全 文 ：福建林学院学报　2009, 29(2):97-102
JournalofFujianCollegeofForestry
第 29卷 第 2期
2009年 4月
收稿日期:2009-01-04　　修回日期:2009-02-26
基金项目:福建省科技厅重大资助项目(2003I007)。
作者简介:黄宇(1984-),女 ,福建福州人 ,硕士研究生 ,从事森林培育学研究。通讯作者郑郁善(1960-),男 ,福建永泰人 ,教授 ,博士生导
师 ,从事森林培育学研究。
福建含笑 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
黄　宇 , 陈礼光 , 夏海涛 , 荣俊冬 , 孔　玲 , 廖鹏辉 , 郑郁善
(福建农林大学工业原料林研究所 ,福建 福州 350002)
摘要:以福建含笑叶片提取的基因组 DNA为材料 , 对影响 ISSR-PCR扩增效果的一些因素 , 如 dNTPs浓度 、Mg2+浓度 、Taq
DNA聚合酶用量 、引物用量 、模板 DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化 ,确立了可用于福建含笑 ISSR-PCR分析
最适宜的 PCR反应条件:20 μLPCR反应体积中含 0.4 mmol· L-1dNTPs, 2.5 mmol· L-1 Mg2+, 1.5 UTaqDNA聚合酶 ,
0.6 μmol· μL-1引物 , 30 ng模板 DNA。 PCR扩增程序:94℃预变性 2 min, 94℃变性 30 s, 47.3 ℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min,
45个循环, 72 ℃延伸 7 min, 4℃保存。应用 ISSR体系对 5份福建含笑种质进行了扩增 ,证实了该体系的适用性和稳定性。
关键词:福建含笑;ISSR-PCR;体系优化
中图分类号:S722.1.4 文献标识码:A 文章编号:1001-389X(2009)02-0144-05
EstablishmentandoptimizationofISSR-PCRreactionsystemofMicheliafujianensis
HUANGYu, CHENLi-guang, XIAHai-tao, RONGJun-dong, KONGLing, LIAOPeng-hui, ZHENGYu-shan
(InstituteofIndustrialForest, FujianAgricultureandForestryUniversity, Fuzhou, Fujian350002, China)
Abstract:TakinggenomicDNAextractedfromMicheliafujianensisleavesastheexperimentalmaterial, thefactorswhichaffected
theISSR-PCRamplificationsuchassuitableconcentrationfordNTPsandMg2+, thendosageforTaqDNApolymerase, theprimer,
templateDNAandannealingtemperaturewereselectedandoptimized.TheresultsshowedthatthesuitablePCRconditionsforISSR-
PCRofM.fujianensiswereasfolows:Inthe20 μLPCRreactionvolume, 0.4mmol· L-1 dNTPs, 2.5 mmol· L-1 Mg2+, 1.5 U
TaqDNApolymerase, 0.6 μmol· μL-1 primer, 30 ngtemplateDNA.TheoptimalPCRamplificationprocesswas:2 minutesat
94 ℃ forpredenaturation, thenfolowedby45 cycles, eachwith30secondsat94℃ fordenaturation, 30 secondsat47.3 ℃ for
annealing, 1 minuteat72 ℃ forextension, finallyextensionat72 ℃ for7 minutesandholdingthesamplesat4 ℃.TheISSR
systemwasappliedintheamplificationoffivevarietiesofM.fujianensis, indicatingthesuitabilityandstabilityofthesystem.
