全 文 ：第 26卷 第 6期
2004年 12月
宜春学院学报(自然科学)
Journal of Yichun University(natural science)
Vol.26 ,No.6
Dec.2004
伞房花耳草中乌索酸的提取与鉴定 (VI)＊
陈 武 , 邹盛勤 , 李开泉
(宜春学院生物工程研究所 , 江西 宜春 336000)
①
[摘 要] 目的:提取分离及鉴定伞房花耳草活性成分乌索酸.方法:用 “醇提凝析” 法提取
分离乌索酸 , 光谱鉴定其结构.结果:确证化合物为乌索酸 , HPLC 测定其含量为 99.58%,
得率 3.12‰.结论:提取分离方法实用可行 , 乌索酸纯度高 , 安全性好.
[关键词] 伞房花耳草;乌索酸;提取分离;结构鉴定
[中图分类号] R248.2 [文献标示码] A [文章编号] 1671-380X (2004)06-0001-03
Extracting and Identifying Ursolic Acid from Hedyotis Corymbosa Lam.
CHEN Wu , ZOU Sheng-qin , LI Kai-quan
(Institute of Biology , Yichun University , Yichun 336000 , Jiangxi)
Abstract:Objective:To extract , separate and identify ursolic acid in Hedyotis corymbosa Lam.Methods:Adopting the
method of ethanol extracting and agglutination separating to extract ursolic acid and using spectrum to identify its struc-
ture.Results:The compound is recognized to be ursolic acid , the content is 99.58% by HPLC , and the gain rate is
3.12‰.Conclusion:The method is practical and feasible.The purity of ursolic acid is high and the safety is good.
Key Words:Hedyotis corymbosa Lam;ursolic acid;extract and separate;structure identification
伞房花耳草 , 又名蛇舌草 、水线草 , 为茜草科
耳草属植物伞房花耳草 (Hedyotis corymbosa Lam.)
的干燥全草[ 1] , 在我国主要分布于南方各省 , 产量
较大 , 其药材性状与同科同属植物白花蛇舌草
(Hedyotis diffusa Willd.)相似.近年来 , 采用 HPLC
法 , 对江西盛产的 30 种天然植物中乌索酸的含量
进行了测定筛选 , 发现伞房花耳草中乌索酸的含量
高于白花蛇舌草 , 亦高于陆英[ 2] .为此 , 我们对伞
房花耳草中乌索酸进行了提取分离与鉴定研究.
1 仪器与试剂
熔点用 Boetius 显微熔点测定仪测定 , 温度未
校正;旋光度用WZZ-1S数字
式自动旋光仪测定;红外光谱用 PerkinElmer Spec-
trum One 傅立叶变换红外光谱仪测定;质谱用 Au-
tospec-Ultima ETOF EL 及 Magnet BPL 型质谱仪测
定;核磁用 INOVA-500型1H 及13C 核磁共振光谱
仪测定;含量用Waters-515型双泵高效液相色谱
仪 , 2996光电二极管矩阵检测器测定.
药材采自赣西地区宜春市袁州区 , 经本所天然
药物研究室鉴定为茜草科耳草属植物伞房花耳草
Hedyotis corymbosa Lam.的全草[ 2] .
95%乙醇 , 食用级为广西糖厂产品;“YCXY-
1号” 除杂剂为自制品;复合酶制剂为哈尔滨神农
有限公司产品;活性炭 , 分析纯为上海豪申化学试
剂有限公司产品;乌索酸对照品为中国药品生物制
品检定所产品 (批号 110742-200314).
2 提取分离
采用 “醇提凝析” 法提取分离[ 3] .将干燥后的
伞房花耳草 10kg 粉碎成粗粉 (20目), 用温水湿润
后 , 加入适量复合酶制剂 , 于 38℃左右酶解处理
后 , 用 7倍量 95%的乙醇 80℃回流提取 2次 , 每
次 1h , 合并提取液 , 过滤 , 减压回收乙醇得浸膏 ,
以纯水沉降洗涤后 , 加 “YCXY-1 号” 除杂剂除
杂处理 2 次 , 过滤 , 用 95%乙醇溶解 , 调节 pH
值 , 加活性炭脱色 , 过滤除杂 , 再用 95%乙醇溶
解 , 调 pH 值 , 凝析分离 、 纯化精制 , 80℃烘 24h ,
得无色针状结晶乌索酸 31.2g.
3 HPLC 测定样品含量
3.1 色谱条件:色谱柱为 SymmetryShield RP18 柱
(3.9×150mm , 5μm), 检测波长 210nm , 流动相为
·1·
① 收稿日期:2004-09-01
＊基金项目:国家 “ 863” 计划重点资助项目 (2002AA2Z3217).
作者简介:陈武 (1944-), 男 , 江西奉新人 , 大学本科 , 研究员 , 在国内外发表学术论文 96篇, 主要从事医药生物技术研究.
甲醇-水 (88∶12), 流速1.0ml/min , 柱温 25℃.用
外标法定量分析.
