全 文 ：文章编号:　1001-4675(2009)03-0401-05
刺山柑(Capparisspinosa)总 RNA
不同提取方法的比较＊
栾东东 1 , 　石庆华2 , 　陈　虹 1 , 　董玉芝1, 2
(1.新疆农业大学林学院 , 新疆 乌鲁木齐　830052;2.新疆农业大学 农业生物技术重点实验室 ,新疆 乌鲁木齐　830052)
摘　要:以野生刺山柑叶片为材料 ,采用 70%丙酮抽提研磨材料 , 结合 TRIZOL, CTAB, SDS3种常见的 RNA提取
方法提取总 RNA, 通过 RNA获得率 、纯度 、电泳图谱以及 RT-PCR反应等分析 ,初步确立了一种有效的提取刺山
柑叶片总 RNA的改良 SDS法。该方法提取的 RNAA260 /A280值在 1.88 ～ 1.94之间 , 电泳图谱完整 ,具有产量高 、时
间短 、成本低等特点 ,所得的 RNA可以用于 RT-PCR和 cDNA文库构建以及 Northern杂交等后续实验。
关键词:刺山柑 Capparisspinosa;RNA提取;CTAB法;SDS法;TRIZOL法;RT-PCR反应
中图分类号:Q78　　文献标识码:A
　　刺山柑(Capparisspinosa)又称老鼠瓜 、野西瓜 、
抗旱草等 ,广泛分布于新疆吐鲁番 、乌鲁木齐及其周
边地区 , 是干旱 、半干旱地区极具栽培价值的灌
木 〔1〕。它抗旱 、耐高温 、耐风蚀 、耐瘠薄 , 对干旱环
境有很强的适应性。刺山柑可以生长在几乎常年不
下雨 、气温高达 47℃以上 、地面温度达 70℃的砾石
戈壁 ,也可生长在吐鲁番荒漠植物园附近地下水位
10 m的风蚀地上 〔2〕 ,即使在白杨沟的石质山坡上和
火焰山山前砖红色的黏土质贫瘠环境中 ,它的植株
和群落也能呈现出一派生机盎然的景象 。因此 ,刺
山柑是研究植物抗逆性不可多得的材料 ,也可作为
抗逆基因的供体 ,为育种工作提供优良抗逆基因资
源 。此外 ,刺山柑药用价值很高 〔3-6〕 ,在新疆维吾尔
自治区 ,它很早便作为一种民族医药而被广泛应用 ,
其果实 、根 、叶均可入药 ,具有抗菌 、抗毒 、保肝 、抗
炎 、治疗风湿 、降低血糖等功效 。国外科学家已对其
药理进行了研究 ,并对其部分药用成分进行了分离
与鉴定 〔7-11〕。
RNA提取是分子生物学研究的一项基础实验 ,
高质量的 RNA是进行基因体外翻译 、反转录 PCR,
Northern杂交 、cDNA文库构建 、cDNA末端快速扩增
等研究的前提。由于刺山柑生长在极端干旱 、炎热
的环境中 ,使其体内积累了大量的次生代谢物质和
药用成分〔12-14〕 ,如黄酮类 、糖苷化合物 、挥发油 、生
物碱类以及萜类物质 ,对 RNA的提取产生严重的干
扰 ,不但使提取的 RNA含有大量的杂质 ,而且还容
易造成 RNA的酶解和降解 ,因此 ,使用普通的 RNA
提取方法很难获得纯度较高的刺山柑总 RNA。有
研究表明 〔15-17〕 ,采用丙酮抽提研磨后的植物材料 ,
可有效去除酚类化合物和其他一些杂质。因此 ,笔
者使用 70%丙酮来抽提研磨材料 ,并比较了 3种常
见的植物 RNA提取方法:TRIZOL, CTAB, SDS〔18〕
法 ,初步探索出一种提取高质量的刺山柑叶片总
RNA的改良 SDS法 ,为今后利用该物种的抗逆基因
资源 ,以及在分子领域对其药用成分和药理研究奠
定良好的基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
刺山柑叶片采集于乌鲁木齐市雅玛里克山 ,采
集后立即置于液氮中速冻 ,带回实验室后于 -40 ℃
保存 。
所需试剂:SDS提取液 (2%SDS, 0.125M四硼
酸钠 ,硼酸调 pH=8.5)、CTAB提取液(2%CTAB,
0.1MTris-硼酸 , 1.4MNaCl,硼酸调 pH=7.5, Tris