Keywords:Micheliafujianensis;ISSR-PCR;systemoptimization
福建含笑(MicheliafujianensisQ.F.Zheng)别名木荚白兰花 、牛皮柞 ,属木兰科(Magnoliaceae)含笑属
(Michelia)[ 1] ,主要分布于福建省的永安 、三明 、沙县 、建瓯 、邵武等地 ,多生于海拔 500m以下的山地林中 、
林缘及沟谷边[ 2] 。其树干通直挺拔 ,木材花纹细腻 ,有香味 ,是良好的家具及室内装饰用材 [ 3] ,也是一种
很有发展前途的速生阔叶更新树种 [ 4] 。
简单重复序列区间(intersimplesequencerepeat, ISSR)是以重复序列的单一引物为主要引物序列的
PCR标记 ,是 Zietkiewiczetal[ 5]于 1994年创建的 ,类似于随机扩增多态性 DNA(randomamplifiedpolymor-
phicDNA, RAPD),但 ISSR利用包含重复序列并在 3′或 5′端锚定单寡聚核苷酸的引物对基因组 DNA进
行 PCR扩增的标记系统 [ 6 -8] 。 ISSR引物比 RAPD的引物长 ,退火温度更高(50 ℃左右),因此 , ISSR具有
比 RAPD更高的可重复性和稳定性 [ 9 -11] 。鉴于目前尚未见对福建含笑的 ISSR反应体系进行优化的报
道 ,本研究以福建含笑叶片基因组 DNA为模板 ,探讨 ISSR-PCR反应体系中 6个因素对扩增的影响 ,以期
获得福建含笑 ISSR扩增的最佳反应体系 ,旨在揭示福建含笑自然种群的遗传结构 ,为进一步探究其遗传
多样性奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试材料采于福建省建瓯市万木林自然保护区内 , 2008年 6月分别采集同一海拔的 5株福建含笑嫩
DOI :10.13324/j.cnki.j fcf.2009.02.012
叶 ,洗净后 ,于 -70℃的低温冰箱内储存备用 。
1.2　试验设备与试剂
试验设备:LabCyclerPCR仪(圣欧国际有限公司);湖南湘仪 TGL-16台式高速冷冻离心机;JS-380B
紫外凝胶成像仪(上海培清科技有限公司);北京六一 DYY-10C型电泳仪;美菱低温冰箱;上海民桥 FA
1104型电子分析天平等。试验试剂:Mg2+、 dNTPs及 TaqDNA聚合酶 、DNALadderPlus、随机引物及其他
试剂购自上海生工公司;核酸染料 GoldView购自北京赛百盛公司 。
1.3　试验方法
1.3.1　基因组 DNA的提取与定量　采用杭州博日公司的 Biospin植物基因组 DNA提取试剂盒(Ca#t
BSC13S1)法提取 DNA, 经 1.0%琼脂糖凝胶电泳 ,用 JS-380B紫外凝胶成像仪(上海天能科技服务公司)
拍照定量 , -20 ℃保存备用。
1.3.2　ISSR原初扩增条件与 PCR扩增程序　ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学提供的序列 [ 12] ,由上海
生工公司合成。原初的扩增反应体系:20 μLPCR反应体积中含 2 μL10×bufer, 0.4 mmol·L-1 dNTPs,
2.5 mmol· L-1 Mg2+, 40ng模板 DNA, 0.4 μmol· L-1引物 , 2 UTaqDNA聚合酶。初步设定的 ISSR-PCR
扩增程序:94℃预变性 2min, 94 ℃变性 30 s, 43 ℃退火 30s, 72℃延伸 1 min,共 45个循环;72 ℃完全延
伸 7 min, 4℃保存 。扩增产物在 1.5%的琼脂糖凝胶(含 1 μLGoldView核酸染料 /25mL)中电泳(电泳缓
冲液为 1×TBE),采用 100bpDNAMarker(Fermentas)作标准分子量参照物。
1.3.3　ISSR-PCR扩增反应体系的优化　对影响扩增结果的 dNTPs浓度 、Mg2+浓度 、TaqDNA聚合酶用
量 、随机引物浓度和模板 DNA用量等主要因子进行研究 , PCR扩增程序同 1.3.2,在保持其他因子不变的
情况下每次改变一个扩增参数进行扩增 ,筛选最佳浓度 ,共试验了 5个因素各 7个水平(表 1),其余条件
同原初扩增条件 。
表 1　ISSR-PCR扩增体系筛选
Table1　ThescreeningofISSR-PCRamplificationsystem
水平 dNTPs/(mmol· L-1) Mg2+/(mmol· L-1) TaqDNA/U 引物 /(mol· L-1) DNA/ng
1 0.1 1.0 0.5 0.1 10
2 0.2 1.5 1.0 0.2 20
3 0.3 2.0 1.5 0.3 30
4 0.4 2.5 2.0 0.4 40
5 0.5 3.0 2.5 0.5 50
6 0.6 3.5 3.0 0.6 60
7 0.7 4.0 3.5 0.7 70
