糖酶的作用方式为专一性地内切水解以 俘一 (l ~ 4) 键
连接的甘露聚糖 。
关键词 南欧紫荆 , 甘露聚糖酶 , 甘露聚糖 , 半乳葡萄甘露聚糖 , 动力学性质
中图分类号 Q 5 .6 2
0 引 言
甘露聚糖酶可催化包括甘露聚糖 、 半乳甘露聚糖 、 葡萄甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚
糖等多种底物的甘露糖昔键的水解 , 其底物专一性随酶的来源不同差异很大 .1[ 幻 。
最近 , 我们发现在南欧紫荆的种子的胚乳 中含有大量具特殊杆状构象的半乳葡萄甘
露聚糖 ) 4 〕。 这种多糖的主链由甘露糖和葡萄糖通过 日 (l 一4) 糖昔键连接而成 , 侧链 由
半乳糖以 l( 一 6) 方式与主链上 已糖残基相接 。 它在种子萌发过程中作为储存多糖参与
代谢 。 为了弄清这种多糖分解为寡糖和单糖的代谢机制 , 我们从萌发的南欧紫荆种子中
分离纯化了一种新的甘露聚糖酶 。 本文报道的是这种甘露聚酶的分离 、 纯化 、 作用方式
及其动力学性质 。
1 材料和方法
L l 材 料
南欧紫荆 (C er 南 isl 咭。 “ str u m L . )种子由澳大利亚新南威尔士州林业部提供 。 洋槐属
豆 ( L o c u s` b e a n )和胡罗巴 ( F e n g r e e k )种子半乳甘露聚糖分别按以前的方法制备 〔3〕。 K o n ja e
葡萄甘露聚糖样品由澳大利亚悉尼大学 N . K . M a t h es o n 教授提供 。 s叩h a d e x G 一 1 0 为
收稿 日期 : 1 9 9 4 一 0 1 一 1 6
* 本文大部分在澳大利亚 悉尼大学完成 。 并得到了 N . M at h e s on 教授的支持 , 特此致谢 。
安徽大学学报 1 9 9 5 年
瑞典 p ha rm a eia 公 司产品 。 B io 一 G el p 一 6 0 为美国 B io 一 R a d 公司产品 , D E A E 一纤维素为
M e r e k 公司产品 。 标准蛋白质 (牛血清白蛋白 M W = 6 6 , 0 0 0 , 即白蛋白 M w = 4 5 , 0 0 0 ,
肌球蛋白 M W = 1 6 , 9 5 0 ) 均为 S ig m a 公 司产品 。
.1 2 甘露聚糖酶的分离及其纯化
南欧紫荆种子浸泡于 .0 5% N a O口溶液中 ( 1 , 10 V /V ) 半小时 , 用流水反复冲洗后 ,
置蒸馏水内浸泡 24 小时 , 种子置湿润的珠光岩上萌发 。 萌发后的种子 , 置组织捣碎机 中 ,
加人 .0 ZM 醋酸钠缓冲液 ( p H .S 0) 后破碎 , 悬浮混合液在室温下继续搅拌 2 小时 , 此时
粘度很大 , 主要是该溶液中含有大量的半乳甘露聚糖之故 。 离心 ( 1 0 0 0印m ) , 沉淀物按
上法再提取两次后 , 合并上 清液 , 加 ( N H ; ) 多O ; 使溶液 的盐饱和 度为 30 % , 离 心
( 1 5 0 0 Orp m
,
30 分钟 2℃ ) 除去无酶活性的沉淀蛋白 。 上清液中继续加固体硫酸钱使盐的
饱和度达到 80 % , 离心 , 收集沉淀 。 沉淀物重新溶于醋酸钠缓冲液 ( p H S . 0 ) , 然后对同
一缓冲液透析 24 小时 。 透析后出现的少量不溶性物质通过离心除去 。 上清液经超滤法浓
缩后冷冻干燥 。
经冷冻干燥所获的粗酶制品溶于 p H .6 5 的磷酸缓冲液 ( 35 m g /m L ) ,然后加到预先用
此缓冲液平衡的 D E A E 一纤维素柱上 ,用同一缓冲液洗脱 , 吸附部分用含 O 一 ZM N aC I的
p H 6
.
