全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１５，２９（１）：００８７ ～ ００９４
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１４⁃０４⁃０３　 接受日期：２０１４⁃０６⁃０４
基金项目：国家“８６３”项目（２０１２ＡＡ０２２２０８）
作者简介：李文革，男，研究员，主要从事应用微生物研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｈｎｎｋｌｗｇ＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：戴良英，男，教授，主要从事植物与微生物分子互作。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｄａｉｌｙ＠ ｈｕｎａｕ． ｎｅｔ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１５）０１⁃００８７⁃０８
Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 甘露聚糖酶在毕赤酵母中的
表达及其酶学性质分析
李文革１，２ 　 石鹏君３ 　 卢海强３ 　 姚　 斌３ 　 张祺玲２ 　 戴良英１
（ １ 湖南农业大学，湖南 长沙　 ４１０１２８；２ 湖南省农业科学院，湖南 长沙　 ４１０１２５；
３中国农业科学院饲料研究所，北京　 １００８１）
摘　 要：甘露聚糖酶作为最主要的半纤维素酶类现已被广泛地应用在饲料、造纸、洗涤剂、食品及石油开
采等领域。 本研究从高温真菌 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 菌株中利用兼并引物和 Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ
ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ（Ｔａｉｌ⁃ＰＣＲ）的方法克隆获得一个新的糖苷水解酶 ５ 家族的甘露聚糖酶基因（ｍａｎ５Ｘｚ８）。
基因全长 １ ２３９ｂｐ，序列分析发现其编码 ４１２ 个氨基酸和 １ 个终止密码子，预测的信号肽序列为 Ｎ 端的
２０ 个氨基酸。 将成熟蛋白序列克隆到毕赤酵母分泌型表达载体 ｐＰＩＣ９ 中，利用甲醇诱导重组酵母菌表
达目的蛋白，经 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳分析，表达蛋白分子量约 ５５􀆰 ０ ｋＤａ。 对其酶学性质进行测定，Ｍａｎ５Ｘｚ８
的最适 ｐＨ值为 ５􀆰 ０，在 ｐＨ值 ９􀆰 ０ 可以保持 ４０％以上的酶活性，在 ｐＨ 值 ５􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 具有良好的 ｐＨ稳定
性。 最适作用温度为 ５０℃，并对 ＳＤＳ具有较高的耐受性。 以角豆胶为底物，Ｍａｎ５Ｘｚ８ 的比活、Ｋｍ及 Ｖｍａｘ
值分别为 １０１􀆰 ６ Ｕ·ｍｇ － １、４􀆰 ４ ｍｇ·ｍＬ － １、１２８􀆰 ２ μｍｏｌ·ｍｉｎ － １·ｍｇ － １。 因此，Ｍａｎ５Ｘｚ８ 为后期研究甘露聚糖
酶的工业应用和酸碱催化机制提供了良好的材料。
关键词：Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８；甘露聚糖酶；克隆；毕赤酵母；酶学性质
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１５􀆰 ０１． ００８７
　 　 植物细胞壁主要组成成分为纤维素，半纤维素以
及木质素，它们在其中的比例大约是 ２∶ １∶ １［１］。 因此，
纤维素是植物细胞壁中最主要的组成成分，而半纤维
素的丰富程度仅次于纤维素，这 ２ 者是自然界中最主
要的能源物质。 半纤维素主要是由多种通过 β⁃１，４⁃糖
苷键聚合而成的多糖，主要为木聚糖、甘露聚糖、葡聚
糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等［２］。 其中甘露聚
糖（ｍａｎｎａｎ）是仅次于木聚糖的第二大类半纤维素，由
β⁃１，４⁃甘露糖苷键或葡甘露糖苷键聚合而成的线状多
糖［３］。 根据不同甘露聚糖主链结构的差异主要分为 ２
大类，分别为线状甘露聚糖（ ｌｉｎｅ ｍａｎｎａｎ）和葡甘露聚
糖（ｇｌｕｃｏｍｎａｎａｎ） ［４］。 另外，由于天然的甘露聚糖分子
含有半乳糖侧链，又可分为半乳甘露聚糖 （ ｇａｌａｃ⁃
ｔｏｍａｎｎａｎ）和半乳葡甘露聚糖（ｇａｌａｃｔｏｇｌｕｃｏｍａｎａｎ） ［５］。
甘露聚糖的降解需要多种糖苷水解酶的协同作
用，例如甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，半乳糖苷酶和脱乙
酰酶等［６］。 其中 β⁃１，４⁃甘露聚糖酶（ｍａｎｎａｎａｓｅ， ＥＣ
３􀆰 ２􀆰 １􀆰 ７８）是最主要的切割甘露聚糖主链的糖苷水解
酶［７］。 甘露聚糖酶在植物、软体动物和微生物中被广
泛发现，其中以微生物来源的甘露聚糖酶的种类最
多［８］、研究最广，中国科学院微生物研究所还曾通过
卫星搭载获得产甘露聚糖酶比对照高 ９０％的微生物
菌株［９］。 根据碳水化合物活性酶 ＣＡＺｙ 分类系统
（ｗｗｗ． ｃａｚｙ． ｏｒｇ），β⁃１，４⁃甘露聚糖酶主要划分为 ３ 个
糖苷水解酶家族，分别为 ＧＨ５、ＧＨ２６ 和 ＧＨ１１３［１０］。
通过对其结构信息和催化机制的研究，这 ３ 个家族同
属于糖苷水解酶的超家族 Ｃｌａｎ Ａ［７］。 细菌来源的甘
露聚糖酶在 ３ 个家族均有分布，但真菌来源的甘露聚
糖酶基因大多都分布在 ＧＨ５ 家族中。 中温真菌来源
的 ５ 家族甘露聚糖酶已被广泛研究，其最适 ｐＨ 值在
７８
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
１􀆰 ５ ～ ６􀆰 ０ 之间，温度在 ４０ ～ ６０℃。 但高温真菌来源的
研究相对较少，如 Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． ＣＱ３１［１１］，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ ＸＺ３［１２］， Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ Ｙ１［１３］， Ｔｈｉｅｌａｖｉａ
ａｒｅｎａｒｉａ ＸＺ７［１４］，Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ［１５］。 相对细菌来源
的甘露聚糖酶，真菌来源甘露聚糖酶具有高比活，表达
量高等特点，在造纸，纺织印染，洗涤，食品，饲料，医药
和石油开采等工业中已被广泛应用［１６ － １７］。
巴斯德毕赤酵母表达系统具有表达量高、遗传稳
定性好、翻译后修饰、容易规模化生产、成本低等特
点［１６］。 目前该系统已经广泛应用到真菌来源的半纤
维素酶的异源表达，如 Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｉｎｏｐｈｉｌｕｍ Ｃ１ 的 β⁃