1.3.4　退火温度的确定　采用 PCR温度梯度模式 ,自动设定温度 40-56 ℃,生成的温度梯度为 40.0、
41.5、42.9、44.4、45.8、47.3、48.7、50.2、51.6、53.1、54.5、56.0 ℃。其余 PCR扩增程序同 1.3.2,以确定最合
适的退火温度。
1.3.5　ISSR反应体系稳定性检测　随机选择 ISSR引物对 5份福建含笑种质材料进行 DNA扩增 ,对筛选
出的最佳体系进行稳定性检测 。
2　结果与分析
2.1　dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
dNTPs是 ISSR-PCR反应的原料底物 ,对扩增条带影响很大 ,底物浓度太低 ,扩增产物不完全 ,底物浓
度太高 ,又会出现非特异性扩增 ,此外 ,过量的引物浓度还会导致引物二聚体的形成 [ 13] 。首先根据原初反
应条件进行引物的初筛 ,选择能看到清晰条带的引物 UBC873(gACAgACAgACAgACA)进行 dNTPs浓
度的确定。比较 dNTPs浓度的 7个梯度可知(图 1),当 dNTPs浓度 <0.4 mmol· L-1时 ,条带数量少;当
dNTPs浓度 >0.4mmol·L-1时 ,条带较为模糊;当 dNTPs浓度为 0.4 mmol· L-1时 ,条带最清晰明亮 。因
此 ,最适用于福建含笑 ISSR扩增的 dNTPs浓度为 0.4 mmol· L-1。
·145·　第 2期 黄宇等:福建含笑 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
2.2　Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2 +是 TaqDNA聚合酶的活性剂 ,能够增强酶蛋白的稳定性 , Mg2+不足 ,则 Taq酶的作用效率低 ,明
显地影响 PCR扩增[ 14] 。当 Mg2+浓度 <2.5 mmol· L-1时 ,条带数目较少 ,亮度较弱;当 Mg2+浓度≥2.5
mmol·L-1时 ,条带数目和亮度均增加;当 Mg2+浓度为 2.5 mmol·L-1时 ,条带最清晰且数量最多(图 2)。
因此 ,最适用于福建含笑 ISSR扩增的 Mg2+浓度为 2.5 mmol· L-1。
M为 100bpDNALadder;1-7分别为 0.1、 0.2、0.3、
0.4、 0.5、0.6、0.7mmol· L-1dNTPs。
图 1　dNTPs浓度对福建含笑 ISSR的影响
Figure1　TheefectofdNTPsconcentrationonISSRofM.fujianensis
M为 100bpDNALadder;1-7分别为 1.0、 1.5、2.0、
2.5、 3.0、3.5、4.0mmol· L-1 Mg2+。
图 2　Mg2+浓度对福建含笑 ISSR的影响
Figure2　TheefectofMg2+concentrationonISSRofM.fujianensis
2.3　TaqDNA聚合酶用量对 ISSR扩增的影响
在 ISSR-PCR反应体系中 , TaqDNA聚合酶用量直接影响扩增反应的成功与否 。在 20μL的反应体积
中 ,当 TaqDNA聚合酶用量 <1.5U时 , ISSR扩增的条带较少;用量逐渐增加 ,均可扩增出较多清晰的条带
(图 3)。考虑到样品用量 , TaqDNA聚合酶用量采用 1.5U。
2.4　引物浓度对 ISSR扩增的影响
引物浓度会对 ISSR-PCR的带型产生明显的影响 ,浓度过低不能扩增 ,浓度太高会引起错配 ,导致非
特异性产物的出现[ 15] 。当引物浓度 <0.2μmol· L-1时 ,无扩增条带;引物浓度为 0.2-0.6μmol·L-1时 ,
均可扩增出较多清晰的条带。重复试验结果显示 ,引物浓度为 0.6 μmol· L-1时 ,扩增条带最清晰 、稳定
(图 4)。因此 ,最适用于福建含笑 ISSR-PCR反应的引物浓度为 0.6μmol· L-1。
M为 100bpDNALadder;1-7分别为 0.5、1.0、1.5、 2.0、
2.5、3.0、3.5UTaqDNA聚合酶。
图 3　TaqDNA聚合酶用量对福建含笑 ISSR的影响
Figure3　TheeffectofTaqDNApolymeraseonISSRofM.fujianensis
M为 100bpDNALadder;1-7分别为 0.1、0.2、0.3、 0.4、
0.5、 0.6、0.7μmol· L-1引物。
图 4　引物浓度对福建含笑 ISSR的影响
Figure4　TheefectofprimerconcentrationonISSRofM.fujianensis
2.5　模板 DNA用量对 ISSR扩增的影响
PCR反应中对模板 DNA用量要求的范围通常较宽 ,但最佳的 DNA模板用量取决于研究的物种 、类群
以及 DNA模板纯度。当模板 DNA用量 <30 ng时 ,条带较模糊;当模板 DNA用量≥30 ng时 ,可扩增出较