5 的磷酸缓冲液进行梯度洗脱 5[] , 合并含酶 活管液 , 超滤浓缩 , 浓缩液加人 到用
。 . IM 的磷酸缓冲液 ( p H 6 . 5) 平衡的 iB o 一 G el p一 60 柱上 , 继续用该缓冲液洗脱 ,流速每
小时 20 m L ,每管 s m L 分步收集 。 合并含甘露聚糖酶活性管液 ,加硫酸钱使溶液饱和度为
80 %
,离心 ( 1 5。。。 rP m , 30 分钟 ) 收集沉淀蛋白 。 沉淀物溶于 p H 6 . 5 的磷酸缓冲液 ,然后对
该缓冲液透析 24 小时 。 再对 0 . IM 醋酸盐缓冲液 ( p H S . 0) 透析 20 小时 。
浓缩后的透析液加到用 .0 IM 醋酸一醋酸钠缓冲液 ( p H 一 5) 预平衡的 S叩 h a d e x G 一
1 0 柱上 ,用同一缓冲液洗脱 ,然后分别测定各收集管中的蛋白质含量及酶活力 4[, ` 〕 ,合并
相同组分 , 经超滤浓缩后冷冻干燥 。
L 3 酶活力的测定
粘度测定 将底物 (刺槐半乳甘露聚糖 ,胡罗巴种子半乳甘露聚糖 , 薯菠甘露聚糖等
制成 1%溶液 。 取该液 Zm L , 加 Zm L o . I M 醋酸缓冲液 , 37 ℃预保温 10 分钟后 ,加人 Zm L
酶液 , 迅速混合后 ,继续保温 30 分钟 ,然后在沸水浴上加热 15 分钟终止酶反应 。 取 s m L
反应液转移置于 37 ℃水浴中的乌氏粘度计中测定增 沙浓度 .7[ 3〕 , 酶的活性用增 比浓度的
倒数 翁 ’表示 ,蒸馏水的流出时间 37 ℃ 1 1 se c ,空白试验用煮沸使其失活酶液加人底物溶液
中作粘度测定对照 。
还原力测定 浓度为 .0 5 % 的底物 3m L ,加人 l m L O . I M 醋酸缓冲液 ( p H S . 。 ) , 反应
混合物预保温 ( 37 ℃ )后 , 加人 l m L 酶液 , 反应混合物 37 ℃继续保温 30 分钟 。 沸水浴上加
热终止酶反应 。 反应液中释放的还原糖量用 N e ! so n 一oS m go y i 比色法测定 .8[ ’ 〕。 1 个甘露糖
昔酶活力单位定义为在上述条件下每小时释放 1拌m ol e 的还原糖的量 。
L 4 分子量测定
凝胶过滤 0 . 5 克酶或标准蛋白质溶于 Zm L p H S 的醋酸缓冲液 ,然后加到用该缓冲
液预平衡的 S eP h a d e x G 一 1 0 柱上 ( 7 2 O X 16 m m ) , 用相同缓 冲液进行洗脱 , 测得各物质的
洗脱体积后 ,以分子量的对数和 k wA v 一 ( V 。 , 一 V 。 ) / ( V : 一 V 。 )作图 ,求出酶的分子量 。
第 3 期 南欧紫荆 ( eC cr is isl iq o a st r o m )L 种子中甘露聚糖酶的分离 、纯化及其动力学性质 8 3 .