-硼酸待灭菌后加入)、4MLiCl, 3MNaAc(以上试
剂均使用 0.1%DEPC37 ℃过夜处理)、聚乙烯吡咯
烷酮(PVP)、TRIZOL试剂 、Tris平衡酚(pH=8.0)、
第 26卷　第 3期
2009年 5月 　　　　　　　　　　　　　　　　
干 旱 区 研 究
ARID　ZONE　RESEARCH　　　　　　　　　　　　　　　　
Vol.26　No.3
May　2009
＊ 收稿日期:2007-12-14;　修订日期:2008-04-10
基金项目:国家环保局资助项目 [二 -(一)-3-2号 ]
作者简介:栾东东(1982-),男 ,辽宁沈阳人 ,在读硕士研究生 ,研究方向为植物抗性遗传育种.E-mail:ldd21@ 163.com
通讯作者:董玉芝.E-mail:dyz830052@ 126.com
DOI :10.13866/j.azr.2009.03.004
氯仿 、无水乙醇 、75%乙醇(DEPC处理水配制 ,下
同)、70%丙酮(DEPC处理水配制 ,下同)。所有试
剂中 , Tris,聚乙烯吡咯烷酮(PVP), TRIZOL试剂为
进口 ,其余皆为国产分析纯 。反转录试剂盒 、引物以
及 PCR所需要试剂均购于上海生物工程有限公司 。
1.2　方法
1.2.1　改良 TRIZOL法　①取 0.1 g样品置于液
氮中 ,加 PVP研磨成白色粉末 , 转移到含有 1 mL
70%丙酮的 1.5 mL离心管中轻微震荡 30 s,在 4℃
条件下 , 8 000r/min离心 2min。②弃上清液 ,加入
1 mLTRIZOL试剂剧烈震荡 2min,室温放置 5min,
4 ℃, 10 000 r/min离心 10 min。 ③取上清 ,加入
0.2 mL氯仿 , 震荡混匀 , 室温放置 5 min, 4 ℃,
12 000 r/min离心 10 min。④取上清 ,加入等体积
的异丙醇 ,颠倒混匀 ,室温放置 10 min。 ⑤ 4 ℃,
12 000 r/min离心 10 min,弃上清 ,用 1 mL75%乙
醇 ,洗涤沉淀 2次 ,倒出乙醇 ,室温下风干 ,加入适量
DEPC处理水溶解沉淀 。
1.2.2　改良 CTAB法　①取 0.1 g样品置于液氮
中 ,加 PVP研磨成白色粉末 ,转移到含有 1 mL70%
丙酮的 1.5mL离心管中轻微震荡 30 s, 4 ℃, 8 000
r/min离心 2min。 ②弃上清 ,加入 0.6 mL2×CTAB
缓冲液和 0.1 mLβ -巯基乙醇 ,剧烈震荡 5min, 65
℃水浴 10 min,其间颠倒混匀 2次 。③ 4 ℃, 13 000
r/min离心 10 min。取上清 ,加入等体积的 Tris平
衡酚∶氯仿(1∶1),震荡 2min, 4 ℃, 13 000 r/min离
心 10min。④重复步骤③ 1次。取上清 ,加入等体
积的氯仿 ,震荡 2 min, 4 ℃, 13 000 r/min离心 10
min。 ⑤取上清 ,加入等体积的 4MLiCl, 1 /2体积的
无水乙醇 , -20 ℃沉淀 10 min, 4 ℃, 10 000 r/min
离心 10 min。⑥弃上清 ,用 1 mL75%乙醇洗涤沉
淀 2次 ,倒出乙醇 ,室温下风干 ,加入适量 DEPC处
理水溶解沉淀。
1.2.3　改良 SDS法　①取 0.1 g样品置于液氮
中 ,加 PVP研磨成白色粉末 ,转移到含有 1 mL70%
丙酮的 1.5mL离心管中轻微震荡 30 s, 4 ℃, 8 000
r/min离心 2 min。 ②弃上清 ,加入 0.6 mLSDS提
取液 , 0.1mLβ -巯基乙醇 , 0.35 mLTris平衡酚和
0.35 mL氯仿 , 剧烈震荡 20 min。 ③ 4 ℃, 13 000
