全 文 ：文章编号:1674 － 5566(2016)05 － 0692 － 08 DOI:10． 12024 / jsou． 20160301716
温度对一株耐高氨氮绿球藻生长及油脂特性的影响
收稿日期:2016-03-29 修回日期:2016-05-06
基金项目:上海市科技兴农项目(沪农科推字(2013)第 2 － 1 号);上海市科技兴农项目(沪农科攻字(2015)第 1 － 2 号);国家海洋
局项目(SHME2011SW02);水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心项目(ZF1206)
作者简介:穆亮亮(1991—)，男，硕士研究生，研究方向为水产动物营养与生物饵料。E-mail:190458130@ qq． com
通信作者:黄旭雄，E-mail:xxhuang@ shou． edu． cn
穆亮亮
1，黄旭雄
1，2，3，蔡 敬
1，危立坤
1
(1． 上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306;2． 上海市水产养殖工程技术研究中心，上海
201306;3． 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306)
摘 要:利用耐污微藻净化污水并耦合微藻生物柴油生产是当前微藻开发应用的热点。探讨了不同培养温
度(20、25、30、35 和 40 ℃)对一株耐高氨氮绿球藻(Chlorococcum sp．)生长及细胞油脂特性的影响。初始接种
密度为 300 × 104 cells /mL，培养周期为 7 d。结果表明:培养温度对绿球藻的生长具有显著影响，随着温度的
升高，绿球藻的细胞密度和生物量呈现先上升后下降的变化，其峰值均在 35 ℃，分别为 3 604 × 104 cells /mL
和 0． 92 g /L。对采收的藻细胞脂肪蓄积及特性分析表明，藻细胞的油脂含量和油脂产量随着温度的升高先上
升后下降，其峰值也出现在 35 ℃，分别为 23． 67%和 21． 65 mg /L。随着培养温度的升高，藻细胞的饱和脂肪
酸含量先升高后降低，而多不饱和脂肪酸则持续下降。从微藻生长并耦合生物柴油生产的角度考虑，该耐高
氨氮绿球藻株的适宜培养温度为 30 ～ 35 ℃。
关键词:绿球藻;温度;生长;总脂;脂肪酸;生物柴油
中图分类号:Q 948． 1 文献标志码:A
微藻是自然界中重要的初级生产者，具有种
类多、繁殖快、含有多种生物活性物质等特点，极
具开发潜力［1］。将微藻用于废水处理是当今研
究的热点，ABOU-SHANAB 等［2］研究了 6 种微藻
在处理猪场废水及耦合生物柴油生产的效果，发
现墨西哥衣藻(Chlamydomonas mexicana)可获得
的生物量干重最大，为(0． 56 ± 0． 35)dwt /L，对氮
磷的去除效率也最高，分别为 62%和 28%，ZHU
等［3］发现小球藻(Chlorella zofingiensis)在稀释后
COD浓度为 1 900 mg / L 的猪场废水中生长最
好，此时对污水中养分的去除率、生物量、油脂含
量和生物柴油产量均达到最大，邱昌恩等［4］得出
一株绿球藻正常生长的氮浓度范围为 0． 015 ～
0． 150 g /L，且可耐受高氮环境，有望用于对氮、磷
污水的处理。温度是影响藻类生长和生化组成
的重要因子，一般认为温度变化主要影响与光合
作用有关酶的活性及光合作用过程，微藻对温度
的适应范围较宽，但不同微藻对温度的耐受能力
不同［5 － 6］。华雪铭等［7］发现绿色巴夫藻(Pavlova
viridis)适宜的生长温度为 30 ℃，此时总脂含量也
最大，但 35 ℃ 则不能生长。潘瑾等［8］得出在
10 ～ 30 ℃范围内，随温度的升高，三角褐指藻
(Phaeodactylum tricornutum)的藻细胞密度和
C16∶ 0 含量呈先上升后下降的趋势，均在 20 ℃时
最高。本实验研究了温度对一株从猪场沼液中
新分离的耐高氨氮绿球藻生长和油脂特性的影
响，为后续该株绿球藻用于猪场沼液净化及藻细
胞开发利用奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 藻株的来源
实验藻株分离自浙江嘉兴余新镇敦好农牧
科技有限公司沼液发酵池，并在实验室进行纯
化，分离时沼液的氨氮浓度为 305 mg /L，经显微
镜鉴定为绿球藻属(Chlorococcum sp．)。
5 期 穆亮亮，等:温度对一株耐高氨氮绿球藻生长及油脂特性的影响
1． 2 适宜培养温度的筛选
实验设 5 个温度梯度，分别为 20、25、30、35
和 40 ℃，采用 1 000 mL三角烧瓶作为培养容器。