聚丙烯酞胺凝胶 电泳 用 7 . 5 %丙烯酞胺和 。 . 1% S D S 的聚丙烯酞胺凝胶制备成
.0 s x 1 0c m 玻璃管凝胶柱 :l0 〕。 电泳缓冲液为 .0 IM 醋酸缓冲液 。 每管凝胶恒定 电流为
I O m A
,
2 5 C 电泳 3 小时 。 标准分子量的蛋白质是牛血清白蛋白 , 即白蛋白和肌球蛋白 。
等电聚焦电泳 按 V . D e s h p a n d e 等人方法进行 巨`。〕。
最适 p H 测定 将 l m L 酶度 (1 m g八 m L )加人 p H 值不同的且含有 0 . 5%底物 g m L
的缓冲液中 , 37 ℃ 保温 30 分钟 。 还原糖的释放量用 N e ls on 一 oS m go y i 法测定 。 根据释放的
还原糖的量 ,确定最适 p H 值 。
最适温度的选择 方法同上 。 p H 为 5 . 0 的醋酸缓冲液 。在不同时间里取样 ,根据 N el -
so
n 一 S O m o g y i 法测定不同温度下其还原糖的释放量 ,从而确定酶在各种温度下的稳定性
及最适温度 。
金属离子对酶活性的影响 l m L o . IM 醋酸缓冲液 ( p H S . 0) 和 l m L ’酶液 , 0 . 5%底物
3 m L 混合 , 37 ℃保温 ,在反应的不同时间分别加人不同的金属盐或非金属盐 。 空白试验用
煮沸后失活的酶作对照 。 根据相对活性的大小 , 确定金属离子对酶活性的影响 。
一般方法 蛋白质含量根据 L o w r y , `〕等人的方法测定 。 标准蛋 白为牛血清白蛋白 。
总糖含量测定采用酚一硫酸法 〔, 2〕。 标准糖为甘露糖 。
2 结果和讨论
2
.
1 甘露聚糖酶的纯化
萌发的南欧紫荆种子经 p H一 5 的醋酸缓冲液浸提 , 硫酸钱分级沉淀 , D E A E 一 纤维
素 , B io 一 G e l P一 6 0 和 S e p h a d e x G 一 1 0 0 柱层析 , 获得了比活达 9 8 . 6拌 /m g 的甘露聚糖酶 。
其各级分的比活和产率见表 1 。 在 D E A E一 纤维素柱层析中 ( 图 1 ) , 含甘露聚糖酶活性部
分为非吸咐级分 , N aC I离子强度为 。 . 5 ~ 。 . SM 的梯度洗脱级分主要为杂蛋白 ,但有一定
程度的半乳糖昔酶活性 。 合并含甘露聚糖酶活性的各管液 , 经超滤浓缩后使其浓度达到
1 5 m g / m L
,其在 iB 。 一 G e l p 一 60 上的层析行为 (图 2) 表现为酶活性很强的主峰和两个分
子量差异很大的杂蛋 白峰 。 主峰部位的浓缩物经 S e p h a d e x G 一 1 0 进一步凝胶过滤层析 ,
证明所得的甘露聚糖酶为均一性物质 。凝胶过滤色谱为一对称的洗脱峰 ,蛋白质和酶活性
的洗脱曲线相似 , 聚丙烯 酞胺凝胶电泳经高碘酸 一 s hi f 试剂显色呈 阳性 , 表明这种酶是
一种糖蛋白 。
表 1 南欧紫荆甘露聚糖酶的纯化过程
提取步骤 蛋白质总含量 总活力 比活 回收率 提纯
( m g ) (
u
) (拜 /m g ) 蛋白质 酶活 倍数
粗酶提取液 2 8 0 0 9 5 8 8 2 0 2 . 1 1 0 0 1 0 0 1
3 0%硫酸钱沉淀后上清液 1 3 6 5 5 5 6 0 0 0 魂. 1 4 5 . 7 9 5 . 2 1 . 9 5
8 0 %硫酸钱沉淀后上清液 8 7 6 0 5 4 3 0 0 6 . 2 3 1 . 2 9 2 . 2 2 . 9 5