１，３（４）⁃葡聚糖酶［１８］，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ 的木聚
糖［１９］， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＢＫ０１ 的甘露聚糖酶［２０］等。 本
研究从沙子样品中分离到 １ 株高产半纤维素酶的真菌
Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８， 利用兼并引物和 Ｔａｉｌ⁃ＰＣＲ
（ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｓｙｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ）的方法扩增到 １ 个
新的第 ５ 家族的甘露聚糖酶基因 ｍａｎ５Ｘｚ８。 该基因在
毕赤酵母高效表达系统中获得成功表达，表达蛋白经
纯化后进行了酶学性质测定，为后期对 ５ 家族甘露聚
糖酶的酸碱催化机制提供优良的研究材料。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种和试剂 　 无毛毛壳属 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ．
Ｘｚ８ 分离于宁夏沙子表面，该菌种保存于中国微生物
菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为 ＣＧＭＣＣ
６５４５。 大肠杆菌菌株 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ＤＨ ５α 和质粒
载体 ｐＧＥＭ⁃Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ 购自 Ｐｒｏｍｅｇａ公司（Ｍａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓ． ，ＵＳＡ），酵母表达载体 ｐＰＩＣ９ 和宿主菌 Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５ 购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ． ，
ＵＳＡ），ＲＡＣＥ 试剂盒，ＤＮＡ 回收试剂盒，限制性内切
酶，Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自美国 Ｐｒｏｍｅｇａ公司。 角豆胶购
自 Ｓｉｇｍａ 公司（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）。 常规试剂均为国
产分析纯。
１􀆰 ２　 甘露聚糖酶基因的克隆与分析
１􀆰 ２􀆰 １　 保守序列的克隆　 根据已发表的真菌来源的
５ 家族甘露聚糖酶基因的氨基酸序列进行比对，确定
ＮＮＷＤＤＹ（Ｆ） ＧＧ 和 ＡＷＥＬＡＮＥＰＲ 为其保守区序列，
依据遗传密码子反推出相应的核苷酸序列，设计真菌
５ 家族甘露聚糖酶的简并引物 ＭＰ１ 和 ＭＰ２（表 １） ［２２］。
采用真菌基因组 ＤＮＡ 提取方法 （ ＣＴＡＢ 法） 提取
Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 基因组 ＤＮＡ［２１］。 以提取的基因
组 ＤＮＡ（５０ ｎｇ）为扩增模板，进行降落（ Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）
ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ 反应参数为： ９５℃ ５ ｍｉｎ； ９４℃ ３０ ｓ，
５０ ～ ４５℃ ３０ ｓ， ７２℃ ３０ ｓ， １０ 个循环 （其中每个循环
后复性温度下降 １℃）； ９４℃ ３０ ｍｉｎ， ４５℃ ３０ ｓ， ７２℃
３０ ｓ， ３０ 个循环； ７２℃ １０ ｍｉｎ。 将获得的特异性基因
片段进行回收，经于 ｐＧＥＭ⁃Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ 连接挑取阳
性克隆送测序公司进行序列测定。
１􀆰 ２􀆰 ２　 基因全长的克隆　 根据已获得的测序正确的
基因保守区片段序列，根据 Ｔａｉｌ⁃ＰＣＲ方法［２３］的原理设
计两翼未知序列的上下游引物（表 １） ［２０］，采用 Ｔａｉｌ⁃
ＰＣＲ方法进行全长基因的扩增。 扩增得到的特异片
段与 ｐＧＥＭ⁃Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ 连接，挑选阳性克隆子进行
序列测定，将获得的正确的两翼序列与保守区序列通
过软件进行拼接后得到正确的基因全长序列。
１􀆰 ２􀆰 ３　 甘露聚糖酶 ｃＤＮＡ 的克隆 　 将 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ
ｓｐ． Ｘｚ８ 原菌接种于产酶诱导培养基中，４５℃、２００
ｒ·ｍｉｎ － １振荡培养 ３ ｄ，离心收集菌体，并用液氮进行
研磨，利用微生物总 ＲＮＡ 提取试剂盒 （ ＱＩＡＧＥＮ，
Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）提取总 ＲＮＡ。 利用反转录试剂盒
（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａ Ａｃｅ⁃α⁃ＴＭ ｋｉｔ，ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）通
过 Ｏｌｉｇｏ⁃ｄＴ对提取的总 ＲＮＡ进行反转录，合成 ｃＤＮＡ。
１􀆰 ３　 甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的重组表达
１􀆰 ３􀆰 １　 表达载体的构建　 通过生物信息学分析其外
显子序列，设计表达引物 ＰＩＣ５Ｆ 和 ＰＩＣ５Ｒ（表 １） ［２０］，
以合成的 ｃＤＮＡ 为模板，进行成熟蛋白基因的扩增，
反应条件为：９４℃预变性 ５ ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｓ， ５５℃ ３０ ｓ，
７２℃ ２ ｍｉｎ， ３０ 个循环后，７２℃延伸 ７ ｍｉｎ。 扩增获得
的 ＰＣＲ产物回收纯化后用 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｎｏｔ Ｉ 双酶切，然
后用 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶与酵母表达载体 ｐＰＩＣ９ 载体进行
连接，构建酵母表达载体 ｐＰＩＣ９⁃ｍａｎ５Ｘｚ８，重组载体经
电击转化大肠杆菌 ＤＨ ５α，通过 ＰＣＲ和质粒酶切的方
法筛选出阳性重组子，送测序公司测序正确后进行质
粒的提取。
１􀆰 ３􀆰 ２　 酵母的电击转化及筛选　 提取的阳性重组质
粒用 Ｂｇｌ ＩＩ进行酶切，获得线性化的质粒，通过电击方
法转化到毕赤酵母 ＧＳ１１５ 感受态细胞。 按照美国
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的酵母操作手册进行后期培养，筛选到
含有质粒的阳性转化子。
