全 文 ：269※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 11
苦荞麸皮蛋白的提取分离及清除
自由基作用研究
左光明 1，谭 斌 2，秦礼康 1,*
(1.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.国家粮食局科学研究院，北京 100037)
摘 要：以苦荞二道荞麸为原料，进行复合蛋白提取和蛋白质 Osborne 分级分离，并对各蛋白组分进行清除自由
基能力研究。结果表明，苦荞麸皮中最主要的蛋白组分为清蛋白，占蛋白总量的 51.22%；其次为球蛋白和谷蛋
白，分别占 13.69% 和 17.07%；最少的为醇溶蛋白，占 8.83%。苦荞麸皮复合蛋白及各蛋白组分均有体外清除自
由基作用，其中水溶性清蛋白和球蛋白清除自由基能力高于醇溶蛋白和碱溶蛋白，且在低浓度范围内，随蛋白质
浓度增加，清除能力呈线性提高，但在高浓度时却无明显量效关系。
关键词：苦荞麸皮；复合蛋白；O s b o r n e 分级；自由基
Study on Extraction and Free Radical Scavenging Function of Protein from Tartary Buckwheat Bran
ZUO Guang-ming1，TAN Bin2，QIN Li-kang1,*
(1.College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China；
2.Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)
Abstract: In this study, the protein in tartary buckwheat bran was extracted for Osborne fractions. Meanwhile, the free radical
scavenging functions of different proteins from tartary buckwheat bran were also investigated. The results showed that the
content of different proteins in tartary buckwheat bran are albumin 51.22%, globulin 13.69%, glutelin 17.07%, and prolamin
8.83%, respectively. Both protein complex and four protein components from tartary buckwheat bran can scavenge free radical
in vitro. The ratios of water-soluble albumin and globulin scavenging free radial are higher than those of prolamin and glutelin. The
functions of these proteins scavenging free radical increased with their concentrations increasing in lower range, but trend to
constant when these proteins reach higher concentration, suggesting that the functions have no relationship with protein in
higher concentration range.
Key words: tartary buckwheat bran；protein complex；Osborne fraction；free radicals
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)11-0269-05
收稿日期：2008-06-21
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划子项目(2006BAD02B01-08) ；六盘水市科技局项目(52020-07-008) ；
贵州大学研究生创新基金项目(校研农2007010)