r/min离心 10min。取上清 ,加入等体积的 Tris平衡
酚∶氯仿(1∶1),震荡 2min, 4℃, 13 000r/min离心
10 min。 ④取上清 ,加入等体积的氯仿 ,震荡 2min,
4 ℃, 13 000r/min离心 10 min。⑤取上清 ,加入等
体积的 4MLiCl, 1 /2体积的无水乙醇 , -20 ℃沉淀
10min, 4 ℃, 10 000r/min离心 10min。⑥弃上清 ,
用 1 mL75%乙醇洗涤沉淀 2次 ,倒出乙醇 ,室温下
风干 ,加入适量 DEPC处理水溶解沉淀。 ⑦加入
1/10体积的 3MNaAc, 2.5倍体积的无水乙醇 , -20
℃沉淀 10 min, 4 ℃, 12 000 r/min离心 10min。 ⑧
弃上清 ,用 1mL75%乙醇洗涤沉淀 2次 ,倒出乙醇 ,
室温下风干 ,加入适量 DEPC处理水溶解沉淀。
1.2.4　常规方法　以未使用 70%丙酮抽提的常规
TRIZOL, CTAB, SDS法作为对照 ,方法同上 ,分别去
除步骤①,研磨材料后直接加入提取液 ,其余步骤相
同。
1.2.5　RNA纯度检测　取 10 μL提取的 RNA样
品稀释到 1 000 μL, 用紫外分光光度计测定 230
nm, 260 nm和 280 nm处的 OD值 。计算 A260 /A230
与 A260 /A280的比值 ,确定其纯度 ,并按以下公式计算
RNA获得率 。
RNA获得率(μg/g)=A260 ×稀释倍数 ×40×
　　10-3 ×RNA原液体积(μL)/样品质量(g)
1.2.6　RNA完整性检测　取 5 μL各方法提取的
RNA,进行 0.8%非变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA
完整性。
1.2.7　RNA质量检测　将改良的 SDS法提取的刺
山柑总 RNA利用 BBI公司的 MMLV反转录试剂盒
合成第一链 cDNA,反转录过程按照说明书进行。
根据 GeneBank上已收录的刺山柑 25S核糖体 RNA
基因与核酮糖 1, 5 -二磷酸脱氢 /加氧酶基因
(GeneBank登陆号分别为 AF017170和 AY167985)
设计 2对引物:
P25S1:5′ACCCACCAATAGGGAACG3′;
P25S2:5′GCCACTCTGCCACTTACAAT3′;
Prib1:5′CTGCGAATCCCTCCTGC3′;
Prib2:5′TCGACAATAATGAGCCAAACTA3′。
使用这 2对引物与肌动蛋白(actin)基因的引
物:
P1:5′-TG[ C/T] GA[ C/T] AA[ C/T] GGNAC-
NGGNAATGG-3′;
P2:5′-AT[ A/G] TCNAC[ A/G] TC[ A/G] CA
[ C/T] TTCAT[ A/T/G] AT-3′。
分别扩增第一链 cDNA, PCR程序为 94 ℃ 4
min, 94℃ 30s;50℃ 30 s;72℃ 1.5 min;35循环 ,
72 ℃ 10min。
402
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干　旱　区　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　26卷
2　结果与分析
2.1　RNA纯度检测
各种方法提取的 RNA纯度和获得率如表 1所
示 ,经过丙酮抽提 , TRIZOL法提取的 RNA的 A260 /
A280值为 1.72 ～ 1.96,低于标准;SDS法与 CTAB法
所提取的 RNA的 A260 /A280值均在 1.8 ～ 2.0之间 ,
可以满足需要。而未使用丙酮抽提的 3种方法 ,
A260 /A280值明显偏低 ,说明丙酮抽提能有效的去除
