全 文 ：TROPICAL FORESTRY VOL．40NO．2 Jun．2012
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五唇兰（Phalaenopsis pulcherrima Lindl.）为兰科
（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）多年生草本
植物[1]，属东亚特有种，在中国仅存在于霸王岭、尖
峰岭等西南部山区，野外存在的五唇兰不但生长环
境具有附生岩石与土壤之分，其叶背色也具有红色
和绿色之别[2]。近年来，由于利益的驱使，人类活动
的影响，致使五唇兰的野外生存环境遭受严重的破
坏，其野生资源日益减少。五唇兰花朵美丽，是现在
迷你型蝴蝶兰植物杂交育种的重要亲本 [3-4]，具有
极高的观赏价值与科研价值。通过分子标记手段和
方法研究五唇兰野生资源的遗传多样性及其遗传结
果，对认识五唇兰野生资源的遗传背景及其濒危机
制以及如何对五唇兰进行科学有效的保育具有重要
的意义。获得高质量的基因组DNA是分子遗传研究
五唇兰基因组 DNA提取方法的优化
司更花 1, 2 朱国鹏 1 *
（1. 海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点
实验室，海南海口，570228；
2.海南大学园艺园林学院，海南海口 570228)
摘 要：五唇兰组织内含有大量的酚类、多糖以及此生代谢产物，DNA提取较为困难。为获得高质量的五唇兰基
因组 DNA，文中采用传统十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、常规十二烷基硫酸钠（SDS）法和改进的 CTAB法对五唇
兰基因组 DNA的提取进行比较。结果表明：改进的 CTAB法比传统 CTAB法和常规 SDS法都好，可以得到质量较
好的 DNA，电泳条带清晰，通过紫外分光光度计检测，A260/ A280为 2.0以上。
关键词：五唇兰；基因组 DNA；提取
中图分类号：S682.31 文献标识码：B doi:10.3969/ j.issn.1672- 0938.2012.02.010
Optimization of Extraction of Genomic DNA in Phalaenopsis pulcherrima(Orchidaceae)
Si Genghua1,2，Zhu Guopeng 1
(1. Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources
(Hainan University), Ministry of Education, Haikou, Hainan570228, China;
2. College ofHorticulture andLandscapeArchitecture,HainanUniversity,Haikou, , Hainan 570228, China)
Abstract: Phalaenopsis pulcherrima is rich in polysaccharides, phenol and other secondary metabolites, and
it is difficult to obtain high quality of genomic DNA from it. Based on the research results of comparative
analysis of several extraction methods, such as traditional Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide
(CTAB), traditional Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) and improved CTAB, for total genomic DNA of P. pul-
cherrima. The results indicate that improved CTAB DNA extraction produces DNA of much better quality
than the others, which has higher density, purity and intact genomic DNA by agarose gel electrophoresis.
And by ultraviolet spectrophometry, the ratio of A260/A280 was above 2.0.
Key Words: Phalaenopsis pulcherrima，Genomic DNA，Extraction
基金项目：海南省科技成果示范推广专项项目（CGSF20120001- 02）,林业公益性行业科研专项(201204604).
作者简介：司更花（1983- ），女，硕士，从事兰科植物分子生物学研究，E- mail: sigenghua@126.com
通讯作者：朱国鹏（1971- ），男，副研究员，E- mail: guopengzhu@163.com
致谢：感谢杨琪、胡翔宇、李颖颖、马光磊等对完成文章的帮助。
热带花卉 37
2012 年 6 月 第 40 卷 第 2 期
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的前提。目前，对五唇兰的研究主要集中在组织培养
[5]、育苗繁殖[6-7]、共生菌[4,8]和光合特性[9-10]等方面，
而对五唇兰遗传学方面的研究尚未开展。
五唇兰叶片肉质多汁，表面蜡质化。在五唇兰基
因组DNA提取的预备试验中发现，五唇兰材料容易
褐化，在提取过程中较为黏稠，提取的DNA沉淀成褐
色，说明五唇兰含有较多的色素、多糖以及酚类物
质，这样的DNA作为模板难以保证PCR的顺利扩增。
因此，文中采用传统CTAB法、SDS法对五唇兰的提
取进行比较研究，并在此基础上对传统CTAB法进行
改进，最终得出适合五唇兰基因组DNA提取的改进
CTAB法，为今后五唇兰种质资源学及其种群遗传结
构的研究提供了基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
试验所用样品来自于海南大学儋州校区园艺园
林学院种质资源苗圃。供试材料为两种叶背色植株
（表1），采取植株的第二株新鲜嫩叶用于五唇兰基
因组DNA的提取。
表1 试验材料
1. 2 方法
1.2.1基因组 DNA提取方法
