全 文 ：北方园艺２０１４（０５）：９１～９５ ·生物技术·
第一作者简介：罗江（１９８７－），男，硕士研究生，研究方向为植物基
因工程。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｏｊｉａｎｇ１７＠１２６．ｃｏｍ．
责任作者：马春晖（１９６６－），男，博士，教授，研究方向为饲草生产与
加工。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｕｎｈｕｉｍａ＠１２６．ｃｏｍ．
基金项目：国家“十二五”科技支撑计划资助项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０５－
２）；国家牧草产业技术体系资助项目（ＣＡＲＳ－３５）。
收稿日期：２０１３－１１－１３
刺山柑总ＲＮＡ提取方法的比较研究
罗 　 江１，杨 丽 娟１，崔 浩 然１，马 春 晖２，３
（１．塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔８４３３００；２．新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔８４３３００；
３．石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子８３２０００）
　　摘　要：以刺山柑为试材，研究比较了改良ＳＤＳ提取法、ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法、
ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法和ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法提取总ＲＮＡ的效果，以期寻找一种适于
野生刺山柑叶片高质量总ＲＮＡ最佳提取方法。结果表明：４种方法提取的总ＲＮＡ均可见２８Ｓ
和１８Ｓ２条电泳谱带，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法获得的ＲＮＡ图谱条带清晰、明亮、稳定，２８Ｓ
ｒＲＮＡ亮度约是１８ＳｒＲＮＡ的２倍，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０为２．００，产率为１７５．３μｇ／ｇ，除ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ
Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法能够从叶片中提取到完整性好、纯度高及产率高的总ＲＮＡ外，其它３种方法提取的
总ＲＮＡ均存在降解及ＤＮＡ和蛋白等污染，经ｃＤＮＡ－ＳＲＡＰ分析检测，此方法获得的ＲＮＡ反转
录后能扩增出清晰稳定的多态性条带，能够满足后续试验的要求。进一步采用ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ
Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法从刺山柑幼苗整株、根、茎及叶中能够获得高质量的总ＲＮＡ，因此，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ
Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法适合刺山柑总ＲＮＡ的提取。
关键词：刺山柑；ＲＮＡ提取；方法比较；验证
中图分类号：Ｒ　２８２．７１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１４）０５－００９１－０５
　　刺山柑（Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．）属白花菜科（Ｃａｐ－
ｐａｒａｃｅａｅ）山柑属（Ｃａｐｐａｒｉｓ）多年生藤本小半灌木，又名
老鼠瓜、野西瓜，主要分布在我国新疆、甘肃、西藏等省
区，喜生于荒漠地带的戈壁、沙地、低山和山麓地带，荒
地也有生长［１］。它极耐干旱、耐高温、耐风蚀、耐贫瘠，其
根系发达、根深粗壮且维管系统发达，有的根垂直向下
可延伸达３０～４０ｍ，同时其叶片气孔整天开放能够很快
的散热，可正常生长于几乎常年不下雨、夏季气温高达
４５℃以上、地面温度高逾７０℃的砾石戈壁，也可生长在
地下水位１０ｍ左右的风蚀地上［２－４］。因此，刺柑是研究
植物耐旱、耐高温不可多得的材料。为深入研究刺山柑
耐旱及耐高温机理，克隆耐旱及耐高温相关基因，提取
纯度、产率高和完整性好的高质量ＲＮＡ至关重要。刺
山柑生长在极端干旱、高温的恶劣环境中，其体内积累
了大量的药用成分和次生代谢物质［５－７］，如挥发油、生物
碱类、黄酮类等物质，对ＲＮＡ分离纯化产生严重的干
扰，且易造成ＲＮＡ降解。目前，栾东东等［８］报道有关刺
山柑总ＲＮＡ提取方法的研究，课题组应用已报道的刺
山柑总ＲＮＡ提取方法抽提，均未取得理想效果。该研
究比较了４种提取刺山柑叶片总ＲＮＡ的方法，以期筛
选出提取高质量总ＲＮＡ的方法，为开展刺山柑后续耐
旱耐高温基因克隆、ｃＤＮＡ文库构建及ｃＤＮＡ－ＳＲＡＰ筛
选差异基因等研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料为２０１２年９月底采集新疆和静县巴仑台
镇（北纬４２°２５′４８．７″，东经８６°１５′０１．７″，海拔１　３１５ｍ）刺
