全 文 ：收稿日期:2005-02-28
基金项目:国家“863”计划重点资助项目(2002AA2Z3217).
作者简介:陈武(1944-),男 ,江西奉新人 ,教授 , 主要从事天然药物与生物技术研究.
文章编号:1000-5862(2005)04-0348-03
黄毛耳草中乌索酸的分离提纯及 RP-HPLC分析
陈　武1 , 　罗志刚2 , 　邹盛勤1 , 　李开泉1
(1.宜春学院 生物工程研究所 ,江西 宜春　336000;2.井冈山职业技术学院机械系 ,江西吉安　343000)
摘要:采用“醇提凝析法”从黄毛耳草中分离提纯乌索酸 , 用 IR、MS 、NMR等技术对乌索酸结构进行了表
征.建立了反相高效液相色谱法测定乌索酸含量的方法 ,色谱柱为 SymmetryShield RP18 柱(3.9 mm×150
mm , 5 μm);流动相为甲醇∶水(88∶12 , V/ V);流速为 1.0 mL/min;二极管阵列检测器检测 , 检测波长为 210
nm;柱温为 25 ℃;线性范围:4.5～ 22.5 μg;线性回归系数大于 0.999 8.HPLC 测定乌索酸纯度为 99.82%,
得率为 3.65 ‰.该方法具有快速简便 、精密度高 、重现性好 、线性范围宽的特点 , 可作为控制乌索酸质量
的方法.
关键词:黄毛耳草;乌索酸;结构表征;HPLC分析
中图分类号:O 658　　　文献标识码:A
黄毛耳草 ,又名敷地两耳草 ,为茜草科耳草属植物黄毛耳草 Herba Hedyotidis Corymbosae 的全草 ,分布在我
国南方各省 ,资源丰富 ,产量较大 ,具有清热解毒 、活血散瘀 、利尿消肿 、平肝明目的功能 ,民间广泛应用于临
床治疗黄疸型病毒性肝炎 、急慢性肾炎及肿瘤等疾病[ 1] .它含有多种三萜类化合物 , 其中乌索酸(Ursolic
acid)含量较高[ 2] ,为主要活性成分 ,并高于同科植物伞房花耳草中乌索酸的含量[ 3] .近来药理研究发现 ,乌
索酸具有抗肝炎 、抗肿瘤 、抗病毒 、抗炎抑菌及增强免疫等多种药理活性 ,具有重要的药用开发价值[ 4] .为
此 ,我们以黄毛耳草为原料 ,采用“醇提凝析法”分离提纯乌索酸[ 5 ,6] ,建立了 RP -HPLC 测定分析乌索酸含
量的方法.
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
熔点用 Boetius 显微熔点测定仪测定 ,温度计未经校正;旋光度用WZZ-1S 数字式自动旋光仪测定;红
外光谱用 PE公司 Spectrum One 傅立叶变换红外光谱仪测定;质谱用Autospec-Ultima ETOF EL 型质谱仪测
定;核磁共振用 INOVA-600型 、Brucker ACF -400型核磁共振仪测定 ,TMS为内标 , DMSO-d6 、CDCl3 为溶
剂;含量用Waters高效液相色谱仪测定 ,515型双泵 ,2996光电二极管矩阵检测器.
药材采自赣西地区宜春市袁州区 ,经本所天然药物研究室鉴定为茜草科耳草属植物黄毛耳草 Herba
Hedyotidis Corymbosae 的全草.
95%乙醇 ,食用级 ,广西糖厂产品;“YCXY-1号”除杂剂 ,自制;复合酶制剂 ,哈尔滨神农有限公司产品;
活性炭 ,分析纯 ,上海豪申化学试剂有限公司产品;乌索酸对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号
110742-200314).
