全 文 ：收稿日期:2012 － 08 － 20
基金项目:新疆维吾尔自治区科技支撑计划项目(编号:200933123)。
作者简介:刘 冲(1983 －) ，男，助理研究员，主要从事药用植物分子遗
传学研究;E-mail:66949837@ qq． com。
通讯作者:杨伟俊，博士，副研究员，主要从事维吾尔药资源药物研究;
E-mail:liu_chong02@ 163． com。
药用植物刺山柑 ISSR-PCR遗传体系的建立和优化
刘 冲1， 杨 丽1，2， 杨伟俊1， 徐建国1， 廖晶晶1
(1．新疆维吾尔自治区药物研究所 /新疆维吾尔药重点实验室， 乌鲁木齐 830004;
2．新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830054)
摘要:对药用植物刺山柑遗传多样性研究分析，建立了刺山柑 ISSR-PCR稳定的反应体系，利用植物基因组试剂盒提取刺
山柑药材 DNA;根据此引物采用正交实验设计考察影响 PCR 扩增的 4 个主要因素，筛选出最佳反应条件: 25 μL ISSR-
PCR的最佳浓度为 10 × buffer 2． 5 μL、引物 0． 2 μmol /L、模板 40 ng /μL、dNTPs 0． 4 mmol /L、Taq /DNA聚合酶 0． 5 U，利用
梯度筛选获得 U 808 引物最佳退火温度。为利用这一分子标记对药用植物刺山柑进行遗传多样性分析奠定了基础。
关键词: 刺山柑;ISSR-PCR;正交实验
中图分类号: S 567 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2013)02-0038-04
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction
Systems for Capparis spinosa
LIU Chong1，YANG li1，2，YANG Wei-jun1，XU Jian-guo1，LIAO Jing-jing1
(1． Xinjiang Institute of Materia Medica /Key Laboratory of Xinjiang Uygur Medicine，Urumqi 830004，China;
2． Xinjiang Medical University，Urumqi Xinjiang 830011，China)
Abstract:Genetic diversity of medicinal plants of Capparis spinosa was researched，and ISSR stable reaction
system was established in this study． Plant genomic DNA kit were used for extracting the total DNA of Capparis
spinosa;according to the primers the 4 main factors that can affected the PCR amplification will be studied by
the orthogonal experimental design，the optimal ISSR reaction was carried out in a volume of 25 μL containing
2． 5 μL 10 × buffer，primer 0． 2 μmol /L、template DNA 40 ng /μL，dNTPs 0． 4 mmol /L，Taq DNA polymerase
0． 5 U，obtaining the best annealing temperature of primer U 808 by temperature gradient filter;The ISSR-PCR
experiments has given good foundation for further study of Capparis spinosa．
Key words: Capparis spinosa;ISSR-PCR;orthogonal
刺山柑 Capparis spinosa L． 为山柑科山柑属植物，
又名野西瓜、老鼠瓜等，其味辛、苦，性温，具有祛风除
湿散寒的功效，维吾尔医以其干燥根皮或成熟及未成
熟的果实入药，其疗效显著，用药历史悠久，广泛用于