山柑的叶片及成熟种子，幼嫩叶片采集后立即置于液氮
中速冻，带回实验室后于－８０℃保存，种子经清洗自然
晾干后，储藏于干燥通风处备用。
选用３种商品化ＲＮＡ提取试剂：复杂植物总ＲＮＡ
提取试剂ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣＷ０５３７）购自康
为世纪生物科技公司；植物总ＲＮＡ提取试剂ＲＮＡｐｌａｎｔ
Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＰ４３７）和植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒
ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ（ＤＰ４３２）购自天根生化科技公
司。所用试剂中，ＳＤＳ、ＰＶＰ和Ｔｒｉｓ　ｂａｓｅ为Ｓｉｇｍａ产品，
Ａｇａｒｏｓｅ为西班牙分装产品，其余均为国产分析纯。所
有试剂均用高温高压过的０．０１％ＤＥＰＣ水配制，塑料制
品用０．１％ＤＥＰＣ水浸泡过夜后高温高压灭菌、烘干，玻
璃器皿及研钵于１８０℃烘烤１２ｈ以上备用。
１９
·生物技术· 北方园艺２０１４（０５）：９１～９５
１．２　试验方法
试验设４种方法，改良ＳＤＳ法：参照栾东东等［８］的
方法，ＳＤＳ提取液（２％ＳＤＳ，０．１２５Ｍ四硼酸钠，硼酸调
ｐＨ＝８．５）；ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法：根据康为世
纪生物科技公司提供的说明书中的方法进行试验；
ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法：根据天根生化科技公司提供
的说明书中的方法进行试验；ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ
法：根据天根生化科技公司提供的说明书中的方法进行
试验。
１．２．１　ＲＮＡ完整性检测　取５μＬ提取的总ＲＮＡ，用
１．０％非变性琼脂糖凝胶进行电泳检测ＲＮＡ完整性，紫
外凝胶成像系统观察并拍照记录。
１．２．２　ＲＮＡ纯度检测　取１μＬ提取的总ＲＮＡ，用
ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００／２０００Ｃ微量紫外分光光度计检测ＲＮＡ
的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０值及浓度；计算ＲＮＡ产率：
ＲＮＡ浓度（μｇ／μＬ）×稀释体积（μＬ）／样品质量（ｇ）。
１．２．３　ｃＤＮＡ－ＳＲＡＰ分析检测　以提取的质量较好的
刺山柑叶片的总ＲＮＡ为模板，按照ＴＩＡＮｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｋｉｔ
ｃＤＮＡ（ＫＲ１０４－０２）第一链合成试剂盒操作步骤，将ＲＮＡ
反转录合成第一链ｃＤＮＡ。选用２００１年Ｌｉ等［９］在芸薹
属作物研究中报道的ＳＲＡＰ通用引物（上游引物 Ｍｅ１：
ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＡ，Ｍｅ２：ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣ－
ＣＧＧＡＧＣ，Ｍｅ３：ＴＧＡＧＴＣＣＡＡ　ＡＣＣＧＧＡＡＴ；下游引物
Ｅｍ１：ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴ ，Ｅｍ２：ＧＡＣＴＧＣＧ－
ＴＡＣＧＡＡＴＴＴ　ＧＣ，Ｅｍ３：ＧＡＣＴＧ　ＣＧＴＡＣＧＡＡＴＴ－
ＧＡＣ）。ＳＲＡＰ反应体系建立：总体积２５μＬ，模板ｃＤＮＡ
４０ｎｇ、ｄＮＴＰｓ　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．７５Ｕ、引
物０．２μｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ
２＋１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ。ＳＲＡＰ反应程序：
９４℃预变性４ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，３５℃复性１ｍｉｎ，７２℃
延伸３０ｓ，共５个循环；８４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，
７２℃延伸４５ｓ，共３５个循环；循环结束后，７２℃延伸７ｍｉｎ，
４℃停止反应。扩增产物用８％的变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳检测，银染显影，拍照记录。
１．２．４　刺山柑幼苗不同组织总ＲＮＡ的提取效果　为
进一步验证优选出的天根ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法是
否也适于刺山柑幼苗不同组织总ＲＮＡ的提取，利用该
方法分别提取刺山柑幼苗整株、根、茎、叶的总ＲＮＡ，并
进行纯度及完整性检测。
２　结果与分析
２．１　４种方法提取总ＲＮＡ完整性比较
４种方法从刺山柑叶片中提取的总ＲＮＡ完整性检
测见图１。４种方法提取的总ＲＮＡ均可见２８Ｓ和１８Ｓ
２条电泳谱带，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法提取的总