1.2　乌索酸的分离提纯
采用“醇提凝析法”分离提纯.将干燥后的黄毛耳草 10 kg 粉碎成粗粉(20目),用温水湿润后 ,加入原料
干重 0.5%的复合酶制剂 ,于 38 ℃左右酶解处理后 ,用 7倍量 95 %的乙醇于 80 ℃回流提取 2次 ,每次 1 h ,
合并提取液 ,过滤 ,减压回收乙醇得浸膏 ,以纯水沉降洗涤后 ,加“YCXY-1号”除杂剂除杂处理 2次 ,过滤 ,
第 29 卷第 4期
2005 年 7 月　
江西师范大学学报(自然科学版)
JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)
Vol.29 No.4
　Jul.2005
DOI :10.16357/j.cnki.issn1000-5862.2005.04.019
用95 %乙醇溶解 ,调节 pH 值 ,加活性炭脱色 ,过滤除杂 ,再用 95 %乙醇溶解 ,调 pH 值 ,凝析分离 、纯化精
制 ,于 80 ℃下干燥 24 h ,得无色针状结晶乌索酸样品 36.5 g ,收率为 3.65 ‰.
1.3　色谱条件
色谱柱为SymmetryShield RP18柱(3.9 mm×150 mm ,5μm),检测波长 λ=210 nm ,流动相为甲醇-水(88∶
12), 流速为 1.0 mL/min , 柱温为 25 ℃.用外标法定量分析.
1.4　标准曲线的测定
精确称取乌索酸对照品9.8 mg ,置于 10 mL 容量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,制成含乌索酸
0.98 mg/mL 的对照品溶液.分别吸取乌索酸对照品溶液 4 ,8 ,12 ,16 ,20μL ,按 1.3项下色谱条件进样 ,平行测
定3次 ,求其峰面积的平均值得标准曲线.
1.5　样品溶液配制
精确称取乌索酸样品 9.6 mg ,置于 10 mL 容量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,溶液经 0.45 μm微
孔滤膜过滤后作为样品溶液.
2　结果与讨论
2.1　样品结构鉴定
样品为无色针状结晶 ,易溶于热乙醇 、热甲醇 ,可溶于乙醚 、醋酸乙酯 、乙醇 、甲醇 、丙酮 、氯仿等有机溶
剂 ,不溶于石油醚和水.[ α] D20+65(C0.095 , EtOH),熔点为 285 ～ 287 ℃,与乌索酸对照品混合熔点不下降.
IRKBrmax(cm-1):3 403(—OH);2 965 ,2 927 ,2 868(C—H);1 691(C O );1 456 , 1 386 ,1 377(CMM);1 031(C —
O).EI-MS(m/e):456(M+),441(M-CH3),438(M-H2O),423(M-CH3-H2O),411(M-COOH),410(M-H
-COOH).D 、E环离子 a(RDA裂解):248(a.100),203(a-COOH), 189(a-CH2-COOH),133;A 、B 环离子 b
(RDA裂解):208(b),207(b-H), 190(b-H2O)和 189(b-H2O-H).1 H-NMR(DMSO-d6)示 5个季碳甲
基:(δ0.68 、0.75 、0.87 、0.89 、1.04 ,各 3H , s);2个叔碳甲基(δ0.81 , J =6.2 Hz;δ0.91 , J =6.0Hz ,各3H , d);
C18(δ2.01 , J =11.4 Hz ,d);C3α-H(δ3.00 , J =11.0Hz ,5.2 Hz , 1H , td ,);C12-H(δ5.13 , J =3.5 Hz , 1H , t);
C15-H(δ1.00 , J =13.6 Hz ,1H ,brd);C16-H(δ1.93 , J =13.2 Hz ,4.0 Hz , 1H , td);C29-H(δ0.81 , J =6.2 Hz ,
3H ,d);C30-H (δ0.91 , J =6 Hz , 3H ,d).13 C-NMR(DMSO-d6)示 7个伯碳:δ28.3(C23), 16.1(C24), 15.2
(C25),17.0(C26),23.3(C27),16.9(C29),21.1(C30);9个仲碳:δ38.2(C1),27.0(C2),18.0(C6), 32.7(C7), 22.8
(C11),27.5(C15),23.8(C16),31.2(C21),36.3(C22);7个叔碳:δ76.8(C3),54.8(C5),47.9(C9), 124.6(C12),52.3
(C18),39.4(C19),38.5(C20);6个季碳:δ38.4(C4), 39.8(C8),36.5(C10),138.2(C13), 41.6(C14), 48.8(C17);
1个羧基碳:178.3(C28).