治疗急慢性风湿性关节炎［1，2〗。国内外对其化学成分
及药理作用研究较多［3 ～ 5］，但迄今还未见有关刺山柑
ISSR分子标记研究。
ISSR技术是基于 PCR的一种分子标记，现已被广
泛应用于遗传多样性［6］、种质资源鉴定［7］、遗传作
图［8］、基因定位［9］等方面的研究。其扩增结果易受
Mg2 +、dNTPs、DNA模板、Taq 酶及引物的影响，同时不
同物种对 ISSR反应条件的要求存在着差异。为了获
得稳定可靠的试验结果，需对反应体系进行优化，本研
究采用正交试验设计，从引物浓度、dNTPs 浓度、模板
DNA浓度、Taq /DNA聚合酶浓度等 4 个主要因素和 4
个水平，对刺山柑 ISSR-PCR 反应体系进行了优化，并
在此基础上对引物退火温度进行梯度筛选，拟建立适
合于刺山柑 ISSR-PCR 的最佳反应体系，为刺山柑药
材遗传多样性分析、种资源保护及药材道地性等深入
研究奠定了技术基础。
1 材料与方法
1． 1 材 料
TC-512 PCR 仪(英国 TECHNE) ;DYCP-31DN 琼
脂糖水平电泳仪(槽) (北京市六一仪器厂) ;DOC 2000
凝胶成像仪(美国 BIO-RAD)。刺山柑药材采自石河
子 135 团的沙漠地区，经鉴定为山柑科山柑属植物刺
·83·
第 32 卷 第 2 期 2013 年 2 月 种 子 (Seed) Vol． 32 No． 2 Feb． 2013
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2013.02.055
山柑干燥果实。植物基因组 DNA 提取试剂盒购于天
根生化科技有限公司;ISSR通用引物采用加拿大哥伦
比亚大学网站公布的序列，由上海生工(Sangon)公司
合成。
1． 2 方 法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取
选取成熟的刺山柑干燥果实，洗去表面杂质，在液
氮中迅速研成粉末，利用植物基因组 DNA提取试剂盒
提取 DNA模板。将所提 DNA 模板稀释后，用紫外分
光光度计测定吸光值 D260 nm、D280 nm，计算 D260 nm /D280 nm
比值，估算样品的纯度，并结合 1． 0%琼脂糖凝胶电泳
的结果，确定其含量和完整性，用无菌双蒸水稀释至
20 ng /μL，－ 20 ℃保存备用。
1． 2． 2 ISSR反应体系中引物的筛选
建立刺山柑 ISSR-PCR 的预反应体系为:10 ×
buffer(含 Mg2 + 2． 5 mmol /L)2． 5 μL、引物 1 μL(10
μmol /L)、DNA模板 2 μL(20 ng /μL)、dNTPs 2 μL(2． 5
mmol /L)、Taq /DNA 聚合酶 1． 5 U，加无菌双蒸水至
25 μL。ISSR-PCR扩增程序为:94 ℃预变性 4 min，94
℃变性 45 s，46 ～ 58 ℃退火 45 S，72 ℃延伸 1 min 30 s，
35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃ 保存。利用此
体系对 ISSR通用引物进行筛选，留下有扩增产物的引
物进行下面的正交实验。
1． 2． 3 ISSR反应体系主要影响因素优化的正交实验
设计
引物通过初步筛选后，选用引物 U 808 (序列为
5＇-3＇AGA GAG AGA GAG AGA GC)为 ISSR-PCR反应
体系的固定引物。此次正交设计参照胡黄连［10］、洋桔
梗［11］、杏［12］、魔芋［13］、川芎［14］、初步确定 DNA 模板、
Primer、dNTPs 、Taq /DNA 聚合酶各 4 个水平。按照
L16(4
5)正交表形成 16 个组合的实验方案(见表 1)。
扩增程序同上。
1． 2． 4 PCR扩增产物检测
PCR扩增产物 2． 5 μL和 2 μL 6 × loading buffer混
匀点样于 1． 5%琼脂糖凝胶中，以 0． 5 × TBE 为电泳
缓冲液在 150 V电压下电泳 30 min进行分离，最后用
凝胶成像系统观察并成像。
1． 2． 5 引物最佳退火温度的筛选
根据正交实验结果，选择合适的反应体系，退火温
度采取梯度 PCR模式，设定温度从 50． 8 ～ 59． 2 ℃自
动生成 12 个温度梯度，选取其中 8 个温度(50． 8、
51． 3、52． 1、53． 8、54． 6、55． 2、57． 2、59． 2 ℃)用于此实