ＲＮＡ明显优于其它３种方法，其条带清晰明亮、稳定，且
２８Ｓ亮度约为１８Ｓ的２倍，表明该方法提取的总ＲＮＡ
完整性好，质量较高。改良ＳＤＳ法提取的总ＲＮＡ图
谱亮度较弱，获得率较低，有明显的蛋白和ＤＮＡ污染；
ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法图谱模糊、明显拖带，有
明显的ＲＮＡ降解现象，并且有明显蛋白和ＤＮＡ污染；
ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法图谱较为清晰，但略微弥散、
存在蛋白和多糖等污染。
图１　４种方法提取总ＲＮＡ完整性检测
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｔｅｓｔｉｎｇ
２．２　４种方法提取总ＲＮＡ纯度和产率比较
高纯度ＲＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值应介于１．８～２．１之
间，比值小于１．８时表明有蛋白质等有机杂质污染，大于
２．２时表明ＲＮＡ已发生降解；而 ＯＤ２６０／ＯＤ２３０值大于
２．０，表明去除多糖及无机盐等杂质效果较好［１０］。４种
方法提取总ＲＮＡ的纯度、浓度、产率及试验消耗时间见
表１。从纯度角度看，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法和
ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法提取的总ＲＮＡ　ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
值介于１．８～２．１之间，表明所提取的总ＲＮＡ无ＤＮＡ、
蛋白质等杂质污染；改良ＳＤＳ法和ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ
Ｒｅａｇｅｎｔ法提取的ＲＮＡ　ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值不在１．８～２．１之
间，表明残存ＤＮＡ、蛋白质等杂质或ＲＮＡ发生降解；
４种方法所提取的ＲＮＡ　ＯＤ２６０／ＯＤ２３０值介于１．７～２．０
之间，表明残存多糖及低浓度无机盐等杂质。从产率角
度看，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法获得总ＲＮＡ的产率是
其它３种方法的２～３倍，产率为１７５．３μｇ／ｇ。从试验耗
时角度看，改良ＳＤＳ法耗时最长，为５～６ｈ；ＲＮＡｐｕｒｅ
Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法和ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法耗时
最短，为２～３ｈ；ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法适中，为３～
４ｈ。　
２９
北方园艺２０１４（０５）：９１～９５ ·生物技术·
　　表１　 ４种方法提取总ＲＮＡ纯度和产率比较
　　Ｔａｂｌｅ　１ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｕｒ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
ＲＮＡ提取方法
Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｓｏｌａｒｅｄ
ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ ＯＤ２６０／ＯＤ２３０
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／ｎｇ·μＬ－１
产率
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ／μｇ·ｇ－１
试验耗时
Ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒｉａｌ／ｈ
改良ＳＤＳ法 １．７０　 １．９３　 １２４．４　 ６２．２　 ５～６
ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法 ２．３０　 １．８０　 １１９．２　 ５９．６　 ２～３
ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法 １．８８　 １．７４　 １９５．８　 ９７．９　 ２～３
ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法 ２．００　 １．９１　 １７５．３　 １７５．３　 ３～４
２．３　ｃＤＮＡ－ＳＲＡＰ分析检测
为进一步验证ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法提取的总
ＲＮＡ质量，将刺山柑叶片的总ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ
后，经ＳＲＡＰ－ＰＣＲ获得了多样性丰富、清晰及稳定的扩
增条带（图２）。表明ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法提取的
总ＲＮＡ质量较好，经反转录的ｃＤＮＡ样品，可用于基因