3.2 溶液的配制
3.2.1 对照品溶液:精确称取乌索酸对照品
9.8mg , 置于10ml容量瓶中 , 用甲醇溶解并稀释至
刻度 , 摇匀 , 制成含乌索酸 0.98mg/ml的对照品溶
液.
3.2.2 样品溶液:精确称取乌索酸样品 9.5mg ,
置于 10ml 容量瓶中 , 用甲醇溶解并稀释至刻度 ,
摇匀 , 溶液经 0.45μm 微孔滤膜过滤后作为样品溶
液.
3.3 线性关系 分别吸取乌索酸对照品溶液 4 、
8 、 12 、 16 、 20μl , 按 3.1项下色谱条件进样 , 测定
峰面积.以峰面积对样品进样量进行线性回归 , 得
乌索酸回归方程为:Y=1.42×105X +2.19×104 ,
R=0.9999 , 表明当乌索酸进样量在 3.9 ～ 19.6μg
之间时 , 线性关系良好.
3.4 精密度试验 精密吸取乌索酸对照品溶液
10μ进样 , 重复进样 5次 , 测得乌索酸峰面积 RSD
为0.32%(n=5), 表明仪器精密度良好.
3.5 样品含量测定 吸取样品溶液 10μl 进样分
析 , 重复进样 5次 , 测得样品中乌索酸平均含量为
99.58%.
4 样品结构鉴定
样品为无色针状结晶 , 易溶于热乙醇 、 热甲
醇 , 可溶于乙醚 、 醋酸乙酯 、 乙醇 、 甲醇 、 丙酮 、
氯仿等有机溶剂 , 不溶于石油醚和水 , 醋酐-浓硫
酸反应显紫红色 , 香英兰素 -硫酸反应呈紫色.
[α] D20+65°(C0.095 , EtOH), 熔点 285 ～ 287℃, 与
乌索酸对照品混合熔点不下降.元素分析计算值
(%):C78.92 , H10.58 , 实验值 (%):C79.05 ,
H11.10.分子式 C30 H48 O3.EI -MS (m/ z):456
(M+)、 441 (M-CH3)、 438 (M-H20)、 423 (M-
CH3 -H20)、 411 (M -COOH)、 410 (M -H -
COOH).D 、 E 环离子 a (C 环经 RDA 裂解):248
(a.100)、 203 (a -COOH)、 189 (a -CH2 -
COOH)、 133;A 、 B环离子 b (C环经 RDA裂解):
208 (b)、 207 (b-H)、 190 (b-H2O)和 189 (b
-H2O -H).IRKBrmaxυcm-1:3433 (-OH)、 2965 、
2927 、 2871 (C -H)、 1691 (C =O)、 1456 、 1384
(CH3)、 1031 (C-O).1 H-NMR (DMSO-d6)示
5个季碳甲基:(δ0.68 、 0.75 、 0.87 、 0.89 、 1.04 ,
各 3H , s);2 个叔碳甲基 (δ0.81 , J =6.2Hz;
0.91 , J =6.0Hz , 各 3H , d);C18 (δ2.01 , J =
11.4Hz , d);C3α-H (δ3.00 , J =11.0 , 5.2 ,
5.2Hz , 1H , td ,);C12 -H (δ5.13 , J =3.5Hz ,
1H , t);C15-H (δ1.00 , J =13.6 , 1H , brd);C16
-H (δ1.93 , J =13.2 , 4.0 , 1H , td);C29 -H
(δ0.81 , J =6.2Hz , 3H , d);C30 -H (δ0.91 , J =
6Hz , 3H , d).13 C-NMR (DMSO-d6)示 7个伯碳:
δ28.3 (C23)、 16.1 (C24)、 15.2 (C25)、 17.0
(C26)、 23.3 (C27)、 16.9 (C29)、 21.1 (C30);9 个
仲碳:δ38.2 (C1)、 27.0 (C2)、 18.0 (C6)、 32.7
(C7)、 22.8 (C11)、 27.5 (C15)、 23.8 (C16)、 31.2
(C21)、 36.3 (C22); 7 个叔碳:δ76.8 (C3)、
54.8 (C5)、 47.9 (C9)、 124.6 (C12)、 52.3 (C18)、
39.4 (C19)、 38.5 (C20);6 个季碳:δ38.4 (C4)、
39.8 (C8)、 36.5 (C10)、 138.2 (C13)、 41.6 (C14)、
48.8 (C17);1 个羧基碳:178.3 (C28).乌索酸结
构式见图 1.
图 1 乌索酸结构式
以上光谱数据与文献值一致[ 4～ 5] , 根据理化常
数和光谱数据确证样品为乌索酸[ 6] .