作者简介：左光明(1981-)，男，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全控制。E-mail：0701311@163.com
* 通讯作者：秦礼康(1965-)，男，教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：likangqin@126.com
苦荞，作为一种集营养、保健、医疗于一体的重
要小宗杂粮作物，被称为“食药两用”的粮食珍品。
据《本草纲目》记载：“苦荞性味苦、平、寒，有
益气力、续精神、宽肠健胃的作用”、“苦荞能实肠
胃，练五脏滓秽，磨积滞，消热肿风痛”等。近年
来研究表明，苦荞蛋白质氨基酸组成平衡，具有很高
的生物效价，能降低血液胆固醇[1]、抗衰老[2]、以及抑
制脂肪蓄积、改善便秘等，是一种极具开发价值的生
物活性蛋白。目前，关于苦荞蛋白清除自由基的研究
鲜见报道，其中张美莉等以苦荞粉的 8% NaCl 粗提物为
供试蛋白，采用 ESR 法研究其清除自由基能力[3]，但因
黄酮等物质的影响，苦荞蛋白清除自由基的作用机制，
尚待进一步研究。本实验首次以苦荞二道荞麸为原料，
进行苦荞复合蛋白提取和蛋白质分级分离，并对各蛋白
组分进行清除自由基能力研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2008, Vol. 29, No. 11 食品科学 ※工艺技术270
苦荞麸皮、苦荞粉均由贵州六枝特区纯雾峰天然食
品厂提供。
考马斯亮蓝蛋白试剂盒 南京建成生物工程研究
所；1,1- 二苯基 -2- 间三硝基苯基 - 偕腙肼(1,1-diphenyl-
2-picryl-hydrazyl，DPPH·) Sigma 公司；NaOH、
H C l、N a C l、正丙醇、正已烷、浓硫酸、邻苯三酚、
水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、FeSO4、H2O2 等均
为分析纯。
1.2 仪器与设备　
UV-7502PC 紫外可见分光光度计 上海欣茂仪器有
限公司；R-201 旋转蒸发器 上海申胜生物技术有限公
司；FD-1 冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司；
电热恒温水浴锅 北京长源试验设备厂；LD4-2 型离心
机 北京医用离心机厂。
1.3 方法
1.3.1 脱脂脱黄酮方法　
取一定量的苦荞麸皮、苦荞粉按照 1:5(g/ml) 加入正
己烷，室温下不断搅拌脱脂 48h，其间换正己烷 11～12
次，脱脂后将苦荞粉置于通风橱中挥发 48h，脱脂苦荞
粉装入具塞试剂瓶中，置于冰箱 4℃保存供备用。
1.3.2 苦荞蛋白提取与制备
1.3.2.1 工艺流程
结合一般植物分离蛋白的提取工艺和苦荞麸皮特
性，采用分级提取苦荞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白与
谷蛋白，同时用碱萃取酸沉析法制备苦荞复合蛋白。具
体工艺流程图如下：
取 100g脱脂苦荞麸皮，加入到 pH值为 10.0的NaOH
溶液中(料液比为 1:12)，45℃恒温下搅拌提取 60min，
4000r/min 离心 20min，收集上清液，沉淀重复提取一
次，上清液合并后加入 0.05mol/L HCl 调节 pH4.5，离
心，沉淀于 4℃对蒸馏水透析 48h，沉淀冷冻干燥。苦
荞粉复合蛋白制备同 1.3.2.1。
1.3.2.3 清蛋白
取 100g 脱脂苦荞麸皮，加入到蒸馏水中(料水比为
1:12)，35℃下搅拌提 60min，于 4000r/min 离心 20min，
收集上清液，沉淀重复提取一次，离心，上清液合并
后浓缩，冷冻干燥所得产品即为清蛋白。
1.3.2.4 球蛋白
清蛋白提取后的沉淀加入到 1mol/L NaCl 中(料液比
为 1:10)，35℃恒温下搅拌提取 60min，4000r/min 离心
2 0 m i n，收集上清液，沉淀重复提取一次，离心，上
清液合并后于 4℃对蒸馏水透析 48h，离心收集沉淀，沉
淀冷冻干燥后即为球蛋白。
1.3.2.5 醇溶蛋白
球蛋白提取后的沉淀加入到 55% 正丙醇中(料液比为
1:12)，35℃下搅拌提取 60min，于 4000r/min 离心 20min，
收集上清液，沉淀重复提取 1 次，剩下的溶液离心，
上清液合并后旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥，所得产