１􀆰 ３􀆰 ３　 甘露聚糖酶酶活力测定方法　 甘露聚糖酶的
测定方法采用 ＤＮＳ 法测定［２３］。 反应体系中底物为
９００μＬ角豆胶（１􀆰 ０％ ，ｗ ／ ｖ），缓冲液选择 ｐＨ 值为 ５􀆰 ０
的 ２０ｍＭ磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲液，加入 １００ μＬ的
酶液。 在 ５０℃水浴中反应 １０ｍｉｎ，然后加入 １􀆰 ５ｍＬ
ＤＮＳ，沸水浴中进行煮沸 ５ｍｉｎ，待反应体系降至室温，
在 ５４０ｎｍ下利用分光光度计测定其 ＯＤ 值，并利用公
８８
　 １ 期 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达及其酶学性质分析
　 　 　 　 表 １　 试验所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （５′→３′）
长度
Ｓｉｚｅ ／ ｂｐ
ＭＰ１ ＡＡＹＡＡＹＴＧＧＧＡＹＧＡＹＴＷＹＧＧＮＧＧ ２３
ＭＰ２ ＧＧＹＴＣＴＹＹＮＳＣＮＡＴＹＴＣＣＣＡＮＧＣ ２３
ｍａｎ５Ｘｚ８⁃ＳＦ１ ＣＧＧＣＡＣＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣ ２６
ｍａｎ５Ｘｚ８⁃ＳＦ２ ＣＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＧＴＴＴＧＣ ３０
ｍａｎ５Ｘｚ８⁃ＳＲ１ ＣＣＧＧＧＣＧＧＡＣＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧ ３４
ｍａｎ５Ｘｚ８⁃ＳＲ２ ＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣ ３２
ＰＩＣ５Ｆ ＧＧＧ ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＡＣＣＣＧＧＣＣＧＴＣＣＴＴＣ ３５
ＰＩＣ５Ｒ ＧＧＧ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＧＣＣＧＡＴＴＧＡＧＡＧＣＡＴＴＣＡＴＣ ３６
　 　 注： Ｙ ＝ Ｃ ／ Ｔ，Ｒ ＝ Ａ ／ Ｇ， Ｓ ＝ Ｃ ／ Ｇ， Ｎ ＝ Ａ ／ Ｔ ／ Ｇ ／ Ｃ；限制性酶切位点用下划线在引物下方标示。
Ｎｏｔｅ： Ｙ ＝ Ｃ ／ Ｔ，Ｒ ＝ Ａ ／ Ｇ， Ｓ ＝ Ｃ ／ Ｇ， Ｎ ＝ Ａ ／ Ｔ ／ Ｇ ／ Ｃ． Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｒｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．
式计算出酶活单位。 酶活单位定义：以每分钟产生出
１ μｍｏｌ甘露糖所需酶量定义为一个酶活单位（Ｕ）。 对
照反映体系中仅含有底物，在反应 ５ ｍｉｎ 中后添加
１􀆰 ５ｍＬ ＤＮＳ和 １００μＬ酶液，然后进行煮沸读值。
１􀆰 ３􀆰 ４　 重组甘露聚糖酶的诱导表达　 将 ９６ 个阳性转
化子从 ＭＤ培养基上转接到 ３ ｍＬ ＢＭＧＹ培养基中，３０
℃、２００ ｒ·ｍｉｎ － １振荡培养 ４８ ｈ，进行离心收集酵母菌
体，加入 １ｍＬ ＢＭＭＹ 液体培养基对菌体进行重新悬
浮，３０ ℃、２００ ｒ·ｍｉｎ － １振荡培养 ４８ ｈ，离心吸取上清
液，对各上清液在 ５０℃，ｐＨ 值 ５􀆰 ０ 的反应条件下进行
酶活检测。 根据测定的酶活力高低筛选出活性最高的
转化子。 将活力最高的转化子进行摇瓶水平发酵，该
转化子接种到 ３００ ｍＬ ＢＭＧＹ 培养基中， ３０℃、
２００ｒ·ｍｉｎ － １振荡培养 ４８ ｈ 后，离心收集菌体，用 １００
ｍＬ ＢＭＭＹ诱导培养基进行重悬，其中每间隔 １２ ｈ 往
里面加入 ５％的甲醇，３０℃、２００ ｒ·ｍｉｎ － １振荡培养 ７２
ｈ。 诱导结束后进行高速离心收集上清液，再在 ５０℃，
ｐＨ值 ５􀆰 ０ 的反应条件下进行酶活检测。
１􀆰 ４　 重组甘露聚糖酶的纯化
离心收集的上清液首先用 Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０ 切向流超
滤膜包（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ， Ｇöｔｔｉｎｇｅｎ公司， 德国）进行浓缩，取
２􀆰 ０ ｍＬ浓缩后的粗酶液上预先用缓冲液 Ａ（２０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ⁃ＨＣｌ， ｐＨ 值 ８􀆰 ０ 的缓冲液） 平衡的 ＨｉＴｒａｐ Ｑ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｘｌ阴离子柱（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），采用终浓度为
１ｍｏｌ·Ｌ － １ ＮａＣｌ进行梯度洗脱，对各洗脱峰进行收集，
分别对其进行酶活测定。 将测定到具有酶活的洗脱峰
进行（ＳＤＳ）⁃ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＰＡＧＥ）
蛋白电泳分析。 根据电泳结果分析其纯度和分子量，
并将达到电泳纯的各管合并，经过浓缩后通过 Ｂｉｏｒａｄ
方法进行蛋白定量。
１􀆰 ５　 甘露聚糖酶酶学性质的测定
１􀆰 ５􀆰 １　 最适 ｐＨ和最适温度的测定　 最适 ｐＨ的测定
体系是以不同的 ｐＨ 缓冲液（ｐＨ 值 ４􀆰 ０ ～ １０􀆰 ０）配制
的 １％角豆胶溶液作为底物，将纯化的酶在各 ｐＨ下进
行稀释，然后在 ５０℃条件下反应 １０ｍｉｎ， 进行酶活测
定。 最适温度则是在测定的最适 ｐＨ 下，将反应温度
控制在 ３０ ～ ８０℃范围内，每间隔 １０℃下进行酶促反
应，然后根据测定酶活力。
１􀆰 ５􀆰 ２　 ｐＨ稳定性和热稳定性的测定 　 ｐＨ 稳定性的
测定是先将纯化酶液在 ｐＨ 值 ４􀆰 ０ ～ １１􀆰 ０ 的缓冲液中
３７℃下温浴 １ ｈ，然后进行适当稀释后以角豆胶作为底
物，在最适 ｐＨ 和最适温度下测定剩余的酶活性。 热
稳定性的测定选择不同温度（３０、４０℃）下分别处理不
同时间（２、５、１０、２、３０ 和 ６０ｍｉｎ），最后在最适条件下
测定剩余酶活力，以未处理的酶作为阴性对照。
１􀆰 ６　 金属离子和化学试剂对酶活性的影响
不同浓度（１、５ ｍｍｏｌ·Ｌ － １）的金属离子及化学试
剂 （ Ｃｕ２ ＋ 、 Ｍｇ２ ＋ 、 Ｆｅ３ ＋ 、 Ｚｎ２ ＋ 、Ａｇ ＋ 、Ｎａ ＋ 、Ｋ ＋ 、Ｃａ２ ＋ 、
Ｌｉ ＋ 、Ｃｏ２ ＋ 、Ｃｒ３ ＋ 、Ｎｉ２ ＋ 、Ｍｎ２ ＋ 、ＥＤＴＡ 和 ＳＤＳ）加入到反
应体系中，然后在最适反应条件下测定酶活力。 以不
添加任何离子和试剂的作为对照，根据酶活力数值换
算出各种金属离子及化学试剂在不同浓度下对酶活的
影响。
１􀆰 ７　 底物特异性和动力学常数的测定
１􀆰 ７􀆰 １　 底物特异性分析　 在最适 ｐＨ 值 ５􀆰 ０ 和最适
温度 ５０℃条件下，以 １􀆰 ０％ （ｗ ／ ｖ）的角豆胶、魔芋粉、
瓜尔豆胶，榉木木聚糖，大麦葡聚糖，ＣＭＣ⁃Ｎａ 作为底
物，用甘露聚糖酶进行处理，采用 ＤＮＳ 法测定酶解液
９８