的克隆、表达等下游分子生物学研究。
图２　刺山柑叶片总ＲＮＡ　ｃＤＮＡ－ＳＲＡＰ结果
注：１，２：Ｍｅ１和Ｅｍ１；３，４：Ｍｅ２和Ｅｍ２；５，６：Ｍｅ３和Ｅｍ３。
Ｆｉｇ．３　ｃＤＮＡ－ＳＲＡＰ　ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ
Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ
Ｎｏｔｅ：１，２：Ｍｅ１ａｎｄ　Ｅｍ１；３，４：Ｍｅ２ａｎｄ　Ｅｍ２；５，６：Ｍｅ３ａｎｄ　Ｅｍ３．
２．４　刺山柑不同组织ＲＮＡ提取效果的验证
利用优选出的ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法提取刺山
柑幼苗整株、根、茎及叶不同组织的总ＲＮＡ，检测结果
显示，所得的总ＲＮＡ电泳图谱条带清晰明亮、无杂质，
且２８Ｓ亮度约为１８Ｓ的２倍，且ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值均满足
１．８～２．２，说明该方法提取总ＲＮＡ的完整性好、纯度及
质量较高，适于刺山柑幼苗不同组织总ＲＮＡ的提取（图
３，表２）。刺山柑幼苗不同组织总ＲＮＡ的产率存在差
异，大小顺序依次为整株、叶片、茎及根，表明不同组织
ＲＮＡ的表达量不同。
３　讨论与结论
总ＲＮＡ提取质量的好坏是基因克隆、表达及功能
等分子生物学研究的基础，直接影响到后续ｃＤＮＡ的合
成、ＳＲＡＰ－ＰＣＲ及 ＲＮＡ－Ｓｅｑ等试验的开展。高质量
ＲＮＡ提取的关键在于防止ＲＮａｓｅ内外源性污染和去除
　　　　
图３　刺山柑不同组织总ＲＮＡ提取
注：１：整株的ＲＮＡ；２：根的ＲＮＡ；３：茎的ＲＮＡ；４：叶的ＲＮＡ。
Ｆｉｇ．３　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ
ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ
Ｎｏｔｅ：１：Ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｏｆ　ＲＮＡ；２：Ｒｏｏｔ　ｏｆ　ＲＮＡ；３：Ｓｔｅｍ　ｏｆ　ＲＮＡ；４：
Ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　ＲＮＡ．
　　表２ ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法
提取不同组织总ＲＮＡ纯度和产率比较
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ
ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ＲＮＡ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
组织部位
Ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓｉｔｅ
ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ ＯＤ２６０／ＯＤ２３０
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／μｇ·μＬ－１
产率
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
／μｇ·ｇ－１
整株 Ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ　 ２．０２　 １．９６　 １８０．２　 １８０．２
根Ｒｏｏｔ　 ２．１３　 １．１９　 ３２．０　 ３２．０
茎Ｓｔｅｍ　 ２．０５　 １．３４　 ４１．５　 ４１．５
叶片Ｌｅａｖｅｓ　 ２．０２　 １．９８　 １７７．７　 １７７．７
蛋白质、多糖多酚及次生代谢物等杂质干扰［１１］。刺山柑
作为一种生长在极端恶劣环境下的多年生旱生荒漠植
物，其体内除含蛋白质、多糖多酚等外，还积累了大量的
次生代谢物，如生物碱类、糖苷及黄酮类等物质［１２－１４］。
因ＲＮａｓｅ和多酚氧化酶亦属于蛋白质，要获得高质量的
ＲＮＡ就必须去除蛋白；多糖易与ＲＮＡ共沉淀形成难溶
胶状物，而难以分离提取［１５］；酚类化合物易被氧化，可与
蛋白质、ＲＮＡ等不可逆结合，导致ＲＮＡ降解及失活，且
在去除中往往会导致ＲＮＡ产量损失［１６］；次级代谢物易
与ＲＮＡ结合，阻碍ＲＮＡ的分离［１７］，这些都增加了刺山
柑ＲＮＡ提取的难度。
目前，去除蛋白主要有２种方法：１种是加入蛋白变
性剂，如ＳＤＳ、苯酚和异硫氰酸胍等；另１种是加入蛋白
酶Ｋ降解蛋白，再用苯酚／氯仿去除残存蛋白。去除多
３９
·生物技术· 北方园艺２０１４（０５）：９１～９５
糖主要有高盐法、乙醇沉淀法和醋酸钠沉淀法。抑制酚
类被氧化主要有２种方法：１种是还原剂法，如加入β?巯
基乙醇等；另１种是螯合剂法，如加入ＰＶＰ等。ＲＮＡ常
用提取的方法是ＣＡＴＢ法、ＳＤＳ法、ＴＲＩＺＯＬ法、商品化
ＴＲＩＺＯＬ试剂法和试剂盒法。该研究采用的４种方法均
可抽提出ＲＮＡ，但质量差别很大，这与各方法所用试剂
本身的差异有关［１８］。在改良ＳＤＳ法中，液氮研磨中加
入了可溶性ＰＶＰ来防止酚类物质被氧化，７０％丙酮抽
提来去除酚类物质等杂质［１９］，并用２％ＳＤＳ和β?巯基
乙醇变使蛋白变性及抑制ＲＮａｓｅ活性，经多次Ｔｒｉｓ平