以上波谱数据与文献值一致[ 7 ,8] ,确证样品为乌索酸[ 9] .
2.2　HPLC分析乌索酸含量
2.2.1　色谱条件的确定　采用甲醇-水(88∶12)为流动相 ,配比简单 ,经济实用 ,出峰时间在 7.4 min左右
(柱温为 25 ℃),且分离度较好 ,达基线分离 ,同时流动相的 pH值为 5.4左右 ,符合色谱柱的要求.
2.2.2　测定波长的选择　取乌索酸对照品溶液 ,在 190 ～ 400 nm进行光谱扫描 ,流动相中乌索酸最大吸收
波长为 202.2 nm(图 1),但溶剂甲醇在短波长处均有吸收.为了减少干扰 ,并尽量不降低灵敏度 ,选择 210 nm
作为检测波长.
2.2.3　标准曲线 　以峰面积对样品进样量(μg)进行线性回归 ,得乌索酸回归方程为 Y =1.42 ×105X +
2.19 ×104 , R =0.999 8 ,表明当乌索酸进样量在 4.5 ～ 22.5μg 时 ,线性关系良好.乌索酸标准曲线见图 2.
2.2.4　精密度试验　精密吸取乌索酸对照品溶液 10 μL 进样 ,重复 5次 ,测得乌索酸峰面积 RSD为0.80%
(n =5).本法精密度良好.
2.2.5　重现性试验　精密称取同一批乌索酸样品 5份 ,按 1.5项下方法配制样品溶液 ,吸取 10 μL进样分
析 ,测得乌索酸峰面积 RSD为 1.12%(n=5).方法重现性好.
349第 4期 陈　武 , 等:黄毛耳草中乌索酸的分离提纯及 RP-HPLC 分析
2.2.6　乌索酸含量测定　吸取样品溶液 10 μL 进样分析 ,重复进样 5次 ,样品中乌索酸的含量为 99.82%.
乌索酸对照品及样品 HPLC色谱图见图 3.
图 1　乌索酸紫外光谱
图 2　乌索酸标准曲线
a.乌索酸对照品　　　　　　　　　　　　　　　　b.乌索酸样品
图 3　乌索酸对照品及样品 HPLC 色谱图
3　结论
(1)采用“醇提凝析法”从黄毛耳草中分离纯化乌索酸 ,仅以乙醇为溶剂 ,未加其它有机溶剂 ,采用自制的
“YCXY-1号”除杂剂 ,有效去除脂类 、类脂类 、酚类及叶绿素等杂质 ,不仅保证了产品无有害溶剂残留 ,提高
了安全性 ,而且简化了操作程序 ,降低了生产成本 ,有利于乌索酸的富集和纯化 ,其纯度达 99.82%,得率达
3.65‰.(2)本文建立的反相高效液相色谱定量分析乌索酸含量的方法 ,具有快速简便 、精密度高 、重现性好 、
线性范围宽的优点 ,可作为控制乌索酸产品质量的方法.
致谢:乌索酸的质谱 、核磁共振谱由中国海洋大学药物研究所李英霞教授代测.
参考文献:
[ 1] 江苏新医学院.中药大词典[ M] .上海:上海人民出版社.1977.2 069.
[ 2] 方乍浦 ,杨义芳.黄毛耳草化学成分的分离与鉴定[ J] .中国中药杂志 , 1992 , 17(2):98-100.
[ 3] 邹盛勤 , 陈武 , 李开泉 ,等.HPLC 法测定 30 种省产天然植物中乌索酸的含量[ J] .宜春学院学报 , 2004 , 26(2):1 ～ 3.
[ 4] 陈武 ,熊筱娟 , 李开泉 ,等.乌索酸药理作用研究[ J] .宜春学院学报 , 2003 , 25(4):1 ～ 4.
[ 5] 李开泉 ,陈武 , 叶文峰 ,等.陆英中乌索酸的分离与鉴定[ J] .宜春学院学报 , 2003 , 25(2):1 ～ 2. (下转第 362 页)
350 江西师范大学学报(自然科学版) 2005 年
参考文献:
[ 1] 阎炳宇.我国天然色素的现状及发展方针[ J] .精细与专用化学药品 , 1999 ,(9):8-9.