采用补充了有机氮源(复合氨基酸，350mg /L)的
f /2 淡水培养液作为培养基，经 121 ℃高压灭菌
20 min后用于实验。取处于指数增长期的绿球
藻藻种，4 ℃离心(6 000 r /min)10 min，去上清，
藻泥用蒸馏水溶解后再次离心去上清，将藻泥接
种到培养基中，初始接种密度为 300 × 104 cells /
mL。每温度设 3 个平行。实验在三温区光照培
养箱中进行。光周期为 24 L ∶ 0 D，光照强度为
2 500 lx，每天定时摇瓶 3 次，试验进行 7 d。
1． 3 藻细胞密度和生物量的测定
1． 3． 1 藻细胞密度的测定
培养过程中采用血球计数板计数法每天检
测藻细胞密度，每个样数 3 块板，取平均值，并求
算比生长率(K)。
K =(lnNt － lnN0)/ t (1)
式中:N0 为培养初始藻细胞密度(cells /mL);Nt
为经过 t 时间后培养液中的藻细胞密度(cells /
mL);t为培养时间(d)。
1． 3． 2 生物量的测定
培养结束后，每组取 100 mL 藻液经预先恒
重过的 0． 45 μm微孔滤膜抽滤，置于鼓风干燥箱
中 105 ℃烘至恒重，计算生物量干重(B)。
B(g /L)=(W1 －W0)/V (2)
式中:W0 为预恒重过的 0． 45 μm 微孔滤膜的重
量;W1 为恒重过后 0． 45 μm 微孔滤膜的藻泥的
总重量;V为抽滤的藻液体积。
1． 4 总脂和脂肪酸组成的测定
1． 4． 1 总脂的测定
培养结束时，取足量藻液离心，再用蒸馏水
清洗离心，收集的藻泥于 － 46 ℃下冷冻干燥，得
到的藻粉用于测定总脂含量。
总脂含量的测定采用氯仿-甲醇法［9］。精确
称取藻粉 0． 1 ～ 0． 2 g(W0)至 50 mL的锥形瓶内。
加 30 mL含 0． 01% BHT 的氯仿-甲醇混合液［V
(氯仿)∶ V(甲醇)= 2∶ 1］，在 4 ℃冰箱中浸提 24
h，期间用超声波破碎仪在冰浴中破碎两次，每次
30 min。然后将浸提液过滤至预恒重的 50 mL的
锥形瓶(W1)中，加 10 mL 0． 88% KCl溶液后立即
充分震荡混合，静置 30 min 以待分层，用吸管吸
去上层液(无色略呈白色乳状);然后沿壁缓慢加
入 10 mL 50%甲醇，弃上层液，下层氯仿层(绿
色)即含脂层。将锥形瓶置于真空干燥箱中，40
℃真空干燥后恒重(W2)。计算总脂含量和总脂
产量。
总脂含量(% DW)= ［(W2 － W1)/W0］ ×
100% (3)
总脂产量(g /L)=总脂含量(% DW)×生物
量干重(g /L) (4)
1． 4． 2 脂肪酸组成的测定
参照 GＲIFFITHS 等方法［10］，脂肪酸组成测
定采用直接甲酯化法。采收一定体积藻液 4 ℃
离心(5 000 r /min，3 min)获得藻泥(约 50 ～ 100
mg)，将藻泥转入带硅胶衬里螺旋帽的 15 mL 棕
色螺纹口顶空瓶中，加入 500 μL 十九烷酸-甲苯
溶液(浓度 0． 2 mg /mL)，漩涡混匀后，加 2 mL 甲
醇钠(NaOMe，0． 5 mol /L)，置超声波清洗机中 80
℃水浴混匀 20 min，冷却至室温后，加 2 mL BF3-
甲醇溶液(Sigma)，再置超声波清洗机中 80 ℃水
浴混匀 20 min，冷却至室温后，加 800 μL 去离子
水和 1 200 μL 正己烷，漩涡混匀后，4 000 r /min
离心 3 min，将上层含有脂肪酸甲酯的正己烷-甲
苯层经 0． 22 μm针头式过滤器过滤至 2 mL广口
样瓶中，于气相-质谱联用仪上参照黄旭雄等［11］
检测脂肪酸含量。利用峰面积归一化法确定各
脂肪酸的相对百分含量。某一种脂肪酸甲酯相
对含量为某一种脂肪酸甲酯的峰面积与总脂肪
酸甲酯的峰面积的比值。
1． 5 生物柴油品质的测算
通过前人建立的脂肪酸甲酯分子结构和组
成与生物柴油品质指标(运动粘度、碘值、十六烷
值和冷滤点)的关系模型，预测并评价该株绿球
藻生物柴油是否可以作为柴油的替代燃料。具
体参数定义及预测模型公式如下:
预测模型的 3 个参数定义:
相对链长［12］ (Ｒelative chain length)L =
∑Ni × Pi
皂化值［13］(Saponification value，mgKOH /g)
SN =∑(560 × Pi)/MWi
长碳链饱和指数［14］(Long chain saturated
factor)LCSF = 0． 1 × Pc16:0 + 0． 5 × Pc18:0 + 1． 5 ×
Pc22:0 + 2 × Pc24:0
3 个指标的预测模型公式:
运动粘度［12］(Viscosity，mm2 /s)Vis =
396
上 海 海 洋 大 学 学 报 25 卷