品即为醇溶蛋白。
1.3.2.6 谷蛋白
醇溶蛋白提取后的沉淀加入到 pH10.0 的 NaOH 溶液
中(料液比为 1:12)，45℃下搅拌提取 60min，4000r/min
离心 2 0 m i n，收集上清液，沉淀重复提取一次，上清
液合并后加入 0.05mol/L HCl 调节 pH4.5，离心，沉淀
于 4℃对蒸馏水透析 4 8 h，沉淀冷冻干燥。
1.3.3 蛋白含量的测定
溶液蛋白含量采用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定；粗
蛋白质测定参照 GB/T5009.5 — 2003 进行。
1.3.4 苦荞蛋白清除自由基测定
1.3.4.1 清除超氧阴离子自由基( ) 能力的测定
采用邻苯三酚氧化法 [ 4 ]测定。每支试管加入 3 ml
0.1mol/L Tris-HCl 磷酸盐缓冲液(pH8.2)、0.1ml 不同浓
度蛋白溶液，25 ± 0.5℃水浴平衡 20min 后，加入 0.3ml
7mmol/L 的邻苯三酚准确反应 4min，加入 1ml 10mol/L
HCl 终止反应，在波长 420nm 处测吸光度，按下式计
算清除率。
·O2
式中，A 0 为空白对照液的吸光度，以蒸馏水代替
样品液的吸光度；A 1 为样品组的吸光度；A 2 为蛋白溶
液本身的吸光度，以蒸馏水代替反应试剂的吸光度。
1.3.4.2 清除羟基自由基(·OH)能力的测定
采用 Fenton 法[5 ]测定。取若干支试管编号，每支
试管各加 9mmol/L FeSO4、9mmol/L 水杨酸 - 乙醇溶液
2ml，按试管编号各加入不同浓度的蛋白溶液 2ml，最
后加入 8.8mmol/L H2O2 2ml 启动反应，于室温下反应 1h。
以蒸馏水调零，在波长 510nm 处测定样品的吸光度，考
清除率(%)= A0 －(A1 － A2)
A0
×100 (1)在单因素筛选基础上，通过正交试验，苦荞麸皮
复合蛋白及蛋白组分最终提取工艺如下。
1.3.2.2 复合蛋白
苦荞麸皮 + 正己烷→黄酮、脂粗提物
↓
脱脂、脱黄
酮苦荞麸皮 →搅拌提取→离心→残渣→ NaCl 溶液→离心→残渣
上清液(球蛋白组分)上清液(清蛋白组分)
→ →
碱提
→
正丙醇溶液
搅拌提取
→
→淀粉 残余物 离心 碱提取 残渣 离心→→→→ → →
上清液(谷蛋白组分) 上清液(醇溶蛋白组分)
→→
离心→
复合蛋白
+水
271※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 11
虑到蛋白溶液本身的吸光度，以 9mmol/L FeSO4 1ml、
9mmol/L 水扬酸 - 乙醇溶液 2ml，不同浓度的蛋白溶液
2ml，蒸馏水 2ml，作为蛋白溶液的吸光度。羟基自由
基的清除率按式(1)计算。
1.3.4.3 DPPH 自由基清除能力[6]
准确称取 DPPH 标准品配制 6.5 × 10-4mol/L 甲醇贮
备液，置于冰箱，临用前用体积分数为 50% 的甲醇稀
释 6.5 × 10-5mol/L 使用。在试管中依次加入 4.0ml 6.5 ×
10-5 mol/L DPPH 溶液和 1.0ml 样品，总体积为 5.0 ml，
混匀后于室温下反应 30min，用 1cm 比色皿在 517nm 波
长处测吸光度，记为A0；加入4.0ml 6.5×10-5mol/L DPPH
和 1.0ml 待测试样溶液，测定值记为 A 1；加入 4.0ml
6.5×10-5mol/L DPPH溶液和1.0ml待测试液混匀后测吸光
度，记为 A 2。按式( 1 ) 计算清除率。
1.3.5 统计分析
数据采用 SPSS11.5 统计软件统计分析。
2 结果与分析
2.1 荞麸、荞粉脱脂后黄酮类化合物的含量
常用的黄酮类化合物提取溶剂有乙醇[7]和正己烷，
但是乙醇对蛋白质具有变性作用，不能使用。因此，
选用正己烷对苦荞麸皮、苦荞粉进行萃取，去除黄酮
类化合物和脂肪。经搅拌脱脂 4 8 h 后，苦荞麸皮、苦
荞粉黄酮类化合物残留分别为 0.085%、0.008％，为
进一步脱去苦荞麸皮黄酮，继续搅拌脱脂 1 2 h，其间
换正己烷 5～6 次，最终苦荞麸皮黄酮化合物残留量为
0.026%。
Osborne 分级提取法是研究谷物蛋白质常用的分类方
法之一，他是根据蛋白在水、盐、醇以及碱溶液中
的溶解性来划分的。该方法较粗略，受提取条件的影
响较大，只能对结构类似蛋白进行大致估测。曾有报
道 [ 8 ]指出苦荞粉中主要的蛋白为清蛋白，含量为 4 3 .