衡酚／氯仿抽提除去蛋白、多糖等后，最后用ＮａＡＣ和
乙醇沉淀ＲＮＡ，但该试验获得的ＲＮＡ质量较差，产率
较低，与前人结果不一致［８］。在ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ
Ｒｅａｇｅｎｔ法和 ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法中，抽提试剂
Ｔｒｉｚｏｌ（主要成分是苯酚）均按４∶１体积比加入β?巯基乙
醇，从而使蛋白变性及抑制ＲＮａｓｅ活性，同时β?巯基乙
醇可防止酚类物质的氧化，并用５ＭＮａＣｌ、氯仿及异丙醇
去除蛋白、多糖等杂质，但该试验２种方法获得的ＲＮＡ质
量相差很大，ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法获得的ＲＮＡ
质量最差，产率最低，而ＲＮＡｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ法质量较
好，产率较高。ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法采用了高效、专
一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，其中裂解液
ＲＬ主要成分是异硫氰酸胍，使用前按１００∶１体积比加入
β?巯基乙醇，可有效裂解核蛋白促使蛋白变性及抑制
ＲＮａｓｅ活性，并使用ＤＮａｓｅ　Ｉ、去蛋白液ＲＷ　Ｉ、漂洗液ＲＷ
通过滤柱ＣＳ和吸附柱ＣＲ３相结合可有效去除ＤＮＡ、蛋
白和多糖等杂质，获得了高质量和高产率的总ＲＮＡ。
不同植物不同组织或同一植物不同组织，由于组成
成分及结构上差异，如多糖多酚含量、次生代谢物种类、
木质化程度及细胞壁厚度等，往往需要采用不同的方法
来提取植物ＲＮＡ［２０］。为了检验ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ
Ｋｉｔ法对刺山柑不同组织部位ＲＮＡ的提取效果，利用该
法分别提取了刺山柑幼苗整株、根、茎及叶的ＲＮＡ，经检
测，表明提取效果很好，但各组织条带的亮度差异很大，
这很可能是不同组织表达量差异照成的，也表明叶片是
刺山柑总ＲＮＡ提取的最佳组织部位。
该试验结果表明，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法对刺
山柑ＲＮＡ提取效果最好，该方法提取刺山柑总ＲＮＡ完
整性好、纯度和产率高，去除杂质的效果好，经ｃＤＮＡ－
ＳＲＡＰ分析结果可获得多态性性丰富、清晰及稳定的扩
增条带，为后续的分子生物学研究奠定了基础。
ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ法适合刺山柑幼苗不同组织部
位ＲＮＡ的提取，尤其是叶片中获得的ＲＮＡ产率较高。
参考文献
［１］　张立运，杨春．保护风蚀地的刺山柑［Ｊ］．植物杂志，２００４，３４（１）：３－４．
［２］　张立运，海鹰．《新疆植被及其利用》专著中未曾记载的植物群落类
型Ⅰ．荒漠植物群落类型［Ｊ］．干旱区地理，２００２，２５（１）：８４－８９．
［３］　Ｌｅｖｉｚｏｕ　Ｅ，Ｄｒｉｌａｓ　Ｐ，Ｋｙｐａｒｉｓｓｉｓ　Ａ．Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｒｆｏｒｍ－
ａｎｃｅ　ｏｆ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．ｕｎｄｅｒ　ａｄｖｅｒｓｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ
ｓｕｍｍｅｒ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃａ，２００４，４２（２）：２２９－２３５．
［４］　Ｒｈｉｚｏｐｏｕｌｏｕ　Ｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｏｆ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．ｔｏ
ｄｒｏｕｇｈｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９０，１３６（３）：３４１－３４８．
［５］　周凡．维药老鼠瓜茎叶生物碱类成分研究［Ｄ］．乌鲁木齐：新疆医科
大学，２０１０．
［６］　喻娟，陈胜璜，李琴雯，等．药用植物刺山柑的研究新进展［Ｃ］．中国
商品学会中药商品专业委员会，２０１２．
［７］　曹锐．刺山柑总黄酮的提取及药效学研究［Ｄ］．乌鲁木齐：新疆农业
大学，２０１０．
［８］　栾东东，石庆华，陈虹，等．刺山柑（Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ）总ＲＮＡ不同提
取方法的比较［Ｊ］．干旱区研究，２００９，２６（３）：４０１－４０５．
［９］　Ｌｉ　Ｇ，Ｑｕｉｒｏｓ　Ｃ　Ｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ），ａ
ｎｅｗ　ｍａｒｋｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ
ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｔａｇｇｉｎｇ　ｉｎ　Ｂｒａｓｓｉｃａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