D E A E 一纤维素柱层析 1 8 0 7 4 8 2 5 6 2 6 . 7 6 . 5 8 2 . 4 1 2 . 7
B 10 一 G e 1 P 一 6 0 7 8 5 3 7 8 6 2 4 8 . 2 2 . 8 6 4 . 4 2 3
S
e p h
a d e x G 一 1 0 0 2 5 7 . 8 2 5 4 2 2 9 8 . 6 0 . 9 4 3 . 2 4 7
安徽大学学报 1 9 9 5年
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图 1 南欧紫荆甘露聚糖酶在 DE AE 一纤维素柱上的洗脱曲线
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e n Z y lr 比
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图 2 南欧紫荆甘露聚搪酶在 iB 。 一 G el P 一 60 上的洗脱曲线
.2 2 甘露聚糖酶的最适温度和热稳定性
图 3 和图 4 分别为甘露聚糖酶在不 同温度下的酶的相对活性和不同时间下的热稳定
性 。 当保温时间为 30 分钟 ,甘露 聚糖酶的最适温度为 37 ℃ ,峰形宽意味着甘露聚糖酶在
3 7℃左右范围有着近乎相似的酶活 。 当保温时间为 5分钟时 , 反应的最适温度为 40 ~
4 5℃ 。 热稳定性试验结果表明 ,南欧紫荆甘露聚糖酶在 50 ℃之下是比较稳定的 ,但其酶活
力随时间延长而逐步下降 。 超过 50 ℃ , 酶活力迅速下降 。 60 ℃ 以上 ,酶则很快热失活 。 这
说明温度的变化对南欧紫荆甘露聚糖酶的影响是十分显著的 。
.2 3 p H 对甘露聚糖酶活性的影响
由图 5 可见 ,南欧紫荆甘露聚糖酶的最适 p H 为 5 , p H 4 ~ 5 . 5 范围内 , 甘露聚糖酶的
活性变化不大 ,但 p H 超过 8 . 5 ,其活性将迅速下降 ,说明南欧紫荆甘露聚糖酶对碱不稳
定 。
第 3期 南欧紫荆 ( C e re i s si liq ua s tu rm L)种子中甘露聚糖酶的分离 、 纯化及其动力学性赓 8 5 .
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图 3 南欧紫荆甘露聚糖酶在
不同温度下的相对活性
O一 , ` -` 一 ` 曰一一一 ~ 曰0 1 0 2 0 J n 4 0 5 〕 6 0t im e 〔m in )
图 4 南欧紫荆甘露聚塘酶在
不同时间下的相对活性
、
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3 4 5 6 7 8 9
图 5 p H 对南欧紫荆甘露聚糖酶相对活性的影响
.2 4 底物专一性
为了研究甘露聚糖酶的底物专一性 ,我们选用具有不同结构或不 同键型的甘露聚糖
或含甘露糖的杂聚糖作为底物 ,根据酶作用底物后还原糖的释放量来确定酶的底物专一
性 。结果表明 , 含脚 1一 4) 键的甘露聚糖 (如 日一甘露聚糖 , 洋槐属豆半乳甘露聚糖 ,胡罗 巴
豆半乳甘露聚糖 ,南欧紫荆半乳葡萄甘露聚糖 )都有程度不同的水解 ,但 K on iac 葡萄甘露
聚糖和 a( 1一 4) 连接的甘露聚糖 ( 如薯拔甘露聚糖 ) 则对这种酶的敏感性很小 。 而葡萄聚
糖和半乳聚糖不被这种酶水解 。 含 俘(1 一 4) 键的甘露聚糖类的水解速度随支链增多而下
降 ,这种现象可能是 由于底物分子侧链的存在而形成的空间位阻影响底物分子与酶活性
中心的结合 。
2
.