82%；刘拥海等[9]测得苦荞种子中清蛋白占总蛋白质含量
的 71.4% 左右。这与我们的测定荞麸有所出入，可能是
由于苦荞麸皮中蛋白组成的确不同于荞粉及种子，或由
于原料的差异，清蛋白、球蛋白的提取不彻底，部分
记入谷蛋白中。
另外，各类蛋白制备物的纯度差异较大，醇溶蛋白
和谷蛋白制备物中蛋白含量超过 94%，球蛋白稍低(86 .
44%)，而清蛋白制备物中蛋白含量极低(24.55%)，主要
杂质是可溶性淀粉和糖类，为此需要对清蛋白制备物进
行纯化，本实验采用硫酸铵分级沉淀的方法，上清液缓
慢地向其中加入固体硫酸铵至 2 0 % 饱和度，室温静置
2h，4000r/min 离心 15min，分别收集上清液和沉淀，向
收集的上清液中继续加入固体硫酸铵，依次按照同样的
方法调节到 50%、60%、70% 和 80% 硫酸铵饱和度。分
别收集每一个饱和度的硫酸铵溶液沉淀苦荞清蛋白提取
物，离心取沉淀，对水透析 7 2 h，制备物冻干后分析。
结果(表 2 )表明，苦荞清蛋白提取物经饱和度为 6 0 %、
70% 和 80% (NH4)2SO4 分级沉淀纯化后，纯度显著的提
高，由原来的 24.55% 提高到 77.37%，证明硫酸铵分级
沉淀纯化步骤是有效的。
同时对苦荞麸皮复合蛋白、苦荞粉复合蛋白经
Osboren 分类法分析(图 1)发现，清蛋白和谷蛋白是苦荞
麸皮复合蛋白、苦荞粉复合蛋白中的主要蛋白组分，其
中苦荞麸皮复合蛋白中清蛋白含量高于谷蛋白，而苦荞
粉复合蛋白中，谷蛋白反而高出清蛋白含量。
表2 硫酸铵分级沉淀纯化清蛋白
Table 2 Protein content of albumin treated with ammonium sulfate
蛋白含量
(%)
0 20 50 60 70 80
24.55±0.31 9.64±0.07 18.22±0.13 38.15±1.02 50.41±0.23 77.37±1.18
(NH4)2SO4
(V/V)
2.2 苦荞麸皮蛋白组成
表 1 给出了苦荞麸皮蛋白各组分的相对含量及提取
后纯度，其数据表明，苦荞麸皮中最主要的蛋白组分
是清蛋白，占总蛋白的 51 .22 % 左右，其次为谷蛋白，
占 17.07%，而球蛋白和醇溶蛋白含量分别为 13.69% 和
8.83%，各蛋白组分含量差异达到显著水平。这四种蛋
白超过蛋白总量的 90%，还有近 10% 的残余蛋白留在残
渣 中 。
表1 苦荞麸皮中各类蛋白质相对百分含量及制备物纯度
Table 1 Distribution and purities of proteins from tartary
buckwheat bran
注：表中数据为样品的“x ± s”；同一行中字母不同者为差异显著(p
＜ 0.05)。
组分 清蛋白 球蛋白 醇溶蛋白 谷蛋白 残余蛋白
相对总蛋白
百分含量(%)
51.22±
0.08a 13.69±1.03
b 8.83±0.52c 17.07±1.27d 9.19±0.74e
各蛋白组分
纯度(%） 24.55±0.47 86.44±1.64 95.81±0.31 97.66±0.25 —
35
30
25
20
15
10
5
0
清蛋白 球蛋白 醇溶蛋白 谷蛋白
图1 苦荞麸皮和苦荞粉复合蛋白中各蛋白组分的相对含量
Fig.1 Relative percentages of protein components in complex
protein of tartary buckwheat bran and flour
荞麸复合蛋白 荞粉复合蛋白
36.8
25.4
34.6
3.93.2
27.5
31.2
37.4
相
对
含
量
(%
)
2008, Vol. 29, No. 11 食品科学 ※工艺技术272
2.3 苦荞麸皮蛋白各组分对自由基的清除作用
2.3.1 对超氧阴离子的清除作用
6.8929，R2=0.9907；醇溶蛋白 y=2.944x － 0.4109，
R2=0.9928；谷蛋白 y=12.734x － 2.0887，R2=0.9791。随
着蛋白液浓度进一步增加后，清除率趋于平缓。经计
算荞麸复合蛋白的 EC50 为 0.90mg/ml、荞粉复合蛋白为