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
中的还原糖，根据还原糖的数值换算出酶对不同底物
的降解能力。
１􀆰 ７􀆰 ２　 动力学常数测定　 动力学常数（Ｋｍ和 Ｖｍａｘ）的
测定选取角豆胶为底物，配置 １􀆰 ０ ～ １０􀆰 ０ ｍｇ·ｍＬ － １的
底物，缓冲液选取 ０􀆰 ２ ｍｏｌ·Ｌ － １ ｐＨ 值 ５􀆰 ５ 柠檬酸 －磷
酸氢二钠缓冲液。 然后在最适 ｐＨ 和最适温度下反应
５ ｍｉｎ， 获 得 酶 活 单 位。 利 用 双 倒 数 作 图 法
（ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ⁃ｂｕｒｋ法），即以 １ ／ ［ ｓ］为横坐标，１ ／ ｖ 为纵
坐标绘制曲线，通过米氏方程进行计算，获得酶对角豆
胶的动力学常数。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 甘露聚糖酶基因的克隆与序列分析
利用 ５ 家族甘露聚糖酶的兼并引物通过降落 ＰＣＲ
扩增出特异的基因片段（１７９ ｂｐ），通过与 ＮＣＢＩ 数据
库中已注册的序列进行比对，结果表明获得的基因片
段的氨基酸序列与来源于 Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． ＣＱ３１ 的甘
露聚糖酶的氨基酸序列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ． ＡＤＷ８２１０４􀆰 １）
一致性为 ９３％ ，初步证明获得的基因片段为甘露聚糖
酶基因的部分片段。 通过 ＴＡＩＬ⁃ＰＣＲ 扩增获得了该片
段两翼的基因序列，通过软件拼接获得了基因全长序
列。 对全长序列进行序列分析发现，该基因长度为
１ ３０８ ｂｐ， 其中 １８４ ～ ２５２ ｂｐ 为预测的内含子序列。
ｃＤＮＡ序列测序发现其 ｍＲＮＡ全长 １ ２３９ ｂｐ， 编码 ４１２
个氨基酸和 １ 个终止密码子，信号肽预测表明其 Ｎ 端
含有 ２０ 个氨基酸为信号肽序列，预测的理论分子量为
３９􀆰 ３ｋＤａ，等电点 ｐＩ 为 ５􀆰 ９７。 经 ＢｌａｓｔＰ 序列比对表明
其氨基酸序列与来源于 Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ． Ｙ１ 的经过性质验
证的 ５ 家族甘露聚糖酶氨基酸序列 （ ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．
ＡＤＺ９９３０１􀆰 １）一致性为 ８２％ ，序列已递交 ＧｅｎＢａｎｋ，注
册号为 ＫＦ９４１３００。 利用生物信息学软件对其进行了
同源建模并预测了三维结构，其两个推测的两个酸碱
催化残基 Ｇｌｕ （２０７）和 Ｇｌｕ （３２６）分别位于第 ４ 个和
第 ７ 个 β折叠片上。
２􀆰 ２　 甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达
通过 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增获得甘露聚糖酶基因的成熟蛋
白编码基因，ＰＣＲ产物经双酶切后连接到毕赤酵母表
达载体 ｐＰＩＣ９ 上，经序列测定后构建出了正确的重组
表达载体 ｐＰＩＣ９⁃ｍａｎ５Ｘｚ８。 重组表达质粒经 Ｂｇｌ ＩＩ 线
性化后，电击转化毕赤酵母感受态细胞 ＧＳ１１５。 重组
转化子通过诱导培养基里用甲醇诱导产酶 ４８ ｈ， 对发
酵上清液进行活性测定。 １００ 个转化子中有 ６２ 株可
明显检测到甘露聚糖酶活性，其中 ２７＃转化子的酶活
力最高，将其进行摇瓶发酵 ７２ ｈ 后进行测定，酶活力
可达到 ６２􀆰 ０ Ｕ·ｍＬ － １。
２􀆰 ３　 甘露聚糖酶的纯化
摇瓶水平的发酵上清液经过浓缩，经离子交换柱
层析法分离。 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ结果表明经过分离纯化获得
电泳纯的表达蛋白。 其表观蛋白分子量为 ５５􀆰 ０ ｋＤａ
（图 １），相比理论分子量 ３９􀆰 ３ｋＤａ蛋白偏大，这可能由
于毕赤酵母表达后发生了 Ｎ⁃糖基化所造成的。
注：Ｍ： 蛋白分子量 Ｍａｒｋｅｒ； １， ２： 纯化的重组蛋白 Ｍａｎ５Ｘｚ８。
Ｎｏｔｅ： Ｍ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ。
１， ２： Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍａｎ５Ｘｚ８．
图 １　 纯化的甘露聚糖酶Ｍａｎ５Ｘｚ８ 的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ． １　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｏｆ ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍａｎ５Ｘｚ８
２􀆰 ４　 酶学性质的分析
纯化的甘露聚糖酶最适 ｐＨ 值为 ５􀆰 ０，在 ｐＨ 值
８􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 仍可以保持 ４０％左右的酶活力（图 ２ － Ａ）。
３７℃下在 ｐＨ值 ５􀆰 ０ ～ ９􀆰 ０ 的缓冲液中处理 ｌ ｈ，酶活力
仍剩余 ８０％以上（图 ２ － Ｂ），而在酸性（ｐＨ 值 ＜ ４􀆰 ０）
和碱性条件（ ｐＨ 值 ＞ １０􀆰 ０）下不稳定。 最适温度为
５０℃，在低温条件下具有良好的酶活力，而在 ７０℃仅
剩余 ２０％的酶活力（图 ２ － Ｃ），该酶的热稳定性很差，
仅在 ３０℃下稳定，而 ４０℃处理 ２０ ｍｉｎ，酶活仅剩余
２０％ （图 ２ － Ｄ）。
２􀆰 ５　 不同金属离子及化学试剂对酶活力的影响
不同浓度的化学试剂及金属离子对 Ｍａｎ５Ｘｚ８ 的
活力具有不同的影响。 结果表明，低浓度下大多数金
属离子和化学试剂对酶活力影响不大，而 Ａｇ ＋能明显
的降低酶活， 较突出的是在 １ｍＭ ＳＤＳ 下依然能够保
持 ８０％以上的酶活；Ｃｕ２ ＋ 、Ｃｏ２ ＋和 Ｍｎ２ ＋能一定程度上
０９
　 １ 期 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达及其酶学性质分析
注：Ａ： 酶的最适 ｐＨ； Ｂ： 酶的 ｐＨ稳定性； Ｃ； 酶的最适温度； Ｄ： 酶的热稳定性。
Ｎｏｔｅ： Ａ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｍａｎｎａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂ： ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ｏｆ ｍａｎｎａｎａｓｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ． Ｃ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ
ｍａｎｎａｎｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｄ： Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ．
