全 文 ：收稿日期:2004-11-06
基金项目:国家“863”计划重点资助项目(2002AA2Z3217).
作者简介:陈武(1944-),男 ,江西奉新人 ,教授 , 主要从事生物药学研究.
文章编号:1000-5862(2005)02-0126-03
伞房花耳草中乌索酸的提取与鉴定
陈　武 , 　邹盛勤 , 　李开泉
(宜春学院 生物工程研究所 ,江西 宜春　336000)
摘要:用“醇提凝析”法提取分离伞房花耳草中的乌索酸 , 光谱鉴定其结构 , 高效液相色谱分析法测定其
含量为 99.58%, 得率为 3.12‰.提取分离方法实用可行 ,乌索酸纯度高 , 安全性好.
关键词:伞房花耳草;乌索酸;提取分离;结构鉴定
中图分类号:R 248.2　　　文献标识码:A
伞房花耳草 ,又名蛇舌草 、水线草 ,为茜草科耳草属植物伞房花耳草(Hedyotis corymbosa Lam.)的干燥全
草[ 1] ,在我国主要分布于南方各省 ,产量较大 ,其药材性状与同科同属植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa
Willd.)相似.近年来 ,我们采用高效液相色谱分析法(HPLC),对江西盛产的 30种天然植物中乌索酸的含量
进行了测定筛选 ,发现伞房花耳草中乌索酸的含量高于白花蛇舌草 ,亦高于陆英[ 2] .本文报道用“醇提凝析”
法分离提纯伞房花耳草中乌索酸 ,并用光谱分析确证其结构 ,HPLC分离乌索酸的纯度达到 99.58%.
1　仪器与试剂
熔点用 Boetius 显微熔点测定仪测定 ,温度未经校正;旋光度用WZZ-1S 数字式自动旋光仪测定;红外
光谱用PerkinElmer Spectrum One 傅立叶变换红外光谱仪测定;质谱用 Autospec-Ultima ETOF EL 及 Magnet
BPL 型质谱仪测定;核磁用 INOVA-500型1 H及13 C 核磁共振光谱仪测定;含量用Waters-515型双泵高效
液相色谱仪 ,2996光电二极管矩阵检测器测定.
药材采自赣西地区宜春市袁州区 ,经本所天然药物研究室鉴定为茜草科耳草属植物伞房花耳草 Hedyotis
corymbosa Lam .的全草[ 2] .95%乙醇 ,食用级(广西糖厂);“YCXY-1号”除杂剂 ,自制;复合酶制剂(哈尔滨神
农有限公司);活性炭 ,分析纯(上海豪申化学试剂有限公司);乌索酸对照品为中国药品生物制品检定所产
品(批号 110742-200314).
2　提取分离
采用“醇提凝析”法提取分离[ 3] .将干燥后的伞房花耳草 10 kg 粉碎成粗粉(20 目),用温水湿润后 ,加入
适量复合酶制剂 ,于 38 ℃左右酶解处理后 ,用 7倍量95%的乙醇于 80 ℃回流提取 2次 ,每次 1 h.合并提取
液 ,过滤 ,减压回收乙醇得浸膏 ,以纯水沉降洗涤后 ,加“YCXY-1号”除杂剂除杂处理 2次.过滤 ,用 95%乙
醇溶解 ,调节 pH值 ,加活性炭脱色 ,过滤除杂.再用 95%乙醇溶解 ,调 pH值 ,凝析分离 、纯化精制 ,80 ℃干燥
24 h ,得无色针状结晶乌索酸 31.2 g.
3　HPLC 测定样品含量
3.1　色谱条件　色谱柱为SymmetryShield RP18柱(3.9×150 mm , 5 μm),检测波长为 210 nm ,流动相为甲醇
-水(88∶12), 流速为 1.0 mL/min , 柱温为 25 ℃.用外标法定量分析.
第 29 卷第 2期
2005 年 3 月　
江西师范大学学报(自然科学版)
JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)
Vol.29 No.2
　Mar.2005
DOI :10.16357/j.cnki.issn1000-5862.2005.02.009
3.2　溶液的配制　(1)对照品溶液:精确称取乌索酸对照品 9.8 mg ,置于 10 mL 容量瓶中 ,用甲醇溶解并稀
释至刻度 ,摇匀 ,制成含乌索酸 0.98 mg/mL的对照品溶液.(2)样品溶液:精确称取乌索酸样品 9.5 mg ,置于
10 mL容量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,溶液经 0.45μm微孔滤膜过滤后作为样品溶液.
