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梵净山野百合组织培养研究



全 文 :收稿日期:2015-05-22
基金项目:贵州省科技厅联合基金项目(编号:黔科合J字LKT[2012]11号);梵净山特色动植物资源重点实验室资助项目(编号:黔教合KY[2011]
005号);贵州省教育厅“125”重大科技专项资助项目(编号:黔教合重大专项字[2012]018号),梵净山特色动植物资源保护与利用创新人
才团队(编号:黔教合人才团队字[2012]08号)。
作者简介:邱 岚(1982—),女(白族),贵州水城人;硕士,副教授,主要从事植物学、中学生物学教学等相关方面的研究工作;E-mail:512143257@qq.
com。
通迅作者:付素静(1980—),女(土家族),贵州思南人;硕士,副教授,主要从事花卉学、园林植物开发利用及相关科研工作;E-mail:fusujing_9973@
163.com。
梵净山野百合组织培养研究
邱 岚1,2, 付素静1,2, 李 艺1
(1.铜仁学院 生物与农林工程学院, 贵州 铜仁554300;
2.贵州省梵净山特色动植物资源重点实验室, 贵州 铜仁554300)
摘 要:以梵净山野百合鳞片为外植体,比较了不同激素种类及浓度对愈伤组织和不定芽诱导的影响,旨在建立野百合
鳞片组织培养再生体系。结果表明:最佳愈伤组织诱导培养基为 MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+NAA 0.1
mg/L,最佳不定芽诱导培养基为 MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L。
关键词: 梵净山;野百合;鳞片;组织培养
DOI编码: 10.16590/j.cnki.1001-4705.2015.10.039
中图分类号: S 644.1   文献标志码: A   文章编号: 1001-4705(2015)10-0039-05
Research on Tissue Culture of Lilium brownii from Fanjing Mountain
QIU Lan1,2,FU Sujing1,2,LI Yi 1
(1.Colege of Biology and A&F Engineering,Tongren University,Tongren Guizhou 554300,China;
2.Key Laboratory of Special Animal and Plant Resources in Fanjing Mountain,
Tongren Guizhou 554300,China)
Abstract:Effects of different hormone combinations on cali and bud proliferation of Lilium brownii
from Fanjing mountain were studied,using bulb scale as explants to develop an efficient regeneration
system.The result showed that the optimal medium for calus induction was MS medium supplemen-
ted with 1.0mg/L 6-BA,0.2mg/L 2,4-D and 0.1mg/L NAA.The suitable medium for buds was MS
medium supplemented with 0.5mg/L 6-BA,0.1mg/L 2,4-D and 0.1mg/L NAA.
Key words: fanjing mountain;Lilium brownii;bulb scale;tissue culture
  梵净山野百合(Lilium brownii)为百合科百合属
的多年生草本植物。鳞茎球形,叶散生,披针形,花单
生或几朵排成近伞形,花喇叭形,有香气,乳白色,无斑
点,向外张开或先端外弯而不卷,蒴果矩圆形,有棱,具
多数种子。花期5—6月,果期9—10月[1]。分布较
广,生山坡、灌木林下、路边、溪旁或石缝中。其鳞茎含
丰富淀粉,可食,亦作药用。同时百合也是世界著名的
观赏花卉,其适合于盆栽、庭院绿化,是重要的鲜切花
种类,现代百合栽培品种大都是野生百合杂交而来,有
的甚至就是自然界野生种的引种驯化栽培,所以研究
野生百合植物种质资源具有重要意义。
目前国内外关于百合的组织培养研究主要集中在
栽培种上[2-5],而对于野生种的研究较少[6-10]。野生植
物资源由于受到了各种自然灾害和不良环境的选择,
抗逆性较强。是大自然宝贵的基因库,体内保存着栽
培种不具有或已消失的特殊基因,而且许多野生百合
在其分布区内自然变种与生态型较多,所以是重要的
遗传育种材料。因此对野生百合种质的栽培研究既是
对当前梵净山珍贵种质资源的一种迁地保护,也可为
百合育种提供丰富的种质资源,从而对百合产业的持
续发展有着重要的意义。
  本研究采用正交设计筛选最佳的激素组合诱导野
百合愈伤组织和不定芽的发生,以期为规模化繁殖栽
培降低生产成本,以及梵净山野百合开发利用提供一
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研究报告  邱 岚 等:梵净山野百合组织培养研究
表2 不同消毒剂消毒时间对梵净山野百合消毒效果的比较