杂质 ,使 RNA纯度提高。从获得率来看 , SDS法提
取的 RNA回收率可达 256.9 μg/g,而 TRIZOL法和
CTAB法的 RNA回收率只有 88.3 μg/g和 60.1
μg/g。由此可见 ,改良的 SDS法能有效地去除杂质 ,
获得纯度和含量较高的 RNA。
表 1　RNA样品的纯度和获得率
Tab.1　PuritiesandyieldsofRNAsamples
方法 A260 /A280 A260 /A230 RNA获得率/(μg· g-1)
改良 TRIZOL法 1.72 ～ 1.96 1.78～ 1.94 88.3
改良 CTAB法 2.00 ～ 2.05 2.07～ 2.20 60.1
改良 SDS法 1.88 ～ 1.94 2.00～ 2.01 256.9
TRIZOL法 0.58 ～ 0.77 1.38～ 1.57
CTAB法 1.90 ～ 1.95 2.01～ 2.02
SDS法 1.65 ～ 1.74 1.00～ 1.09
注:每种方法提取 2管样品 ,每管样品测定 3次 ,取平均值
A, B, C分别表示改良TRIZOL, SDS, CTAB法;D, E, F分别表示 TRIZOL, SDS, CTAB法;G表示 RNA提取试剂盒提取
图 1　RNA电泳图
Fig.1　ElectrophoretogramsofRNA
2.2　RNA完整性检测
各种方法提取的 RNA完整性检测见图 1。由
图 1可见 ,样品研磨后经丙酮抽提再进行 RNA提
取 ,所得的 RNA质量均高于未经丙酮抽提的样品 ,
说明丙酮能有效地去除刺山柑叶片的次生代谢物以
及其他一些杂质 , 防止 RNA降解 , 提高所提取的
RNA质量 。从带型上看 , TRIZOL提取的 RNA中
DNA杂质含量较高 ,但小分子量 RNA获得率较高;
SDS法提取的 RNA比较纯净 ,但会丢失一些小分子
量的 RNA;而 CTAB法提取的 RNA杂质较多;一般
的 RNA提取试剂盒也不适用于刺山柑 RNA提取 。
相对而言 ,改良的 SDS法提取的 RNA电泳条带更
为清晰 ,杂质少 。因此 ,改良的 SDS法是提取刺山
柑叶片 RNA的首选方法。
2.3　RNA质量检测
为了进一步证明 SDS法提取 RNA的质量 ,笔
者将 SDS法提取的 RNA进行 RT-PCR,结果如图 2
所示 ,分别得到约 413bp, 444bp和 1 000bp的目的
产物 ,且产物条带清晰。说明所提取的 RNA质量较
好 ,可以用于反转录等后续工作。
M:DL2000DNAMarker;1, 2:肌动蛋白基因片段;3, 4:核酮糖 1,
5-二磷酸脱氢 /加氧酶基因片段;5, 6:25S核糖体 RNA基因片段
图 2　刺山柑叶片总 RNA的 RT-PCR结果
Fig.2　TotalRNART-PCRresultofCapparisspinosaleaves
403
3期　　 　 　　 　　　　　　栾东东等:刺山柑(Capparisspinosa)总 RNA不同提取方法的比较　　　　　　 　　 　　
3　讨 论
干旱是中国西北地区天气气候的显著特征 ,也
是造成西北地区大面积沙漠化的重要原因之一 〔19〕。
在荒漠中 ,由于植物要抵御恶劣环境 ,往往叶退化 、
机械组织发达 、植株表面被附属物 、具有丰富的次生
代谢物质〔20〕 ,尤其是荒漠木本植物 ,其组成成分和
结构特点均不同于草本植物 ,其体内除了含有草本
植物也具有的蛋白质 、多糖等杂质外 ,同时含有更多
的多酚化合物 、木素 、纤维等物质 。在结构上 ,木本
植物具有更为坚硬的细胞壁 ,这些因素决定了木本
植物组织 RNA提取技术上的特殊性 〔21〕。刺山柑作
为一种生长在极端恶劣环境条件下的木本植物 ,其
体内积累了大量的次生代谢物质 ,目前由于没有合
适的方法使其在温室生长 ,因此只能在野外采集样