3.3　线性关系　分别吸取乌索酸对照品溶液 4 , 8 ,12 ,16 , 20 μL ,按 3.1项下色谱条件进样 ,测定峰面积.以
峰面积对样品进样量进行线性回归 ,得乌索酸回归方程为 Y =1.42×105X +2.19×104 , R =0.999 9 ,表明当
乌索酸进样量在 3.9 ～ 19.6μg 之间时 ,线性关系良好.
3.4　精密度试验　精密吸取乌索酸对照品溶液 10 μL 进样 ,重复进样 5 次 ,测得乌索酸峰面积 RSD 为
0.32%(n=5),表明仪器精密度良好.
3.5　样品含量测定　吸取样品溶液10μL进样分析 ,重复进样5次 ,测得样品中乌索酸平均含量为99.58%.
4　样品结构鉴定
样品为无色针状结晶 ,易溶于热乙醇 、热甲醇 ,可溶于乙醚 、醋酸乙酯 、乙醇 、甲醇 、丙酮 、氯仿等有机溶
剂 ,不溶于石油醚和水.醋酐-浓硫酸反应显紫红色 ,香英兰素-硫酸反应呈紫色.[ α] D20 +65 (C%9.5 ,
EtOH),熔点为 285 ～ 287 ℃,与乌索酸对照品混合熔点不下降.元素分析计算值(%):C ,78.92;H ,10.58;实验
值(%):C , 79.05;H ,11.10.分子式为 C30H48O3.
EI-MS(m/z):456(M+),441(M —CH3), 438(M —H2O),423(M —CH3 —H2O),411(M —COOH),410(M —
H —COOH).D 、E环离子 a(C环经 RDA裂解):248(a.100),203(a—COOH),189(a—CH2—COOH),133;A 、B环
离子 b(C环经 RDA裂解):208(b),207(b—H),190(b—H2O)和 189(b—H2O—H).
IR(KBr ,ν/cm-1):3 433(—OH), 2 965 , 2 927 , 2 871(C —H), 1 691(C O ), 1 456 , 1 384(CH3), 1 031
(C —O).1 H-NMR(DMSO-d6)示 5个季碳甲基:0.68 、0.75 、0.87 、0.89 、1.04 ,各 3H , s;2个叔碳甲基:0.81 , J
=6.2 Hz;0.91 , J =6.0 Hz ,各 3H , d;C18(2.01 , J =11.4 Hz , d);C3α—H(3.00 , J =11.0 , 5.2 , 5.2 Hz , 1H ,
td ,);C12 —H(5.13 , J =3.5 Hz ,1H , t);C15—H(1.00 , J =13.6 Hz ,1H ,brd);C16 —H(1.93 , J =13.2 ,4.0 Hz ,
1H , td);C29 —H(0.81 , J =6.2 Hz , 3H ,d);C30-H (0.91 , J =6 Hz , 3H , d).
　　13 C -NMR(DMSO -d6)示 7 个伯碳:28.3
(C23),16.1(C24),15.2(C25), 17.0(C26), 23.3(C27),
16.9(C29), 21.1(C30);9 个仲碳:38.2(C1), 27.0
(C2),18.0(C6), 32.7(C7), 22.8(C11), 27.5(C15),
23.8(C16), 31.2(C21), 36.3(C22);7 个 叔碳:
76.8(C3), 54.8(C5), 47.9(C9), 124.6(C12),
52.3(C18),39.4(C19), 38.5(C20);6 个季碳:38.4
(C4),39.8(C8), 36.5(C10), 138.2(C13),41.6(C14),
48.8(C17);1个羧基碳:178.3(C28).乌索酸结构式见
图1.
H3C CH3
HO
CH3 CH3
CH3
COOH
H3C
CH3
图 1　乌索酸结构式
　　以上光谱数据与文献值一致[ 4 ,5] ,根据理化常数和光谱数据确证样品为乌索酸[ 6] .