图 ２　 甘露聚糖酶Ｍａｎ５Ｘｚ８ 的酶学性质
Ｆｉｇ． ２　 Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍａｎ５Ｘｚ８
促进酶活。 但在高浓度下，仅有 Ｃｕ２ ＋和 Ｍｎ２ ＋对酶具
有促进作用，其他离子和试剂均对酶活力起到一定的
抑制作用。
２􀆰 ６　 底物特异性和动力学分析
结果表明，Ｍａｎ５Ｘｚ８ 对角豆胶的降解能力最强
（１００％ ），比活力为 １０１􀆰 ６ Ｕ·ｍｇ － １，其次是魔芋粉
（６５􀆰 ２％ ），瓜尔豆胶（１３􀆰 １％ ）、而对榉木木聚糖、大麦
葡聚糖糖和 ＣＭＣ⁃Ｎａ没有活性。 以角豆胶为底物测定
的 Ｍａｎ５Ｘｚ８ 的 Ｋｍ 值分别为 ４􀆰 ４ｍｇ·ｍＬ － １，Ｖｍａｘ 值为
１２８􀆰 ２μｍｏｌ·（ｍｉｎ·ｍｇ） － １。
３　 讨论
Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 分离于宁夏沙子样品，通过
对其生长温度的研究发现其最适生长温度在 ４５ ～
５０℃之间，而在 ２０℃下不能生长，说明其是一株高温
真菌。 通过对其产酶进行了诱导培养，发现其可高产
纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等多种酶系。 本研究
从 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 得到的 ５ 家族的甘露聚糖酶
是一个中温酶（５０℃）。 其与来源于 Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ Ｙ１ 的
５ 家族甘露聚糖酶 Ｍａｎ５Ａ 成熟蛋白的氨基酸序列一
致性为 ９０􀆰 ０％ ［１３］。 但其最适温度和稳定性与 Ｍａｎ５Ａ
有很大的区别，Ｍａｎ５Ａ的最适温度为 ７０℃比 Ｍａｎ５Ｘｚ８
（５０℃）高 ２０℃。 另外，在热稳定性方面，Ｍａｎ５Ａ 在
５０℃下具有较好的稳定性，而 Ｍａｎ５Ｘｚ８ 在 ４０℃都比较
差。 通过 ２ 者氨基酸序列和模拟三维结构比较，
　 　 　 　 　 　表 ２ 不同金属离子及化学试剂对酶活力的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍａｎ５Ｘｚ８
试剂
Ｒｅｇｅａｎｔｓ
相对酶活力
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ／ ％
１ ｍＭ ５ ｍＭ
Ｎｏｎｅ １００􀆰 ０ ± ２􀆰 ４ １００􀆰 ０ ± ３􀆰 ７
Ｌｉ ＋ ９３􀆰 ９ ± ４􀆰 １ ７０􀆰 １ ± ３􀆰 １
Ｎａ ＋ ９３􀆰 ７ ± ４􀆰 ０ ９０􀆰 ４ ± ３􀆰 ７
Ｋ ＋ １０１􀆰 ６ ± ４􀆰 １ ９３􀆰 ８ ± ４􀆰 ２
Ａｇ ＋ ６５􀆰 ０ ± ２􀆰 ７ １０􀆰 ７ ± ０􀆰 ９
Ｃａ２ ＋ ８６􀆰 １ ± ２􀆰 ９ ７５􀆰 ５ ± ３􀆰 ６
Ｃｕ２ ＋ １２１􀆰 ８ ± ５􀆰 ２ １１３􀆰 １ ± ５􀆰 ６
Ｃｏ２ ＋ １１４􀆰 ８ ± ５􀆰 ０ ９６􀆰 ３ ± ４􀆰 ０
Ｍｎ２ ＋ １５７􀆰 ９ ± ６􀆰 ４ １４５􀆰 ７ ± ６􀆰 ７
Ｎｉ２ ＋ １０３􀆰 ４ ± ４􀆰 １ ９６􀆰 ０ ± ４􀆰 ２
Ｚｎ２ ＋ ８７􀆰 ２ ± ３􀆰 ８ ８２􀆰 ８ ± ３􀆰 ５
Ｍｇ２ ＋ ８８􀆰 ２ ± ３􀆰 ８ ９２􀆰 ２ ± ３􀆰 ８
Ｆｅ３ ＋ ９２􀆰 ８ ± ３􀆰 ７ ８２􀆰 ６ ± ３􀆰 ８
ＥＤＴＡ ９２􀆰 ６ ± ３􀆰 ４ ７９􀆰 ４ ± ３􀆰 ８
ＳＤＳ ８２􀆰 ５ ± ３􀆰 ６ ３４􀆰 ８ ± １􀆰 ４
Ｍａｎ５Ｘｚ８ 在结构上 Ｌｏｏｐ 区的长度更长，脯氨酸含量
低，这些是可能导致其热稳定性差的相关因素。 酶的
热稳定性研究是目前研究的热点，而且影响酶的热稳
定性因素众多，包括蛋白质氨基酸的组成，糖基化的有
１９
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
无，三维结构中刚性和柔性区域的比例，Ｌｏｏｐ 区的长
短，氨基酸相互形成的化学键及作用力［２４］。 因此后期
进行相关的氨基酸序列分析，对其二级和三级结构进
行比较寻找关键结构区域或氨基酸残基，结合生物信
息学技术和突变技术进行相关突变体的性质测定来研
究对 ＧＨ５ 家族甘露聚糖酶的稳定性起决定作用的因
素。
由于真菌来源的 ＧＨ ５ 甘露聚糖酶具有很多优良
性质，不同种属的基因已被克隆，并大多进行了异源表
达和性质测定。 其中大多数甘露聚糖酶最适 ｐＨ 大多
都在酸性范围（ｐＨ值 ４􀆰 ０ ～ ５􀆰 ０），而在 ｐＨ值 ８􀆰 ０ 以上
几乎没有活性［４］。 经酶学性质测定，其最适 ｐＨ 值为
５􀆰 ０， 与已报道的真菌来源的甘露聚糖酶性质类似，但
其在 ｐＨ值 ９􀆰 ０ 仍具有 ４０％左右的酶活力。 在碱性
ｐＨ下仍具有较高酶活力的甘露聚糖酶报道很少，如
Ｍａｎ５Ａ 来源于 Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ Ｙ１［１２］， Ｍａｎ５Ｘｚ７ 来源于
Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｒｅｎａｒｉａ ＸＺ７［１４］和Ｍａｎ５Ｘｚ３ 来源于 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ Ｘｚ３［１２］。
对这些基因相关序列进行比对分析发现其氨基酸
序列组成中碱性氨基酸所占比例相对较高，对
Ｍａｎ５Ｘｚ８ 的序列分析表明，其酸性氨基酸和碱性氨基
酸比例为 ５１∶ ４５，其中碱性氨基酸大多分布在蛋白质
表面和催化中心。 蛋白质表面的碱性氨基酸导致其在
中碱性 ｐＨ下可以保持良好的稳定性，而催化中心的
碱性氨基酸使其能在碱性 ｐＨ作用范围内具有较高酶
活。
甘露聚糖酶基因 ｍａｎ５Ｘｚ８ 已成功在毕赤酵母中
获得分泌表达，摇瓶发酵 ７２ ｈ 酶活力可达到 ６２􀆰 ０
Ｕ·ｍＬ － １，明显低于已报道的来源于 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
ＢＫ０１ 的甘露聚糖酶（６７０ Ｕ·ｍＬ － １） ［２０］。 以后通过优
化基因的拷贝数和密码子，以及 Ｇ ＋ Ｃ 含量与信号肽
序列，Ｍａｎ５Ｘｚ８ 表达水平可能会进一步提高，从而在工
业应用中更节约成本。 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 结果发现其表观分
子量为 ５５􀆰 ０ ｋＤａ，明显高于理论分子量 ３９􀆰 ３ ｋＤａ． ， 说
明其在毕赤酵母表达过程发生了翻译后修饰修饰。 毕
赤酵母表达系统表达的蛋白的糖基化修饰主要为 Ｎ⁃
糖基化和 Ｏ⁃糖基化，其中最常见的为 Ｎ⁃糖基化［１２］。
通过氨基酸序列分析和软件预测发现，Ｍａｎ５Ｘｚ８ 不含
有潜在的 Ｏ⁃糖基化位点，但存在 ３ 个潜在的 Ｎ⁃糖基化
位点，说明重组表达的 Ｍａｎ５Ｘｚ８ 发生了明显的 Ｎ⁃糖基
化修饰。 后期可通过定点突变对其 Ｎ⁃糖基化修饰对
酶的折叠、酶活力、和稳定性的影响进行研究。
Ｍａｎ５Ｘｚ８ 具有较好的金属离子和化学试剂抗性，其中
Ｚｎ２ ＋和 Ｆｅ３ ＋对酶活几乎没有任何影响，而重金属离子