1.23mg/ml、清蛋白为 0.71mg/ml、球蛋白 1.26 为 mg/ml、
醇溶蛋白为 17.12mg/ml、谷蛋白为 4.09mg/ml。这几种
蛋白对羟自由基清除能力的大小顺序为：清蛋白＞荞麸
复合蛋白＞荞粉复合蛋白＞球蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋
白。各组份对·OH 的清除能力随浓度增加而增加，其
中醇溶蛋白与谷蛋白组分最为明显，其余蛋白液在浓度
大于 0.4mg/ml 后，虽在各浓度下的清除率差异达到显著
水平，但清除率趋于平缓。
2.3.3 对 DPPH·的清除作用
图 4 结果表明，除谷蛋白外，其余不同蛋白液在
0.2～0.6mg/ml 添加量间，对 DPPH·的清除率随样品
浓度的增加迅速增强，清除率与蛋白浓度接近线性关
系；在 0.6～1.0mg 样品量间增长趋缓。谷蛋白浓度在
0.2～0.4mg/ml 对 DPPH·的清除率与蛋白浓度接近线性
从图 2 可以看出，不同浓度不同蛋白液对超氧阴离
子的清除效果都不同。在低浓度时，除球蛋白浓度在
0.2～0.4mg/ml 对超氧阴离子的清除率与蛋白浓度接近线
性关系外，其余蛋白对超氧阴离子的清除率接近线性关系
的浓度在 0.2～0.6mg/ml，清除率随着蛋白浓度的增加而增
强，线性方程分别为：荞麸复合蛋白 y=41.408x _2.7332，
R2=0.9908；荞粉复合蛋白 y =28.164x_0.7833，R2=0.9943；
清蛋白 y=45.302x_0.5704，R2=0.9551；球蛋白 y = 55.341x
_2.1283，R2=0.9941；醇溶蛋白 y=5.0061x _0.6437，
R2=0.9727；谷蛋白 y=10.45x+0.4914，R2= 0.9977。随
着蛋白液浓度进一步增加后，清除率趋于平缓。经计
算荞麸复合蛋白的 EC50 为 1.27 mg/ml、荞粉复合蛋白为
1.80mg/ml、清蛋白为 1.12 mg/ml、球蛋白为 0.94 mg/ml、
醇溶蛋白为 10.12 mg/ml、谷蛋白为 4.74mg/ml。这几种
蛋白对超氧阴离子清除能力的大小顺序为：球蛋白＞清
蛋白＞荞麸复合蛋白＞荞粉复合蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋
白。水溶性蛋白组分清除超氧阴离子能力高于醇溶蛋白
及谷蛋白组分，荞麸复合蛋白清除能力高于荞粉复合蛋
白，这是因为清蛋白是荞麸复合蛋白中主要蛋白组分，
而清蛋白清除能力最高，从而增强了荞麸复合蛋白清除
能 力 。
2.3.2 对羟自由基的清除作用
由图 3 可知，不同浓度不同蛋白液都具有不同程度
清除羟自由基的能力，在低浓度(0.2～0.4mg/ml)时，各
蛋白浓度对羟自由基的清除率与蛋白浓度接近线性关
系，清除率随着蛋白浓度的增加而增强，线性方程分
别为：荞麸复合蛋白 y=68.62x － 11.713，R2=0.989；
荞粉复合蛋白 y=58.904x － 10.241，R2=0.9909；清蛋
白 y=92.653x － 5.792，R2=0.9879；球蛋白 y=45.097x －
图 2 苦荞麸皮各蛋白组分的超氧阴离子清除能力
Fig.2 Superoxide anion radical scavenging activity of protein
components from tartary buckwheat bran
g
荞粉复合蛋白
荞麸复合蛋白 清蛋白
谷蛋白
醇溶蛋白
球蛋白
蛋白浓度(mg/ml)
注：不同小写字母表示 p=0 .05 水平差异显著，下同。
h
h
h
h
h
g
g
g
g
g
f
f
f
f
f
f
e
c
c
c
c
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h
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e
f
e
e
e
d
d
d
d
c
c
b
b
b
b
a
a
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
清
除
率
(%