5　讨论
(1)乌索酸属五环三萜类化合物 ,具有抗肝炎 、抗肿瘤 、抗菌消炎 、降血糖血脂 、增强免疫功能等多种药理
活性 ,且毒性小 ,副作用少 ,在医药保健 、日用化工及功能食品等行业有重要的应用开发价值 ,成为当前国内
外研究开发的热点.乌索酸在植物界分布虽较广泛 ,但其含量较低 ,提取分离难度大 ,当前尚未实现人工合
成.目前国内外常采用Al2O3 、硅胶 、聚酰胺等柱层析法进行提取分离[ 7～ 11] ,需使用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、
正丁醇 、甲醇 、环己烷等有机溶剂萃取 、洗脱 ,不但提取工艺复杂 ,而且分离量小 、溶剂消耗大 、成本高 、安全
性差 ,难以实现工业化生产.本工艺以伞房花耳草为原料 ,采取“醇提凝析”法提取分离乌索酸 ,仅以乙醇为
127第 2期 陈　武 ,等:伞房花耳草中乌索酸的提取与鉴定
溶剂 ,未加其它有机溶剂 ,采用自制的“YCXY-1号”除杂剂 ,有效去除脂类 、类脂类 、酚类及叶绿素等杂质 ,
不仅保证了产品无有毒有害溶剂残留 ,提高了安全性 ,而且有利于乌索酸的富集和纯化.
(2)为了提高原料药材的利用率 ,简化工艺程序 ,本工艺采用复合酶制剂对原料进行酶解处理 ,一方面促
使乌索酸及其苷与植物细胞壁脱离 ,加速乌索酸及其苷的充分释放 ,并使乌索酸苷转化为苷元 ,另一方面将
一些可水解的脂类 、类脂类等杂质转化为小分子水溶性物质.经上述酶解处理的原料用乙醇提取 ,所得浸膏
加纯水沉降洗涤 2次后 ,用“YCXY-1号”除杂剂进一步除去脂类 、酚类 、黄酮类等杂质.提取物以乙醇溶解 ,
加活性炭脱色 ,经凝析分离 、纯化精制 ,烘干 ,即得无色针状结晶乌索酸 ,其纯度达 99.58%,得率为 3.12‰.
(3)调节控制 pH 值是本工艺技术的关键环节 ,对脱色除杂 、凝析分离 、产品质量及得率均有较大影响.
经反复试验结果表明 ,提取物脱色除杂时 ,应将 pH值调为 9左右 ,使乌索酸形成钠盐 ,过滤除杂后 ,再将 pH
值调为2左右 ,使乌索酸钠盐转化为乌索酸 ,这是工艺过程中应注意控制的重要技术参数.
(4)伞房花耳草药材性状与同科同属植物白花蛇舌草相似 ,经调查及文献记载 ,全国几乎多数地区使用
的白花蛇舌草实为伞房花耳草 ,或者两者混在一起使用 ,民间广泛应用于临床治疗急慢性病毒性肝炎 、急慢
性肾炎 、肿瘤 、慢性盆腔炎 、疟疾 、肠炎 、烫伤等疾病[ 12 ,13] ,这可能与含有乌索酸 、齐墩果酸 、甾醇 、生物碱及黄
酮类等[ 13]多种活性成分有关.
致谢:乌索酸的质谱 、核磁共振光谱由中国海洋大学药物研究所李英霞教授代测.
参考文献:
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Extracting and Identifying of Ursolic Acid
from Hedyotis Corymbosa Lam.
CHEN Wu , 　ZOU Sheng-qin , 　LI Kai-quan
(Institute of Biology , Yichun University , Yichun Jiangxi 336000 , China)
Abstract:Adopting the method of ethanol extracting and agglutination separating to extract ursolic acid from Hedyotis
corymbosa Lam.and using spectrum to identify it s structure.The compound is recognized to be ursolic acid , the content
is 99.58%by HPLC , and the yield is 3.12‰.The method is practical and feasible.The purity of ursolic acid is high
and the safety is good.
Key words:Hedyotis corymbosa Lam.;ursolic acid;extract and separate;structure identification
(责任编辑:刘显亮)
128 江西师范大学学报(自然科学版) 2005 年