验，确定合适的退火温度。除退火温度不同外，反应程
序均与正交实验的反应程序相同。
表 1 PCR正交实验设计表
编号
因素
DNA模板
ng
引物
(μmol /L)
dNTPs
(mmol /L)
Taq /DNA酶
(U)
1 10 0． 1 0． 1 0． 5
2 10 0． 2 0． 2 1
3 10 0． 4 0． 3 1． 5
4 10 0． 8 0． 4 2
5 20 0． 1 0． 2 2
6 20 0． 2 0． 1 1． 5
7 20 0． 4 0． 4 1
8 20 0． 8 0． 3 0． 5
9 40 0． 1 0． 3 1
10 40 0． 2 0． 4 0． 5
11 40 0． 4 0． 1 2
12 40 0． 8 0． 2 1． 5
13 70 0． 1 0． 4 1． 5
14 70 0． 2 0． 3 2
15 70 0． 4 0． 2 0． 5
16 70 0． 8 0． 1 1
1． 2． 6 ISSR-PCR优化所得的体系验证
根据此优化后的反应体系，对 14 个不同的 DNA
模板进行 PCR扩增，并对其扩增产物进行检测。
2 结果与分析
2． 1 模板浓度对 ISSR扩增的影响
模板 DNA 是影响 ISSR 扩增反应的一个重要因
素，浓度太低，引物与之结合少，扩增条带少且反应稳
定性较差;浓度太高，模板 DNA 分子之间的结合几率
增大，扩增反应同样被抑制。如图 1 所示，模板浓度为
10 ng /μL时(图 1:1 ～ 4 号处理) ，ISSR 扩增条带成弥
散;浓度为 20、40 ng /μL时(图 1:5 ～ 12 号处理) ，扩增
条带较为清晰，背景较弱，反应稳定性增强;模板浓度
增大到 70 ng /μL 时，扩增条带减少。因此确定在
25 μL反应体系中适宜的 DNA模板为 40 ng /μL。
2． 2 引物浓度对 ISSR扩增的影响
引物浓度是 PCR扩增反应的重要参数之一，其浓
度太低不能进行有效扩增，浓度太高会产生引物二聚
体等产物。图 1 所示，当引物浓度为 0． 2 μmol /L 时，
扩增效果较好，扩增条带最多为 6 条(图 1:10 号处
理) ，条带较为清晰;浓度高于 0． 4 μmol /L，扩增条带
缺失和弥散;当浓度低于 0． 1 μmol /L 时，扩增条带相
对少且模糊。因此，确定引物浓度 0． 2 μmol /L 最为
合适。
2． 3 Taq /DNA 聚合酶浓度对 ISSR扩增的影响
Taq酶为 PCR反应中非常重要的因素，其浓度过
高增大研究成本，浓度过低会降低 PCR 产物合成率，
·93·
研究报告 刘 冲 等:药用植物刺山柑 ISSR-PCR遗传体系的建立和优化
反应体系 25 μL 中，Taq DNA 聚合酶单位为 0． 5 ～ 2． 0
U 时，均有扩增产物。但酶单位为 0． 5 ～ 1 U 时，扩增
谱带明亮，且清晰稳定;而酶单位为 2． 0 U 时，虽然扩
增谱带明亮、清晰，但略有拖尾现象(图 1:11 号处
理) ，并且 Taq DNA聚合酶单位过高也增加实验成本，
会导致非特异性的扩增，造成假阳性。因此确定在 25
μL反应体系中适宜的 Taq DNA聚合酶单位为 0． 5 U。
2． 4 dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
dNTP是 PCR扩增反应的原料，其浓度太低，降低
反应产物量［15］;因其可和 Mg2 +结合，浓度太高，会大
大降低游离 Mg2 +浓度，影响扩增反应，在本实验中，当
dNTP 浓度为 0． 1 mmol /L 扩增条带较弱不易辨认
(图 1:1号处理) ;dNTP 浓度逐渐增加时，扩增条带清
晰。当 0． 4 mmol /L为扩增反应浓度时;扩增出的谱带
清晰，数量最多。因此确定在 25 μL 反应体系中适宜
的 dNTP浓度为 0． 4 mmol /L。
注: 1 ～ 16 为正交设计处理的 16 个编号; M为 100 bp DNA Ladder，从
上到下依次为 1 500、1 000、900、800、700、600、500、400、300、200。
图 1 1 ～ 16 为正交实验中的 16 个处理的凝胶电泳图
2． 5 退火温度对 ISSR扩增的影响
根据正交实验结果，选择 10 号处理反应体系对引
物退火温度进行梯度筛选，结果见图 2。引物退火温
度会影响 PCR的扩增效率，并对体系的重复性和稳定
性有一定影响，退火温度太高会降低扩增产率，退火温
度较低又降低模板与引物结合的特异性。退火温度较