序号 消毒剂 外植体来源 接种数 浓度(%) 消毒时间(min) 污染率(%) 死亡率(%) 无菌率(%)
1 HgCl2 茎 10  0.1  6  60  40  0
2 HgCl2 茎 10  0.1  8  60  40  0
3 HgCl2 茎 10  0.1  10  40  60  0
4 HgCl2 叶 10  0.1  6  70  30  0
5 HgCl2 叶 10  0.1  8  50.0  50.0  0
6 HgCl2 叶 10  0.1  10  20  80  0
7 HgCl2 鳞片 10  0.1  6  80  0  20
8 HgCl2 鳞片 10  0.1  8  20  10  70
9 HgCl2 鳞片 10  0.1  10  20  50  30
  注:污染率(%)=污染数/接种数×100%;死亡率(%)=未污染但死亡的数量/接种数×100%;无菌率(%)=有生活力的无菌材料数/接种
数×100%;接种15d后统计。下同。
定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用材料百合全株于2014年4—5月采自梵
净山国家级自然保护区,经鉴定为野百合(Lilium
brownii)。实验所用试剂6-BA、2,4-D、NAA均购自
生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 外植体选取
供试材料以鳞片、叶片、茎段作为外植体。选取生
长健壮无病虫害的野百合植株,采取其上鳞片、叶片、
茎段,洗净表面的泥土及杂质,后于流水下冲洗2h,然
后放入无菌容器中,以待消毒。
1.2.2 外植体消毒
将清洗干净的外植体在75%的酒精中浸泡30s进
行表面灭菌,无菌水冲洗2~3次后用0.1%升汞溶液
消毒6~10min,灭菌完毕后用无菌水冲洗3~4次,然
后接种于基本培养基上,观察消毒时间长短对野百合不
同外植体灭菌效果的影响。将获得的无菌鳞片纵切后
接种到添加了不同浓度的6-BA、2,4-D、NAA的培养基
上,诱导愈伤组织和不定芽,每处理重复10次,具体实
验设计见表2。使用Olympus观察愈伤组织并拍照。
1.2.3 不同激素正交组合对愈伤组织和不定芽的
诱导
表1 正交试验L9(43)设计
水平
因素
A(6-BA)
(mg/L)
B(2,4-D)
(mg/L) C
(空列) D(NAA)(mg/L)
1  0.5  0.1  0.1
2  1.0  0.2  0.5
3  1.5  0.5  1.0
1.3 其他条件
MS为基本培养基,蔗糖3%,琼脂粉0.65%,pH值
5.8。温度25℃,光照12h/d,光照强度3 000lx[11]。
1.4 观察与统计
1.4.1 愈伤组织分化数
愈伤组织分化数即诱导出愈伤组织(大于0.5
cm×0.5cm)鳞片数。
1.4.2 平均不定芽诱导数
平均不定芽诱导数=诱导出直径大于0.3cm的
不定芽个数/接种鳞片总数。
1.5 数据分析
采用Excel、SPSS 19.0分析各数据之间的关系和
特征。
2 结果与分析
2.1 不同消毒剂消毒时间比较
对野百合不同外植体进行表面消毒采用不同的消
毒时间见表2所示,比较消毒效果。
  由于实验材料长期生长在野外,带菌严重,用茎、
叶作为外植体,容易被消毒剂杀死,且鳞片作为百合常
用的繁殖器官在0.1% HgCl2 消毒8min时,无菌率
可达70%。
2.2 不同激素组合对愈伤组织和不定芽诱导的影响
按照设计的正交试验组合,分别统计愈伤组织分
化个数、平均诱导不定芽数,结果见表3。由表4可
知,各因素对野百合愈伤组织诱导的影响主次顺序为:
D>B>A,即 NAA>2,4-D>6-BA,由表5可知:
6-BA、2,4-D、NAA均达到显著差异,其中 NAA对野
百合愈伤组织诱导影响最大。诱导梵净山野百合愈伤
组织的最佳条件为 A2B2D1,即培养基为 MS+6-BA
1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L。
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第34卷 第10期 2015年10月              种 子 (Seed)           Vol.34 No.10 Oct. 2015
表3 不同激素组合对梵净山野百合愈伤组织和不定芽诱导的影响
序号 培养基(mg/L)
接种数
(个)
愈伤组织
分化数(个)
平均诱导不
定芽数(个)
不定芽发
生部位
1 MS+6-BA 0.5+2,4-D 0.1+NAA 0.1  30  12  6.07 侧面和基部
2 MS+6-BA 0.5+2,4-D 0.2+NAA 0.5  30  10  4.67 基部
3 MS+6-BA 0.5+2,4-D 0.5+NAA 1.0  30  11  5.50 基部
4 MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.1+NAA 1.0  30  9  2.30 基部
5 MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.2+NAA 0.1  30  17  1.80 侧面和基部
6 MS+6-BA 1.0+2,4-D 0.5+NAA 0.5  30  8  2.00 侧面和基部
7 MS+6-BA 1.5+2,4-D 0.1+NAA 0.5  30  3  1.43 侧面和基部
8 MS+6-BA 1.5+2,4-D 0.2+NAA 1.0  30  11  1.20 侧面和基部