5 离子对甘露聚糖酶活性的影响
由表 2 可知 , K ` 和 N a + 对甘露聚糖酶活性的影响不大 。 但其对某些金属离子高度敏
感 。 如 1A 3十 , A g 一和 H g Z+ 可导致该酶完全失活 。 而在 nZ Z一存在下 . 酶的活性则显著增强 ,
安徽大学学报 1 9 9 5 年
即使在温度为 50 ℃时 ( p H S . 0) 酶仍具有很强的活性 。 另外 , C u 3 +和 M n “ + 对酶的活性具有
显著的抑制作用 。 受到抑制的甘露聚糖酶若对含 Z n CI : 的溶液透析 , 其活性可恢复到最初
活性的 40 % , 这进一步表明 Z n ’ + 在维持甘露聚糖酶活性中的极端重要性 。
表 2 各种化合物对甘露聚搪酶的影响
化合物
N o n g
相对活性 ( % ) 相对活性 ( % )
1 0 0
.
0
K C I
N a C I
9 8
9 9
0
3 0
2 0
09287C
u
S O ;
.
SH
Z
O
Z n SO
-
H g C 1
2
化合物
A IC I:
E D T A
M n C IZ
A g N O
3
N H
4 C I
B a C I
,
2
.
6 分子量
由 s e p h a d e x G 一 1 0 0 凝胶过滤法可得出南欧紫荆甘露聚糖酶和各种标准蛋白质的洗
脱体积 , 根据 K , a , 一 ( V 。 w一 V 。 ) / ( V t一 V 。 )求出相应的 K , v值 , 以 log M W 对 K , . ,作图测得
南欧紫甘露聚糖酶的分子量约为 4 万 。 S D S 一聚丙烯酞胺凝胶电泳显示单一的蛋白质带 ,
其分子量约为 2万 ,这表明南欧紫荆甘露聚糖酶可能由分子量均为 2 万的两个亚基组成 。
2
.
7 甘露聚糖的动力学性质
以不同的甘露聚糖为底物 ,根据 iL en w ea ve r 一 B ur k 做图法所得的米氏常数 K m 和最
大反应速度 V ~ 值见表 3 。 当底物为具分支结构的甘露聚糖类 (如洋槐属豆半乳甘露聚
糖 、 胡罗 巴豆半乳甘露聚糖等 ) ,这种甘露聚糖酶的活性较低 ,而 K m很大 。 由图 6 可知 ,南
欧紫荆甘露聚糖酶对底物浓度的依赖性较大 。 当加入 C u ’ + 和 H g Z十时 ,其 V ma x值不变 ,而
K
m值却有显著变化 。 这表明 ,这两种离子对南欧紫荆甘露聚糖酶的抑制作用是竞争性的 。
另一方面 , 南欧紫荆甘露聚糖酶同时作用于两种底物 (如甘露聚糖 , 半乳甘露聚糖 )时水解
速度小于分别作用于两种底物时的 V l + V Z ( 图 7 ) 。 这表明 ,两种底物与酶作用的方式也
是竞争性的 。 这些动力学行为表明南欧紫荆甘露聚糖酶仅有一个活性中心 。
表 3 南欧紫荆甘露糖酶的动力学参数
底物 k m ( m M ) V m a : ( m o l / m o l酶 /m i n )
酵母甘露聚搪
胡芦巴豆半乳甘露聚糖
洋槐属豆半乳甘露聚糖
南欧紫荆半乳葡萄甘露聚糖
K
o
nj
a 。 葡萄甘露聚糖
1
.
4 5
5
.
2 2
4
.
3 2
3
.
9 5
6
.
2 2
9 2 3
.
8
4 3 8
2 7 8
2 5 0
2 2 5
第 3 期 南欧紫荆 ( C e r e i s s i liq u a s t r u m L )种子中甘露聚糖酶的分离 、 纯化及其动 j 7学性赓 87.