－ 1． 729 95 + 0． 312 47 × L + 0． 042 28 × Pc22:1
碘值［13］(Iodine value，gI2 /100 g)IV =∑(254
×m × Pi)/MWi
十六烷值［15］(Cetane number)CN = 46． 3 +
5458 /SN － 0． 225 × IV
式中:i表示某种脂肪酸甲酯;N 表示脂肪酸甲酯
的碳链数;m表示脂肪酸甲酯的双键数;P 表示脂
肪酸甲酯的相对百分含量(%总脂肪酸甲酯);
MW表示脂肪酸甲酯的分子量。
1． 6 数据处理与分析
每组样品的所有指标均平行测定 3 次，测定
结果以平均值 ±标准差(Mean ± SD)表示。试验
数据用 PASW． Statistics18． 0 软件进行 ANOVA 单
因子方差分析，若 P ＜ 0． 05，则作 Duncan’s 多重
比较。
2 结果
2． 1 温度对绿球藻细胞密度和生物量的影响
绿球藻在 20 ～ 40 ℃均能正常生长，随着温
度的升高绿球藻的细胞密度和生物量先上升后
下降，均在 35 ℃达到最高，分别为 3 604 × 104
cells /mL和 0． 915 g /L。培养至第 7 天，20、25、
30、35 和 40 ℃组相对生长率分别为 0． 29、0． 31、
0． 34、0． 35 和 0． 32，35 ℃组相对生长率显著高于
其他组(P ＜ 0． 05)，且 35 ℃组较其他组提前进入
静止期，第 5 天以后该组藻细胞密度保持不变。
40 ℃组与 25 ℃ 组相对生长率无显著性差异
(P ＞ 0． 05)，但生物量 40 ℃组显著高于 25 ℃组
(P ＜ 0． 05)。对不同培养温度下的藻细胞密度回
归分析，得 y = －7． 605x2 +497．42x －4 721． 3(Ｒ2 =
0． 879 3)，由回归方程得该株绿球藻的最适生长
温度为 32． 7 ℃(图 1 － 2)。
2． 2 温度对绿球藻油脂积累的影响
随着温度的升高绿球藻总脂含量和总脂产
量均先上升后下降，30 ℃组和 35 ℃组的总脂含
量分别为 22． 68%和 23． 67%，二者无显著性差异
(P ＞ 0． 05)，但均显著高于其他各试验组(P ＜
0． 05)。各试验组的总脂产量差异显著(P ＜
0． 05)，35 ℃组总脂产量最高，为 21． 65 mg /L，各
试验组按总脂产量高低排序:35 ℃ ＞ 30 ℃ ＞ 40
℃ ＞25 ℃ ＞20 ℃。对不同培养温度下的总脂含
量回归分析，得 y = － 0． 037 6 x2 + 2 ． 505 3 x －
19． 065(Ｒ2 = 0． 850 4)，由回归方程获得最高总脂
含量的培养温度为 33． 3 ℃。对不同培养温度下
的总脂产量进行回归分析，得 y = － 0． 045 3x2 +
3． 090 5x － 33． 959(Ｒ2 = 0． 769 6)，由回归方程获
得最高总脂产量的培养温度为 34． 11 ℃(图 3)。
图 1 不同温度下绿球藻的细胞密度变化
Fig． 1 Variation of cell density of Chlorococcum sp．
cultured at different temperature
图 2 不同温度下绿球藻的生物量
Fig． 2 Biomass concentrations of Chlorococcum sp．
at different temperature
不同小写字母表示生物量差异显著(P ＜ 0． 05)。
Different small letters mean significant differences among the
treatments(P ＜ 0． 05)．
图 3 不同温度下绿球藻的总脂含量和总脂产量
Fig． 3 Total lipid contents and total lipid yield of
Chlorococcum sp． at different temperature
不同小写字母表示总脂含量差异显著(P ＜ 0． 05)，不同大写字母
表示总脂产量差异显著(P ＜ 0． 05)。
Different small letters for total lipid contents and different capital
letters for total lipid yield mean significant differences among the
treatments(P ＜ 0． 05)，respectively．
496
5 期 穆亮亮，等:温度对一株耐高氨氮绿球藻生长及油脂特性的影响
2． 3 温度对绿球藻脂肪酸特性及生物柴油品质
的影响
C16 和 C18 系列脂肪酸是该株绿球藻的主
要脂肪酸，二者总和占整个脂肪酸的 85． 56% ～