低时(50． 8 ～ 52． 1) ，除主带外，杂带较多，条带呈弥散
状;随着退火温度的提高(53． 8 ～ 54． 6) ，引物与模板
的特异性结合增强，杂带减少，条带清晰度提高，背景
减弱;当退火温度升高到一定范围(55． 2 ～ 59． 2)时，
扩增条带较少。适当提高 ISSR 引物的退火温度可提
高反应的稳定性和重复性，故引物 U 808 的退火温度
在此反应体系中可设为 55 ℃。
2． 6 ISSR-PCR优化所得的体系验证
综上所述，药用植物刺山柑 ISSR-PCR 反应体系
为 25 μL，其中 10 × buffer 2． 5 μL、引物 0． 2 μmol /L、模
板 40 ng /μL、dNTPs 0． 4 mmol /L、Taq /DNA聚合酶 0． 5
U。由图 3 可看出，条带的清晰度较好，稳定性高，用
此体系可满足刺山柑的 ISSR分析。
注:左边 1 ～ 8 分别为温度 50． 8、51． 3、52． 1、53． 8、54． 6、55． 2、57． 2、
59． 2 ℃，右侧为 1 次重复。
图 2 引物 U 808 不同退火温度 DNA模板
扩增的凝胶电泳图
注: 1 ～ 14 为刺山柑 DNA 样本 S 1 ～ S 14 编号; M 为 100 bp DNA
Ladder，从上到下依次为 1 500、1 000、900、800、700、600、500、400、
300、200。
图 3 引物 U 808 与 14 个 DNA模板扩增结果的凝胶电泳图
3 讨 论
刺山柑干燥果实中含有丰富的蛋白质、挥发油、纤
维素、糖分等成分，其复杂的化学成分对获得较优质的
可满足 ISSR的总 DNA模板造成一定困难。虽然一般
认为 ISSR技术对模板 DNA 的质量要求较低，但杨传
平在白桦的 ISSR研究发现未经纯化的模板 DNA可扩
增出的谱带数量明显少于纯度高的模板 DNA［16］，因
此，高质量的基因组 DNA 是获得 ISSR 反应重复稳定
结果的前提。本课题组采用植物基因组 DNA 提取试
剂盒对刺山柑药材基因组 DNA 进行提取，所提总
DNA模板较为完整纯净，可以较好运用于后期的 ISSR
分析。
刺山柑药材 ISSR-PCR 25 μL 体系中包含 10 ×
buffer(含 Mg2 + 2． 5 mmol /L)2． 5 μL、引物 0． 2 μmol /L、
模板 40 ng、dNTPs 0． 4 mmol /L、Taq /DNA 聚合酶 0． 5
U。与文献报导的胡黄连、洋桔梗、杏、魔芋、川芎、亮
叶腊梅和杉木的反应体系不同;如刺山柑反应体系中
的 DNA模板、Mg2 +、dNTP 浓度高于胡黄连体系中各
自最佳反应浓度，而其它各因素又低于胡黄连反应体
系中的浓度［16］，由于在刺山柑反应体系中引物与模板
结合特异性较高而底物 dNTP 利用率较低造成;反应
体系中的 DNA模板浓度远低于杉木的反应浓度，其它
因素也相差较大［15］，笔者认为，由于物种亲缘性相隔
较远，其模板 DNA与引物结合的特异性差别导致反应
体系相差较大。由上述实验结果可知，ISSR-PCR体系
的专属性比较强，只有在最佳条件下，才能获得稳定清
·04·
第 32 卷 第 2 期 2013 年 2 月 种 子 (Seed) Vol． 32 No． 2 Feb． 2013
晰的多态性条带。ISSR-PCR反应中对模板 DNA浓度
范围要求通常较宽，但本实验中扩增药用植物刺山柑
对模板 DNA浓度要求较高，模板浓度太低或太高都会
影响扩增结果。通过此次实验发现，微小的实验体系
差别也会对 ISSR 实验结果产生影响，不同物种的
ISSR-PCR的反应体系不同，需要通过适宜的实验方法
建立其本物种适宜的 ISSR-PCR 反应体系。刺山柑分
布较广，来源丰富，使用历史悠久，故有必要对其进行
遗传学研究，本实验为 ISSR分子标记奠定了基础。
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1 － 3．
(上接第 37 页)
在大田生产中，将水花生的地上部残株处理掉，以减轻
水花生茎和叶通过雨水淋溶对草坪草造成的化感抑制
作用。
3． 3 本实验只是进行了简单的室内生物检测，与其实
际生长的土壤条件相差甚远，因此，还需进行大田试验
进一步进行论证此实验结果的可靠性。
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研究报告 刘 冲 等:药用植物刺山柑 ISSR-PCR遗传体系的建立和优化