9 MS+6-BA 1.5+2,4-D 0.5+NAA 0.1  30  10  1.77 侧面和基部
  注:统计时间为培养20天后,所有鳞片经过纵切。
  各因素对百合不定芽诱导的影响主次顺序为:
A>B>D,即6-BA>2,4-D>NAA,由表5可知:6-BA
达到显著差异,对梵净山野百合不定芽诱导影响最大。
诱导梵净山野百合愈伤组织的最佳条件为A1B1D1,即
培养基为 MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.1mg/L+
NAA 0.1mg/L。
表4 正交实验结果及极差分析
实验号
      因 素           考查指标   
A  B  C(空列) D
愈伤组织
分化数(个)
平均诱导
不定芽数
1  1  1  1  1  12  6.07
2  1  2  2  2  10  4.67
3  1  3  3  3  11  5.50
4  2  1  2  3  9  2.30
5  2  2  3  1  17  1.80
6  2  3  1  2  8  2.00
7  3  1  3  2  3  1.43
8  3  2  1  3  11  1.20
9  3  3  2  1  10  1.77
K 11 11.000  8.000  10.333  13.000
K 12 11.333  12.667  9.667  7.000
K 13 8.000  9.667  10.333  10.333
R1 3.333  4.667  0.666  6.000
K 21 5.413  3.267  3.090  3.213
K 22 2.033  2.557  2.913  2.700
K 23 1.467  3.090  2.910  3.000
R2 3.946  0.710  0.180  0.513
表5 各因素方差分析
变异来源 自由度

愈伤组织分化数 平均诱导不定芽数
A  2  22.747* 60.013*
B  2  37.746* 3.885
D  2  60.992* 1.947
C(误差) 2  0.889  0.227
  注:F(0.05)(2,2)=19.00,F(0.01)(2,2)=99.00。
3 讨论与结论
3.1 讨 论
3.1.1 愈伤组织诱导
本实验得到诱导梵净山野百合愈伤组织的最佳条
件为 MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.2mg/L+NAA
0.1mg/L,从试验结果来看,NAA对野百合愈伤组织
诱导影响最大,NAA 作为一种生长素类激素,与
6-BA、2,4-D一起使用可以诱导愈伤组织,这与王爱勤
等[12]的研究结果一致,在本实验中,2,4-D对于愈伤
组织的诱导影响次于 NAA,且量较小,这与付文奇
等[13]对于同属植物东方百合的研究结果不一样,他们
认为,2,4-D浓度小于1mg/L时,外植体不能形成愈
伤组织。分析原因应该是本实验所取材料为野生种,
对各种激素很敏感,而付文奇等所取材料为栽培种,栽
培种在整个生长过程及亲本来源中不能排除使用各种
激素的可能,对各种激素的添加产生了抗性。
一部分经过纵切的野百合鳞片10d左右在伤口
处产生膨大的突起(见图版a),为浅黄绿色疏松的细
胞团,40d后细胞团面积增加到3cm2 以上(见图
版b),显微观察确定是一些不规则的大型薄壁细胞
(见图版c)。对该种细胞团切片制作临时装片进行显
微观察,发现细胞团有不同程度分化(见图版d),能够
看见胚状细胞即体胚发生,并且发现叶表皮细胞(见图
版e),说明已有细胞分化为叶片。
3.1.2 不同激素组合对不定芽诱导的影响
不定芽诱导的最佳培养基是 MS+6-BA 0.5
mg/L+2,4-D 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L,与愈伤组
织的诱导培养基相比2,4-D浓度更低,与付文奇等[13]
对东方百合的使用浓度(0.15mg/L)相似,在激素的
种类上,部分学者对东方百合的不定芽诱导研究未添加
·14·
研究报告  邱 岚 等:梵净山野百合组织培养研究
图版
2,4-D,6-BA和NAA的比值在10~30效果较好[14],
或者两种激素比值为1对于毛百合鳞片诱导不定芽有
很好的效果[15],说明百合属种类的组织培养不定芽的
诱导过程需要6-BA和 NAA参与调节,但属内种间的
差异比较大。
部分经过纵切的野百合鳞片培养10d左右在基
部和侧面形成光滑的突起(见图版f),20d左右长出叶
片,同时可见分化的新鳞片(见图版g)。将叶片剪切
后重新转接到 MS基本培养基中鳞茎增大,生长健壮
(见图版h)。
3.2 结 论
梵净山野百合的组织培养再生体系的建立宜选择
鳞片作为外植体,时间在4、5月份为宜,用0.1%
HgCl2消毒8min建立无菌体系。愈伤组织诱导最
佳培养基为 MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.2mg/L
+NAA 0.1mg/L,不定芽诱导的最佳培养基为 MS+
6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L。
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63-64.
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