Ｃｕ２ ＋和Ｍｎ２ ＋能促进酶活力，而通常这些离子抑制真菌
来源的 ５ 家族的甘露聚糖酶活力，这说明 Ｍａｎ５Ｘｚ８ 具
有更高的金属离子耐受性。 化学试剂 ＳＤＳ 已被报道
对多种甘露聚糖酶具有明显的抑制作用，如来源于
Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． ＣＱ３１［１１］的 ＣｓＭａｎ５Ａ经 ＳＤＳ处理后仅
能剩余 ２０％ 的酶活力，来源于 Ｈ． ｉｎｓｏｌｅｎｓ Ｙ１［１３］的
Ｍａｎ５Ａ则酶活力完全丧失。 而 Ｍａｎ５Ｘｚ８ 在 １ｍＭ ＳＤＳ
下，依然能够保持 ８０％以上的酶活，表现出的对 ＳＤＳ
的高耐受性。
４　 结论
通过兼并引物和 Ｔａｉｌ⁃ＰＣＲ 的方法从高产甘露聚
糖酶的高温真菌 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 中获得了 １ 个
新的 ５ 家族甘露聚糖酶，并成功在毕赤酵母中获得高
效表达。 重组酶具有中温耐碱的特性，并且对大多数
金属离子和化学试剂具有良好的耐受性，有利于其在
工业领域中的应用。 发现 Ｍａｎ５Ｘｚ８ 和其氨基酸一致
性高的甘露聚糖酶的性质差异明显，进一步进行三维
结构比较分析和定点突变，为后期研究 ５ 家族的甘露
聚糖酶的酸碱催化和热稳定性机理提供了优良的材
料。
参考文献：
［ １ ］ 　 Ｌｙｎｄ Ｌ Ｒ， Ｗｅｉｍｅｒ Ｐ Ｊ， ｖａｎ Ｚｙｌ Ｗ Ｈ， Ｐｒｅｔｏｒｉｕｓ Ｉ Ｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ： ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ［Ｊ］ ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２００２， ６６（３）：５０６ －
５７７
［ ２ ］　 Ｓｈａｌｌｏｍ Ｄ， Ｓｈｏｈａｍ Ｙ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ［Ｊ］ ． Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００３， ６（３）：２１９ － ２２８
［ ３ ］　 Ｓａｈａ Ｂ Ｃ． Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３， ３０（５）：２７９ － ２９１
［ ４ ］　 Ｐｅｔｋｏｗｉｃｚ Ｃ Ｌ Ｏ， Ｒｅｉｃｈｅｒ Ｆ， Ｃｈａｎｚｙ Ｈ， Ｔａｒａｖｅｌ Ｆ Ｒ， Ｖｕｏｎｇ Ｒ．
Ｌｉｎｅａｒ ｍａｎｎａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ｏｆ Ｓｃｈｉｚｏｌｏｂｉｕｍ ａｍａｚｏｎｉｃｕｍ ［Ｊ］ ．
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２００１， ４４（２）：１０７ － １１２
［ ５ ］　 ＭｃＣｌｅａｒｙ Ｂ Ｖ． β⁃Ｄ⁃Ｍａｎｎａｎａｓｅ ［Ｊ］ ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１９８８， １６０：５９６ － ６１０．
［ ６ ］ 　 Ｍｏｒｅｉｒａ Ｌ Ｒ Ｓ， Ｆｉｌｈｏ Ｅ Ｘ Ｆ． Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍａｎｎａｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ
ｍａｎｎａｎ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ［Ｊ］ ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００８， ７９（２）：１６５ － １７８
［ ７ ］　 Ｄｈａｗａｎ Ｓ， Ｋａｕｒ Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍａｎｎａｎａｓｅｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］ ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
２００７， ２７（４）：１９７ － ２１６
［ ８ ］　 Ｃｈａｕｈａｎ Ｐ Ｓ， Ｐｕｒｉ Ｎ， Ｓｈａｒｍａ Ｐ， Ｇｕｐｔａ Ｎ． Ｍａｎｎａｎａｓｅｓ： ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｓｏｕｒｃｅｓ， ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１２， ９３
（５）：１８１７ － １８３０
［ ９ ］　 沈会芳，张晓勇，蒲小明，林壁润． 空间诱变选育万隆霉素高产
２９
　 １ 期 Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ 甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达及其酶学性质分析
菌株［Ｊ］ ． 核农学报， ２００９， ２３（４）： ５７２ － ５７６
［１０］　 Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ， Ｄａｖｉｅｓ Ｇ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ⁃ｂａｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ［ Ｊ］ ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
１９９７， ７（５）：６３７ － ６４４
［１１］　 Ｋａｔｒｏｌｉａ Ｐ， Ｚｈｏｕ Ｐ， Ｚｈａｎｇ Ｐ， Ｙａｎ Ｑ， Ｌｉ Ｙ， Ｊｉａｎｇ Ｚ， Ｘｕ Ｈ． Ｈｉｇｈ
ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ β － ｍａｎｎａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ．
ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｎａｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ［ Ｊ］ ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，
２０１２， ８７（１）： ４８０ － ４９０
［１２］　 Ｌｕ Ｈ， Ｌｕｏ Ｈ， Ｓｈｉ Ｐ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｍｅｎｇ Ｋ， Ｙａｎｇ Ｐ， Ｙａｏ Ｂ． Ａ ｎｏｖｅｌ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｅｎｄｏ － β － １，４ － ｍａｎｎａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