多清晰的条带 ,其中当模板 DNA用量为 30ng时 ,条带最清晰且数量最多(图 5)。因此 ,最适用于福建含
笑模板 DNA的用量为 30 ng。
2.6　退火温度对 ISSR扩增的影响
引物的退火温度极大地影响着 ISSR反应的进行 ,随引物的不同 ,退火温度也会不一样 ,因而确定一个
·146· 福　建　林　学　院　学　报 第 29卷　
合适的退火温度非常必要 [ 16] 。本试验从 40.0-56.0℃共 16 ℃的温度梯度里 ,研究了不同的退火温度对
ISSR扩增的影响(图 6)。结果表明 ,当退火温度为 40.0-44.4 ℃时 ,条带亮度较弱;当退火温度从 45.8
℃升高至 56.0 ℃时 ,条带逐渐变亮 ,其中温度升至 47.3℃时 ,条带最清晰且数量最多。因此 ,最适用于福
建含笑 ISSR扩增的退火温度为 47.3℃。
M为 100bpDNALadder;1-7分别为 10、
20、 30、40、50、60、 70ng模板 DNA。
图 5　模板 DNA用量对福建含笑 ISSR的影响
Figure5　TheefectoftemplateDNAdosageonISSRofM.fujianensis
M为 100bpDNALadder;1-12分别为 40.0、41.5、42.9、 44.4、
45.8、 47.3、 48.7、50.2、 51.6、53.1、54.5、 56.0 ℃退火温度。
图 6　退火温度对福建含笑 ISSR的影响
Figure6　TheeffectofannealingtemperatureonISSRofM.fujianensis
2.7　ISSR反应体系稳定性检测
随机选择引物 UBC827(ACACACACACACACACg)和 UBC868(gAAgAAgAAgAAgAAgAA)对 5
份福建含笑种质进行扩增 ,以检测所确立的 ISSR反应体系的稳定性(图 7、图 8)。结果表明 ,所选引物可
在 5份福建含笑种质上扩增出清晰 、重复性好的条带 ,证明本试验所建立的体系稳定可靠 ,可用于福建含
笑品种的分子鉴别和遗传多样性分析 。
M为 100bpDNALadder;1-5为 5份不同的福建含笑种质。
图 7　引物 UBC827对 5份种质的扩增结果
Figure7　TherusultofamplificationofprimerUBC827
onfivevarietiesofM.fujianensis
M为 100bpDNALadder;1-5为 5份不同的福建含笑种质。
图 8　引物 UBC868对 5份种质的扩增结果
Figure8　TherusultofamplificationofprimerUBC868
onfivevarietiesofM.fujianensis
3　结论与讨论
影响 ISSR结果的因素很多 ,为了利用这一分子标记进行遗传多样性分析 ,获得重复性和可靠性较高
的 ISSR条带 ,提高分析的准确性 ,有必要对其影响因子进行优化 ,筛选出最适宜的 ISSR条件 [ 17] 。福建含
笑 ISSR-PCR分析较适宜的扩增条件:20 μLPCR反应体积 , 0.4 mmol·L-1dNTPs, 2.5 mmol· L-1 Mg2+ ,
1.5 UTaqDNA聚合酶 , 0.6μmol· μL-1引物 , 30 ng模板 DNA。 PCR扩增程序:94 ℃预变性 2 min, 94℃
变性 30 s, 47.3 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 min, 45个循环 , 72 ℃延伸 7 min, 4℃保存 。经过反复试验 ,在此
优化条件下可以获得重复 、稳定的 ISSR扩增结果 ,为进一步分析珍稀濒危植物福建含笑的遗传多样性奠
定了良好的试验基础 。邱英雄等 [ 18]对 6种类型乐昌含笑进行 ISSR-PCR分析 ,得出在 DNA水平出现了一
定程度的遗传分化 ,这一结论与本试验的稳定性检测结果较一致。
ISSR-PCR只有在各种扩增参数固定的条件下才表现出较高的稳定性 ,因此 ,对各种影响因子进行筛
选和优化是应用 ISSR技术的前提 ,其扩增条带虽较 RAPD标记稳定 ,但是也受反应条件变化以及物种不
同的影响[ 15] 。该技术操作过程简单 ,快捷 ,但有 3点值得注意:一要保证模板 DNA的质量;二是对于不同
·147·　第 2期 黄宇等:福建含笑 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
的引物的退火温度应根据引物的 Tm值略有变动;三是 ISSR扩增的带型背景较强 ,应在 PCR反应体系中
增加一些化学物质 ,使背景颜色减弱 ,条带清晰 。
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(责任编辑:江　英)　　
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