5 讨论
5.1 乌索酸属五环三萜类化合物 , 具有抗肝炎 、
抗肿瘤 、 抗菌消炎 、降血糖血脂 、增强免疫功能等
多种药理活性 , 且毒性小 , 副作用少 , 在医药保
健 、 日用化工及功能食品等行业有重要的应用开发
价值 , 成为当前国内外研究开发的热点.乌索酸在
植物界分布虽较广泛 , 但其含量较低 , 提取分离难
度大 , 当前尚未实现人工合成.目前国内外常采用
Al2O3 、 硅胶 、 聚酰胺等柱层析法进行提取分
离[ 7～ 11] , 需使用石油醚 、 氯仿 、 乙酸乙酯 、 正丁
醇 、 甲醇 、环己烷等有机溶剂萃取 、 洗脱 , 不但提
取工艺复杂 , 而且分离量小 、 溶剂消耗大 、 成本
高 、 安全性差 , 难以实现工业化生产.本工艺以伞
房花耳草为原料 , 采取 “醇提凝析法” 提取分离乌
索酸 , 仅以乙醇为溶剂 , 未加其它有机溶剂 , 采用
·2·
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自制的 “YCXY-1 号” 除杂剂 , 有效去除脂类 、
类脂类 、 酚类及叶绿素等杂质 , 不仅保证了产品无
有毒有害溶剂残留 , 提高了安全性 , 而且有利于乌
索酸的富集和纯化.
5.2 为了提高原料药材的利用率 , 简化工艺程序 ,
本工艺采用复合酶制剂对原料进行酶解处理 , 一方
面促使乌索酸及其苷与植物细胞壁脱离 , 加速乌索
酸及其苷的充分释放 , 并使乌索酸苷转化为苷元 ,
另一方面将一些可水解的脂类 、类脂类等杂质转化
为小分子水溶性物质.经上述酶解处理的原料用乙
醇提取 , 所得浸膏加纯水沉降洗涤 2 次后 , 用
“YCXY-1号” 除杂剂进一步除去脂类 、酚类 、黄
酮类等杂质.提取物以乙醇溶解 , 加活性炭脱色 ,
经凝析分离 、纯化精制 , 烘干 , 即得无色针状结晶
乌索酸 , 其纯度达 99.58%, 得率 3.12‰.
5.3 调节控制pH值是本工艺技术的关键环节 , 对
脱色除杂 、 凝析分离 、 产品质量及得率有较大影
响.经反复试验结果表明 , 提取物脱色除杂时 , 应
将pH值调为 9左右 , 使乌索酸形成钠盐 , 过滤除
杂后 , 再将 pH值调为 2左右 , 使乌索酸钠盐转化
为乌索酸 , 这是工艺过程中应注意控制的重要技术
参数.
5.4 伞房花耳草药材性状与同科同属植物白花蛇
舌草相似 , 经调查及文献记载 , 全国几乎多数地区
使用的白花蛇舌草实为伞房花耳草 , 或者两者混在
一起使用 , 民间广泛应用于临床治疗急慢性病毒性
肝炎 、急慢性肾炎 、 肿瘤 、慢性盆腔炎 、疟疾 、 肠
炎 、烫伤等疾病[ 12～ 13] , 这可能与含有乌索酸 、齐
墩果酸 、甾醇 、 生物碱及黄酮类等[ 13]多种活性成
分有关.
(致谢:乌索酸的质谱 、核磁共振光谱由中国
海洋大学药物研究所李英霞教授代测)
参考文献
[ 1]干国平 ,段木盛 ,张义生 ,等.HPLC测定伞房花
耳草中齐墩果酸和熊果酸的含量 [ J] .中国药学杂
志 , 2003 ,38(3):233-234.
[ 2] 邹盛勤 , 陈武 ,李开泉 ,等.HPLC法测定 30种
省产天然植物中乌索酸的含量[ J].宜春学院学报 ,
2004 ,26(2):1-3.
[ 3] 李开泉 ,陈武 , 叶文峰 , 等.陆英中乌索酸的分
离与鉴定[ J].宜春学院学报 ,2003 ,25(2):1-2.
[ 4] 丛浦珠.质谱学在天然有机化学中的应用[M] .
北京 ,科学出版社 , 1987 , 684-686.
[ 5] 彭师奇.药物的波谱解析[M].北京 , 北京医科
大学 、中国协和医科大学联合出版社 , 1998.
[ 6] 中国海洋大学药物研究所.乌索酸的结构确证
[ R] ,分析检测报告 ,2003 , 1-3.
[ 7] 陈芳群.委陵菜化学成分的研究[ J].华西药学
杂志 ,1989 ,4(1):6-8.
[ 8] 方乍浦 ,杨义芳.黄毛耳草化学成分的分离与
鉴定[ J] .中国中药杂志 ,1992 ,17(2):98-100.
[ 9] 许强.乌索酸提取方法介绍[ J] .中国中药杂
志 ,1989 ,14(3):41-43.
[ 10] 何心亮 ,王风云 ,吴维群.山楂中熊果酸的分
离提取及含量测定[ J].中成药 ,1988 ,9(8):30-32.
[ 11] 任冬梅 ,袁久荣.岩青兰化学成分的研究[ J] .
中草药 ,1997 ,28(2):74-76.
[ 12] 范榕 ,谢敏.白花蛇舌草与伞房花耳草的鉴别
[ J].海峡药学 ,1995 ,7(1):77-78.
[ 13] 江苏新医学院编.中药大辞典[ M] .上海 ,上
海人民出版社 ,1977 ,535.
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