ＸＺ３： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ａｎｄ Ｔｈｒ ／ Ｓｅｒ⁃
ｒｉｃｈ ｌｉｎｋｅｒ ｒｅｇｉｏｎ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１４，
９８（５）： ２１５５ － ２１６３
［１３］　 Ｌｕｏ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｋ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｓｈｉ Ｐ， Ｙａｎｇ Ｐ， Ｙａｏ Ｂ． Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ，
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｋａｌｉ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ β
－ ｍａｎｎａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ Ｙ１［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１２， ３９（４）：５４７ － ５５５
［１４］　 Ｌｕ Ｈ， Ｚｈａｎｇ Ｈ， Ｓｈｉ Ｐ， Ｌｕｏ Ｈ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｙａｎｇ Ｐ， Ｙａｏ Ｂ． Ａ ｆａｍｉｌｙ
５ β － ｍａｎｎａｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ａｒｅｎａｒｉａ
ＸＺ７ ｗｉｔｈ ｔｙｐｉｃａｌ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ［Ｊ］ ． Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１３， ９７（１８）： ８１２１ － ８１２８
［１５］　 Ｋａｔｒｏｌｉａ Ｐ， Ｙａｎ Ｑ， Ｚｈａｎｇ Ｐ， Ｚｈｏｕ Ｐ， Ｙａｎｇ Ｓ， Ｊｉａｎｇ Ｚ． Ｇｅｎｅ
ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｌｋａｌｉ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｅｎｄｏ － １，
４ － β － ｍａｎｎａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１３， ６１（２）：３９４ － ４０１
［１６］　 赵月菊， 薛燕芬， 马延和． β －甘露聚糖酶的结构生物学研究现
状和展望［Ｊ］ ． 微生物学报， ２００９， ４９（９）： １１３１ － １１３７
［１７］　 ｖａｎ Ｚｙｌ Ｗ Ｈ， Ｒｏｓｅ Ｓ Ｈ， Ｔｒｏｌｌｏｐｅ Ｋ， Ｇöｒｇｅｎｓ Ｊ Ｆ． Ｆｕｎｇａｌ β⁃
ｍａｎｎａｎａｓｅｓ： Ｍａｎｎａｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ， ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ
ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ［Ｊ］ ． Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１０， ４５
（８）：１２０３ － １２１３
［１８］ 　 Ｃｈｅｎ Ｘ， Ｍｅｎｇ Ｋ，Ｓｈｉ Ｐ， Ｂａｉ Ｙ， Ｌｕｏ Ｈ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｙｕａｎ Ｔ， Ｙａｎｇ
Ｐ， Ｙａｏ Ｂ． Ｈｉｇｈ⁃ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｎｄｏ⁃１，３
（４） － β⁃Ｄ⁃ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
［Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１２， ３９
（６）： ８６９ － ８７６
［１９］　 Ｆａｎ Ｇ， Ｋａｔｒｏｌｉａ Ｐ， Ｊｉａ Ｈ， Ｙａｎｇ Ｓ， Ｙａｎ Ｑ， Ｊｉａｎｇ Ｚ． Ｈｉｇｈ⁃ｌｅｖｅｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｘｙｌａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆｕｎｇｕｓ
Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ［Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒ， ２０１２， ３４（１１）：２０４３ － ２０４８
［２０］ 　 Ｄｏ Ｂ Ｃ， Ｄａｎｇ Ｔ Ｔ， Ｂｅｒｒｉｎ Ｊ Ｇ， Ｈａｌｔｒｉｃｈ Ｄ， Ｔｏ Ｋ Ａ， Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ Ｊ Ｃ，
Ｙａｍａｂｈａｉ Ｍ． Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＧＨ５ ｍａｎｎａｎ ｅｎｄｏ⁃１， ４⁃ｂｅｔａ⁃
ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＢＫ０１ ［Ｊ］ ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ
Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ， ２００９， １３（８）： ５９
［２１］ 　 卢海强． 嗜热微生物来源的甘露聚糖酶的克隆表达、热稳定性
及催化机理的研究［Ｄ］． 北京：中国农业科学院，２０１３：６１ － ７３
［２２］　 Ｇｒａｈａｍ Ｇ Ｃ， Ｍａｙｅｒｓ Ｐ， Ｈｅｎｒｙ Ｒ Ｊ． Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ
［Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９４ ， １６（１）：４８ － ５０
［２３］　 Ｌｉｕ Ｙ Ｇ， Ｗｈｉｔｔｉｅｒ Ｒ Ｆ． Ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ＰＣＲ：
ａｕｔｏｍａｔａｂｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔ ｅｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｆｒｏｍ Ｐ１ ａｎｄ ＹＡＣ ｃｌｏｎｅｓ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ ［Ｊ］ ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