２００１，１０３：４５５－４６１．
［１０］萨姆布鲁克Ｊ，拉塞尔Ｄ　Ｗ．分子克隆实验指南［Ｍ］．３版．北京：科学
出版社，２００２．
［１１］侯双利，刘翠晶，杨利民，等．影响植物组织总ＲＮＡ质量的因素［Ｊ］．
人参研究，２０１３，２５（２）：１１－１６．
［１２］张瑜，张华，韩博，等．刺山柑多糖提取及其抗炎镇痛作用研究［Ｊ］．石
河子大学学报（自然科学版），２０１１（２）：２０５－２０９．
［１３］蒋雯雯，马淼，郭艳，等．刺山柑多酚类物质含量及其抗氧化活性研
究［Ｊ］．西北植物学报，２０１２，３２（３）：５５５－５５８．
［１４］吴霞，叶蕴华，周亚伟．维药野西瓜化学成分的研究［Ｊ］．中国实验方
剂学杂志，２０１０，１６（６）：９７－１００．
［１５］Ｌｏｇｅｍａｎｎ　Ｊ，Ｓｅｈｅｌ　Ｊ，Ｗｉｌｍｉｔｚｅｒ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆ　ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｎｃｈｅｍ，１９８７，１６３：１６－２０．
［１６］Ｓｅｈｎｅｉｄｅｒｈａｎｅｒ　Ａ，Ｓａｎｄｅｒｍａｎｎ　Ｈ，Ｅｒｎｓｔ　Ｄ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ
ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｒｉｃｈ　ｉｎ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，１９７：
９１－９５．　
［１７］裴东，谷瑞升．几种提取木本植物中ＲＮＡ方法的比较和改进［Ｊ］．植
物生理学通讯，２００２，３８（４）：３６２－３６５．
［１８］唐燕，徐龙，王新建，等．核桃内果皮ＲＮＡ提取方法研究［Ｊ］．北方园
艺，２０１２（１２）：１１７－１１９．
［１９］肖洁凝，黄学林，黎茵，等．富含多糖和次生物质的芒果子叶总ＲＮＡ
的提取［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００３，２３（１１）：８３－８６．
［２０］王玉成，杨传平，姜静．木本植物组织总ＲＮＡ提取的要点与原理
［Ｊ］．东北林业大学学报，２００２，３０（２）：１－４．
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ
ＬＵＯ　Ｊｉａｎｇ１，ＹＡＮＧ　Ｌｉ－ｊｕａｎ１，ＣＵＩ　Ｈａｏ－ｒａｎ１，ＭＡ　Ｃｈｕｎ－ｈｕｉ　２，３
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｒｉｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｌａｒ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８４３３００；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔａｒｉｍ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐｓ，Ａｌａｒ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８４３３００；３．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｓｈｉｈｅｚｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８３２０００）
４９
北方园艺２０１４（０５）：９５～９７ ·生物技术·
第一作者简介：郭亚华（１９５３－），女，黑龙江哈尔滨人，研究员，现主
要从事植物空间诱变育种和生物技术工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｙａｈｕａ＠
ｓｉｎａ．ｃｏｍ．
责任作者：陈立新（１９６３－），男，黑龙江哈尔滨人，研究员，现主要从
事设施园艺规划和设计及蔬菜栽培工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｂｃ０３＠
１２６．ｃｏｍ．
基金项目：国家“８６３”计划资助项目（２０１２ＡＡ１０１２０２）；国家大宗蔬
菜产业技术体系哈尔滨综合试验站资助项目（ＣＡＲＳ－２５－Ｇ－１１）。
收稿日期：２０１３－１１－１４
辣椒经地面模拟诱变后的ＲＡＰＤ鉴定
郭 亚 华１，谢 立 波１，王 　 雪１，陈 立 新１，刘 录 祥２，周 　 宇１
（１．黑龙江省农业科学院 园艺分院，黑龙江 哈尔滨１５００６９；２．中国农业科学院 作物科学研究所，
国家农作物航天诱变技术改良中心，北京１０００８１）
　　摘　要：以地面模拟处理辣椒干种子为试材，采用ＲＡＰＤ技术对辣椒染色体进行多态性检
测，研究了不同剂量的物理诱变处理对辣椒产生的影响。结果表明：采用Ｌｉ离子照射可以诱导辣
椒发生遗传位点的改变，但是不同剂量的效应不同；采用物理进行诱变可以诱导多个性状发生改
变，该方法可以产生复杂的遗传变异。
关键词：辣椒；地面模拟；ＲＡＰＤ
中图分类号：Ｓ　６４１．３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１４）０５－００９５－０３
　　随着科技的发展和社会的进步，各种资源正被开