品 ,这也给刺山柑 RNA提取带来一定的困难。
针对富含多糖 、多酚 、次生代谢物以及其他一些
杂质的植物 ,人们采取了一系列措施来去除杂质 。
但不同植物或同一植物的不同品种往往因种质的差
异 、材料内含物质组分及含量的差异 ,而需要采用不
同的方法。在提取液中加入 β -巯基乙醇和
PVP〔22-23〕 ,可以有效抑制酚类物质的氧化 ,从而去
除一些杂质 ,但对于野外生长的荒漠植物不能彻底
去除。有研究表明〔24〕 ,在提取液中加入高分子量的
PEG可有效去除一些杂质 ,但这种方法适用于大量
提取 ,且增加了实验成本 。目前 , RNA提取的方法
主要是 CTAB法 、SDS法 、TRIZOL法 ,此外 ,还有一
些不常用的方法 ,如异硫氢酸胍法〔25-26〕和 LiCl-尿
素法〔27〕。相对而言 , CTAB法提取时间较长 ,而且需
要 65℃的温浴 ,这一过程很容易造成 RNA的降解;
TRIZOL可获得高产量的 RNA,但结合异丙醇沉淀容
易造成 DNA污染 ,提取后需 DNAse消化才可使用。
改良的 SDS法与传统方法相比 , 70%丙酮可有
效地去除杂质 ,这是提取刺山柑叶片 RNA成败的关
键 。SDS是一种效果很强的阴离子去污剂 ,在震荡
过程中能有效地分离蛋白质与核酸 ,同时用巯基乙
醇 、苯酚 、氯仿共同抑制内源 RNA酶活性。 LiCl能
选择性地沉淀 RNA,防止多糖等生物大分子杂质沉
淀 ,且提取杂质较多 ,是植物样品常用的沉淀方法 。
该方法具有成本低 、时间短 、获得的 RNA产量高 、质
量好等特点 ,是提取刺山柑叶片 RNA的首选方法。
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anditisararespeciesforstudyingplantstressresistance.AnefectivemethodofisolatingtotalRNAfromtheleav-
esofwildCapparisspinosaisdeveloped.RNAisextractedbythemethodsofTrizolregent, CTABandSDSbycom-
biningwith70% acetone.Afterseparatelyanalyzingtherateofyield, purity, quality, electrophoretogramsandRT-
PCRproduction, animprovedefectiveSDSmethodispreliminarydevelopedtoextractthetotalRNAfromCapparis
spinosaleaves.TheA260 /A280 valueofRNAextractedwiththismethodvariesinarangeof1.88 ～ 1.94, andthe
electrophoretogramsareintegrated.ThisRNAextractionmethodischaracterizedbythehighyield, shortduration,
lowcost, etc., andcanbeusedinsomeexperiments, suchasRT-PCR, cDNAlibraryconstructionandnorthern
hybridization.
Keywords:　 Capparisspinosa;RNAextraction;CTAB;SDS;TRIZOL;RT-PCR.
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3期　　 　 　　 　　　　　　栾东东等:刺山柑(Capparisspinosa)总 RNA不同提取方法的比较