首先，采用传统CTAB法[11]和常规SDS法[12]进行
五唇兰基因组DNA的提取，根据提取结果，对传统的
CTAB法进行改进，具体操作方法如下：（1）在2 mL
的EP管中加入800 L CTAB缓冲液（8.128 g NaCl，
3 g CTAB 粉末，10 mL 1 mol/L 的 Tris-HCl，4 mL
0.5 mol/L的EDTA，用双蒸水定容至100 mL）和20
Lβ-巯基乙醇于65℃水浴锅中预热；（2）称取新鲜
叶片约0.1 g（不多于0.1 g）月适量 PVP-40，加入
液氮迅速研磨，在此过程中加入两次液氮，以使研磨
充分，之后迅速转移到已预热的2 mL EP管中，充分
混匀放入冰上；（3）所有的样品研磨结束后，统一转
移到 65℃水浴锅中水浴 40 min.，期间每隔 10
min. 混匀一次；（4）将水浴好的EP管至于室温5
min.，使其降温之后12000 rpm 离心5 min.；（5）取
上清液（约800 L体积）转移到新的EP管中，加入等
体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分摇匀 10
min.（摇匀的过程很关键，可以去除比较多的杂质），
4℃ 12000rpm离心15 min.；（6）取上清液转移到
新的1.5 mL EP管中，加入等体积的氯仿/异戊醇
（24:1），充分摇匀，于 4℃ 12000rpm 离心 15
min.；（7）取上清液转移到新的1.5 mL EP管中，加
入等体积 -20℃预冷的乙醇和 1/10 体积 3 M 的
NaAc，于 -20℃冰箱中静止 30 min.；（8） 4℃
12000rpm离心15 min.；（9）去除液体，加入1 mL
75%的乙醇，漂洗 20 min.；（10）常温离心，去除液
体，加入1 mL 95%的乙醇，漂洗20 min.；（11）常温
离心，去除液体之后，在超净工作台上吹干后，加
100 L TE溶液溶解，再加入1 L的Rnase，37℃水浴
1 h；（12）于-20℃保存。
1.2.2基因组 DNA质量的检测
取2 L DNA样品用去离子水稀释50倍，紫外分
光光度计检测，根据A260/A280的比值判断基因组
DNA的纯度。
取 5 L DNA 样品在 1%的琼脂糖凝胶电泳上，
120 v恒定电压20 min.，EB（溴化乙锭）染色，检测
DNA。
2 结果与分析
2. 1 DNA浓度的紫外分光检测
常规SDS法所提取的DNA出现褐变现象；传统
CTAB法所提取的DNA为乳白色的沉淀；而改进的
CTAB法所得到的DNA为白色透明的沉淀，没有褐变
的现象，说明改进的CTAB法能有效抑制酚类物质的
氧化。经过紫外分光光度计检测260 nm和280 nm
波长处的光吸收值，得出A260/A280的比值：传统
CTAB 法为 1.67～1.69，, 常规 SDS 法为 1.66～
1.67，改进的CTAB法为2.00～2.01。其中，改进的
CTAB法所提取DNA的A260/A280比值在2.0以上，
说明其得到的基因组DNA没有蛋白质的污染，纯度
较高。而传统CTAB法和常规SDS法所得到的DNA的
A260/A280比值在1.70以下，说明两种方法去除蛋
白质的效果比改进的CTAB法差。因此，采用改进的
CTAB法利于今后的五唇兰分子方面的研究。
2. 2 DNA质量的琼脂糖凝胶电泳检测
图1可以看出，3种方法提取的五唇兰基因组
DNA 均可以在琼脂糖凝胶上呈现无弥散扩散的条
带，但常规SDS法所得到的DNA量较少，条带最为黯
淡；传统CTAB法得到的基因组DNA条带稍微明亮；
Table 1 The sources of materials
编号
Number
1
2
样品
Sample
五唇兰
五唇兰
信息
Information
叶背色为红色
叶背色为绿色
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在原传统CTAB法基础上改进的方法所提取基因组
DNA的质量最好（图1）。
M: DL2000 Marker; A: 改进的 CTAB法; B:传统 CTAB
法; C:常规 SDS法; 1:叶背色为红色五唇兰样品; 2:叶背色
为绿色五唇兰样品
图 1不同 DNA提取方法的电泳图
Fig. 1 Electrophoresis for different DNA extraction
3 讨论
获得高质量的基因组DNA是分子遗传学研究的
基础。兰科植物组织细胞中所含有的大量酚类、多糖
等次生代谢产物[13]，给其基因组DNA的提取带来困
难。酚类物质容易氧化，氧化后与DNA形成共价结合
导致DNA褐变降解，引起DNA的丢失；而多糖类物质
容易与 DNA 产生沉淀的现象，导致 DNA 样品的
流失[14]。该试验中，采用传统的CTAB法和常规的
SDS法均具有一定程度的DNA样品褐变情况，因此，
采用改进的CTAB法，再磨样的过程中加入PVP-40，
能够有效地防止酚类氧化，避免溶液褐变[15]；另外
PVP不但可以防止DNA降解，还可以使多糖的去除
变得简单和容易。同时，在改进的CTAB法中，把预热
的CTAB直接加入到磨好的样品中，这样降低了DNA
样品在空气中的暴露时间，从而降低其褐化的程度。
另外，在改进的CTAB法中，还加入了浓度较高的
β-巯基乙醇，同样可以抑制叶片中酚类物质的氧
化[16]。
该研究的试验经验表明，磨样的过程是相当重
要关键的一步，要迅速研磨，以降低样品在空气中暴
露的时间，避免DNA褐变降解。在无水乙醇沉淀基因
组DNA是，要采用30min.的短时间沉淀法，这样既
可以充分沉淀，又可以不会因为时间过程而导致过
多有机物的共沉淀现象。酚/氯仿/异戊醇抽提的
过程中，要充分摇匀，这样可以增加缓冲液与杂质的
接触面积，使其抽提完全。
洪付祥等 [17]在经过加入PVP和β-巯基乙醇
后，可以得到较高质量的鹤望兰基因组DNA；同样，
关萍等[18]对含有较多酚类的兰科植物天麻基因组的
提取中加入还原剂β-巯基乙醇和PVP来抑制酚类
物质的氧化，达到了较好的效果；与研究中加入
PVP-40 和β- 巯基乙醇来提高五唇兰基因组 DNA
质量的结果是一致的。黄文坤等[19]在对紫茎泽兰基
因组DNA的提取中，通过降低DNA沉淀的时间、减少
DNA样品在空气中的暴露时间，可以得到较好质量
的DNA，与该研究基本一致。改进的CTAB法可以得
到高质量的基因组DNA样品，所得到的DNA成白色
絮状沉淀，可以满足分子标记的需要，为五唇兰分子
遗传学的研究打下了基础。
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