[ 2] 彭子模 , 惠寿年 , 李　进 , 等.玫瑰花色素及稳定性研究[ J] .西北植物学报 , 1999 , 19(2):349-353.
[ 3] 安黎哲 , 余　谦.草莓果实红色素理化特性的研究[ J] .西北植物学报 , 1994 , 14(6):116-121.
[ 4] 周家华 ,杨辉荣 , 黎碧娜 , 等.食品添加剂[ M] .北京:化学工业出版社 , 2001.83-84.
[ 5] 董世林.植物资源[ M] .哈尔滨:东北林业大学出版社 , 1994.202-203.
[ 6] 张　华 , 李景琳.食用天然色素的应用与发展趋势[ J] .天津农学院报 , 2001 , 8(2):18-21.
[ 7] 项　斌 , 高建荣.天然色素[M] .北京:化学工业出版社 , 2004.21-22.
[ 8] Thomas Glover , Kevin Mithchell.生物统计学导论[ M] .北京:清华大学出版社 , 2001.113-127.
Study on the Extraction Technology of Yellow
Pigments from Coreopsis Basalis
ZHU Du1 , 　XIA Jian-hui1 , 　ZHANG Li-geng1 , 　LIU Ru-long1 , 　CHENG Fei-biao2
(1.College of Life Science , Jiangxi Normal University , Nanchang 330027 , China;2.Jiangxi Science and Technology Normal Universi ty , Nanchang 330044 , China)
Abstract:The extraction technology of yellow pigments in Coreopsis basalis was studied by use of single factor test and
L16(45)orthogonal experiment design method in this paper.The experimental results indicated that the optimum condi-
tions were the extraction reagent 65% alcohol with pH 3 , twelve times of volume of extraction reagent as large as the
weight of Coreopsis basalis and extraction temperature at 50 ℃ for 5 hours.
Key words:yellow pigments;extraction technology;Coreopsis basalis (责任编辑:刘显亮)
(上接第 350 页)
[ 6] 李开泉 ,邹盛勤 , 陈武 ,等.陆英中乌索酸提取工艺的正交优选[ J] .中草药 , 2003 , 34(9):791-792.
[ 7] 丛浦珠.质谱学在天然有机化学中的应用[ M] .北京:科学出版社 , 1987.684-686.
[ 8] 彭师奇.药物的波谱解析[ M] .北京:北京医科大学 、中国协和医科大学联合出版社 , 1998.
[ 9] 中国海洋大学药物研究所.乌索酸的结构确证[ R] .分析检测报告 , 2003.1-3.
Preparation and HPLC Analysis of Ursolic Acid Separation from
Herba Hedyotidis Corymbosae
CHEN Wu1 , 　LUO Zhi-gang2 , 　ZOU Sheng-qin1 , 　LI Kai-quan1
(1.Bioengineering Research Institute , Yichun University , Yichun Jiangxi 336000 , China;
2.Department of Mechanical Engineering , Jinggangshan Vocational Technology Institute , Jian Jiangxi 343000 ,China)
Abstract:This paper explores adopting the method of ethanol extracting and agglutination separating to extract ursolic acid
from Herba Hedyotidis Corymbosae and using spectrum to identify its structure by IR , MS , NMR.A determination
method of ursolic acid in HerbaHedyotidis Corymbosae by reversed-phase high performance liquid chromtograph was es-
tablished.The chromatographic column , SymmetryShield RP18(3.9 mm×150 mm ,5 μm), methanol-water(88∶12 ,
V/ V)mobile phase with 1.0 mL/min flow rate , the detected wavelength (210 nm), and the column temperature(25
℃)were adopted.The calibration curve of ursolic acid was linear under the content of 4.5 ～ 22.5μg , the correlation
coefficient was over 0.999 8.The content is 99.82%by HPLC and the gain rate is 3.65‰.The method is simple , ac-
curate and has good repeatability and wider linear range.The method can be used to evaluate the quality of ursolic acid.
Key words:Herba Hedyotidis Corymbosae;ursolic acid;structural characteristics;HPLC (责任编辑:刘显亮)
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