发利用，当然也包括空间资源。空间诱变育种以及地
面模拟诱变育种已经引起育种学家和科学界的广泛关
注，并在很多方面得到广泛应用［１－２１］。利用空间诱变
进行农作物品种改良不仅涉及到飞行器在空间所处的
复杂环境条件，也涉及搭载作物在空间条件下所引起
的细胞学、形态学、分子生物学及生理生化等各方面的
变异［１－３］。而检测这些遗传变化往往需要快速和有效
的手段，分子标记技术可以快速检测植物发生的变异
　　　　
位点，从而根据标记的遗传规律，推测和跟踪其目标性
状的变化［４－１２］。
在该研究中，通过ＲＡＰＤ分子标记技术，在采用Ｌｉ
离子处理的条件下，对辣椒的诱变程度进行检测，同时
检测其染色体及基因多态性的变化特点，从而探讨了采
用不同剂量的物理诱变对辣椒进行处理产生变异的机
理，以期为辣椒物理诱变育种提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料由黑龙江省农业科学院园艺分院通过地
面模拟锂（Ｌｉ）离子处理的辣椒，同时以未处理的材料为
对照，其中ｍｎｙ１７、ｍｎｙ１８、ｍｎｙ１９、ｍｎｙ２０分别为不同剂
量Ｌｉ处理的第１代，ｍｎＲ１７、ｍｎＲ１８、ｍｎＲ１９、ｍｎＲ２０为
不同剂量Ｌｉ处理的第２代。
１．２　试验方法
１．２．１　种子处理的Ｌｉ离子剂量　辣椒种子Ｌｉ离子处
理的４种剂量为Ｌｉ－１（３０Ｇｙ）、Ｌｉ－２（５０Ｇｙ）、Ｌｉ－３（７０Ｇｙ）、
Ｌｉ－４（１００Ｇｙ

）。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＳＤＳ，ＲＮＡｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ，ＲＮＡｐｌａｎｔ
Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｆｉｎｄ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｔｏｔａｌ
ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｂｌａｄｅｓ　ｉｎ　ｗｉｌｄ　Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ．．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｆｏｕｒ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ
ｗｅｒｅ　ｓｅｅｎ　ｔｗｏ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　２８Ｓａｎｄ　１８Ｓ，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ａｎ　ＲＮＡ　ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｅａｒ
ｐａｔｔｅｒｎ，ｂｒｉｇｈｔ，ｓｔａｂｌｅ，ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ　ｏｆ　２８ＳｒＲＮＡ　ｗａｓ　ｔｗｏ　ｔｉｍｅｓ　ｏｆ　１８ＳｒＲＮＡ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ｗａｓ　２．００ａｎｄ
ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｗａｓ　１７５．３μｇ／ｇ，ｅｘｃｅｐｔ　ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｔｏ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ
ｉｓ　ｇｏｏｄ，ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ，ｏｔｈｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｒｅ　ｐｏｌｕｔｉｏｎ，ｓｕｃｈ　ａｓ
ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ｕｓｉｎｇ　ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｒｏｍＣａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｓａ　Ｌ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ，ｒｏｏｔ，ｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｌｅａｆ　ｃｏｕｌｄ　ｏｂｔａｉｎ　ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＲＮＡｐｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ
ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃａｐｐａｒｉｓ　ｓｐｉｎｏｚａ　Ｌ；ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ；ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
５９