１９９５， ２５（３）：６７４ － ６８１
［２４］　 Ｍｉｌｌｅｒ Ｇ Ｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ
ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ［Ｊ］ ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９５９， ３１（３）：４２６ － ４２８
［２５］　 Ｆｅｒｓｈｔ Ａ Ｒ． Ｔｈｅ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ： Ｉ． Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ［Ｊ］ ．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２， ２２４（３）： ７７１ － ７８２
３９
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
２０１５，２９（１）：００８７ ～ ００９４
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍａｎｎａｎｓｅ Ｆｒｏｍ
Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＬＩ Ｗｅｎｇｅ１，２ 　 ＳＨＩ Ｐｅｎｇｊｕｎ３ 　 ＬＵ Ｈａｉｑｉａｎｇ３ 　 ＹＡＯ Ｂｉｎ３
ＺＨＡＮＧ Ｑｉｌｉｎｇ２ 　 ＤＡＩ Ｌｉａｎｇｙｉｎｇ１
（ １Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ， Ｈｕｎａｎ　 ４１０１２８；２ Ｈｕｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｐａｃｅ⁃ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｃｈａｎｇｓｈａ， Ｈｕｎａｎ　 ４１０１２５；３Ｆｅｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃｅｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ　 １０００８１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｎｎａｎａｓｅ， ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｉｓ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄ， ｐａｐｅｒ，
ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ， ｆｏｏｄ， ｏｉｌ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｉｅｌｄｓ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ａ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ５ ｍａｎｎａｎｓｅ ｇｅｎｅ，
ｍａｎ５Ｘｚ８， ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ Ｔａｉｌ⁃ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８． Ｔｈｅ ｆｕｌｌ⁃
ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ １ ２３９ ｂｐ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｓ ４１２ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ２０ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｔ Ｎ⁃
ｔｅｒｍｉｎｕｓ． Ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈａｎｏｌ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ Ｍａｎ５Ｘｚ８ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ５５􀆰 ０ ｋＤａ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ
ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｍａｎ５Ｘｚ８ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ｐＨ ５􀆰 ０， ｉｔ ｒｅｔａｉｎｅｄ ＞ ４０􀆰 ０％ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ｐＨ ９􀆰 ０， ａｎｄ
ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｐＨ ｒａｎｇｅ ５􀆰 ０ ｔｏ ９􀆰 ０． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ５０℃， ａｎｄ ｉｔ ｈａｓ ｓｔｒｏｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ
ＳＤＳ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｖａｌｕｅｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ ｘｙｌａｎ ｗｅｒｅ １０１􀆰 ６ Ｕ·ｍｇ － １， ４􀆰 ４ ｍｇ·ｍＬ － １ ａｎｄ １２８􀆰 ２
μｍｏｌ·（ｍｉｎ·ｍｇ） － １， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｍａｎｎａｎｓｅ ａｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｆｏｒ ｖａｒｉｏｕｓ
ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ａｃｉｄ⁃ｂａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐ． Ｘｚ８， ｍａｎｎａｎｓｅ， ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ， ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
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