)
图3 苦荞麸皮各蛋白组分的羟自由基清除能力
Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging activity of protein components
from tartary buckwheat bran
g
g
h
h
h
h
g
f
g
g
f
f
e
e
e
g
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f
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a
a
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蛋白浓度(mg/ml)
清
除
率
(%
)
荞粉复合蛋白
荞麸复合蛋白 清蛋白
谷蛋白
醇溶蛋白
球蛋白
图4 苦荞麸皮各蛋白组分的 DPPH·清除能力
Fig. 4 DPPH free radical scavenging activity of protein compo-
nents from tartary buckwheat bran
h
h
h
h
h
g
g
g
g
g
g
f
f
f
f
f
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a
c
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a
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f
h
h
g
g
f
f
f
d
cc
b
baaa
35
30
25
20
15
10
5
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蛋白浓度(mg/ml)
清
除
率
(%
)
荞粉复合蛋白
荞麸复合蛋白 清蛋白
谷蛋白
醇溶蛋白
球蛋白
273※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 11
关系，线性方程分别为：荞麸复合蛋白 y = 5 4 . 3 9 9 x _
9.0382，R2 = 0.9462；荞粉复合蛋白 y=47.143x_8.0204，
R2=0.9682；清蛋白 y=68.961x_10.723，R2=0.9793；球蛋
白 y=58.573x _8.8252，R2=0.9922；醇溶蛋白 y= 3.1629x_
0.3095，R 2= 0 .9934；谷蛋白 y=13.754x_1.6238，R2=
0 . 9 9 6。随着蛋白液浓度进一步增加后，清除率趋于平
缓。经计算荞麸复合蛋白的 EC50 为 1.09mg/ml、荞粉复合
蛋白为 1.23mg/ml、清蛋白为 0.88mg/ml、球蛋白为 1.00
为 mg/ml、醇溶蛋白为 15.91mg/ml、谷蛋白为 3.75mg/ml。
这几种蛋白对 DPPH·清除能力的大小顺序为：清蛋白
＞球蛋白＞荞麸复合蛋白＞荞粉复合蛋白＞谷蛋白＞醇
溶蛋白。清蛋白对 DPPH·的清除率明显高于其他蛋白
液，其最大清除率可达到 38.45%。水溶性蛋白组分清
除 DPPH·的能力高于醇溶性及碱溶性蛋白，荞麸复合
蛋白清除能力高于荞粉复合蛋白。
3 结 论
3.1 苦荞麸皮中最主要的蛋白组分是清蛋白，占总蛋
白的 51.22% 左右，醇溶蛋白含量较低，仅为 8.83%。球
蛋白和谷蛋白含量比较接近，分别为 13.69%、17.07%。
这四种蛋白超过蛋白总量的 90%，还有接近 10% 的残余
蛋白留在残渣中。清蛋白和谷蛋白是苦荞麸皮主要蛋白
组分，且清蛋白含量高于谷蛋白。
3.2 苦荞麸皮复合蛋白及各蛋白组分均对自由基有清除
作用，但不同蛋白组分对不同自由基的清除能力不同。
清蛋白清除自由基能力最强，球蛋白次之，醇溶性蛋
白清除自由基能力最弱。水溶性清蛋白和球蛋白清除自
由基能力高于醇溶和碱溶蛋白组分，可以得出苦荞麸皮
蛋白中水溶性蛋白为主要的生物活性蛋白。
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