(
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1 / S 1 / S ( 1 / m g / m . )
图 6 几种离子对南欧紫荆甘露
聚糖酶动力学参数的影响
图 7 混合底物的比例对南欧紫荆甘露
聚糖酶活性的影响 f( ~ 半乳甘露
聚糖 /半乳甘露聚糖十甘露聚糖 )
.2 8 南欧紫荆甘露聚糖酶的作用方式
为了研究南欧紫荆甘露聚糖酶对 日l( 一 4) 甘露聚糖的作用方式 ,我们将经过该酶水
解的 p l( , 4) 甘露聚糖底物混合物在不同时间取样 , 进行薄层层析 , 结果表明 ,水解结束
时水解物主要含 4 ~ 6 个残基的寡糖 。 另一方面 ,该酶也可将南欧紫荆半乳葡萄甘露聚糖
水解小分子寡糖 ,这暗示南欧紫荆甘露聚糖酶为内切水解酶 , 因为南欧紫荆半乳葡萄甘露
聚糖是以 尽l( 一4) 连接的甘露聚糖主链 , 且含有 8%的葡萄糖残基 。 对外切水解酶而言 , 专
一性很强的甘露聚糖酶水解遇到葡萄糖时 ,水解则停止 ,结果产生的寡糖片段的聚合度远
大于 4 ~ 6 。 与作用方式和动力学性质相类似的从其它来源分离得到的甘露聚糖酶相 比 ,
南欧紫荆甘露聚糖酶水解方式颇为独特 , 表明这可能是一种新的甘露聚糖酶 。其水解产生
的各种寡糖片段可能经过进一步酶解后参与代谢 , 提供种子生长发育所需能量 。
综上所述 , 南欧紫荆甘露聚糖酶是一种可专一性水解 尽卜 4) 甘露糖昔键 , 热稳定和Z n Z十 , C u Z+ , H g Z+等离子敏感 ,对大分子甘露聚糖类起作用的内切酶 。
参 考 文 献
仁l 三
〔2 ]
5
.
C le r rn
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P e r e h e r o n B u l l
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.
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C a r b o h y d r
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1 9 9 3
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2 0
:
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一
2 7 7
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T a o
,
L e p i n g a n d M
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K
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C a r b o h y d r
.
R e ,
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I n P r e s s
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陶乐平 ,吴东儒 . 安徽大学学报 (自然科学版 ) . 1 9 8 7 . 4 : 81 一 8 7 .
陶乐平 , 昊东儒 . 安徽大学学报 (自然科学版 ) . 1 9 8 9 . 3 : 76 一 8 1 .
陶乐平 , 吴东儒 . 安徽大学学报 (自然科学版 ) . 1 9 8 8 . 3 : 102 一 1 08 .
S o m
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N
.
J
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B i o l
.
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1 9 5 2
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1 9 5
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1 9
.
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一
8 8
- 安徽大学学报 1 9 9 5年
〔 9〕 N e ls o n , N . J . B io l . C h e m . , 1 9吐4 , 1 5 3 : 3 7 5 .
「1 0 ] V a s a n t i D e s h p a u d e , K a r l一 E r i k E r ik s s o n a n d B e r t P a r t e r s s o n e t a l . , E u r . J . B io e h e m . 1 9 7 8 , 9 0
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1 9 8
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〔1 1〕 L o w r y , 0 . H . a n d R o s e b r o u g h , N . J . e t a l . , J . B io l . C h e m . 2 9 5 2 , 1 9 3 : 2 6 5 .
[ 1 2 ] D
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M
.
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K
.
A
.
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. ,
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1 9 5 6
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2 8
:
3 5 0
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P u r if ie a t i o n a n d K in e t ie C h a r a e t e r i z a t io n o f a
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A b s t r a C t
A m a n n a n a
s e w a s s e p a r a t e d a n d p u r i f i e d b y a m m o n i u m
s u lf a t e f r a e t i o n a n d e h r o
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m a t o g r a p h ie s o n D E A E
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u a s t r u m L
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T h e p u r if ie d M a n n a n a s e w a s f o u n d t o b e
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T h e k i n e t i e s t u d y o f t h e m a n n a n a s e i n d ie a t e d t h a t it o n ly h a s a a e t i v e s i t e
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i t s a e t iv it y o b v io u
s l y d e p e n d e d o n t h e e o n e e n t r a t io n o f s u b s t r a t e
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K e y w o r d s C e
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