92． 32%，以棕榈酸(C16:0)和亚油酸(C18:2n6)
含量最多。随温度的升高，C16:0 的含量先上升
后下降，在 35 ℃时最高，为 28． 37%;C18:3n3(亚
麻酸)含量则不断降低，由 20． 02%降为 4． 30%;
饱和脂肪酸(SFA)的含量先上升后下降，35 ℃时
SFA 含量最高，为 41． 90%;单不饱和脂肪酸
(MUFA)呈波浪式变化，在 40 ℃ 时最高，为
19． 26%;多不饱和脂肪酸(PUFA)含量不断下
降，从 60． 93%降为 44． 85%(表 1)。
表 1 不同温度下绿球藻的脂肪酸组成(%总脂肪酸)
Tab． 1 Fatty acids profile(% total fatty acids)of Chlorococcum sp． at different temperature
脂肪酸
fatty acids
温度 /℃ temperature
20 25 30 35 40
C12:0 0． 47 ± 0． 03 0． 48 ± 0． 01 － － －
C14:0 0． 97 ± 0． 02c 1． 10 ± 0． 02b 1． 28 ± 0． 02a 1． 06 ± 0． 03b 0． 57 ± 0． 02d
C15:0 2． 09 ± 0． 06e 2． 40 ± 0． 09d 4． 06 ± 0． 06a 3． 27 ± 0． 13c 3． 84 ± 0． 18a
C16:0 20． 92 ± 0． 07d 22． 95 ± 0． 11c 24． 25 ± 0． 31b 28． 37 ± 0． 28a 22． 34 ± 1． 21c
C16:1n7 3． 03 ± 0． 05b 2． 45 ± 0． 01c 3． 42 ± 0． 11b 3． 36 ± 0． 12b 4． 08 ± 0． 58a
C17:0 － － 1． 38 ± 0． 15b 1． 12 ± 0． 14b 4． 37 ± 0． 68a
C16:2n6 11． 62 ± 0． 15d 15． 09 ± 0． 22bc 16． 69 ± 0． 47a 14． 51 ± 0． 11c 15． 64 ± 1． 04b
C17:1n7 4． 09 ± 0． 23b 3． 87 ± 0． 14b 3． 59 ± 0． 08b 2． 85 ± 0． 02c 5． 67 ± 0． 86a
C18:0 1． 16 ± 0． 06d 2． 00 ± 0． 03c 4． 59 ± 0． 46b 8． 08 ± 0． 18a 4． 78 ± 0． 41b
C16:3n3 6． 99 ± 0． 01a 3． 99 ± 0． 04b 1． 22 ± 0． 06c 0． 93 ± 0． 07d 0． 50 ± 0． 04d
C18:1n9 6． 28 ± 0． 11c 6． 12 ± 0． 14c 7． 19 ± 0． 21b 7． 68 ± 0． 30b 9． 51 ± 0． 62a
C18:2n6 22． 30 ± 0． 42c 27． 91 ± 0． 16a 24． 52 ± 0． 41b 22． 97 ± 0． 40c 24． 42 ± 0． 85b
C18:3n3 20． 02 ± 0． 34a 11． 65 ± 0． 06b 7． 80 ± 0． 32c 5． 84 ± 0． 23d 4． 30 ± 1． 30e
∑C16 42． 56 ± 0． 12d 44． 48 ± 0． 14c 45． 58 ± 0． 13b 47． 16 ± 0． 22a 42． 56 ± 0． 89d
∑C18 49． 76 ± 0． 17a 47． 67 ± 0． 14b 44． 10 ± 0． 17c 44． 57 ± 0． 26c 43． 00 ± 1． 14d
∑C16 + 18 92． 32 ± 0． 26a 92． 15 ± 0． 25a 89． 67 ± 0． 15b 91． 73 ± 0． 04a 85． 56 ± 1． 71c
SFA 25． 61 ± 0． 16d 28． 93 ± 0． 13c 35． 55 ± 0． 98b 41． 90 ± 0． 45a 35． 91 ± 1． 59b
MUFA 13． 39 ± 0． 39bc 12． 43 ± 0． 25c 14． 20 ± 0． 28b 13． 89 ± 0． 43b 19． 26 ± 1． 25a
PUFA 60． 93 ± 0． 49a 58． 64 ± 0． 36a 50． 23 ± 1． 18b 44． 24 ± 0． 31c 44． 85 ± 2． 82c
注:同一行上标的不同小写字母表示差异性显著(P ＜ 0． 05)，表 2 同。
Note:Different lowercase letters in the same row of each treatment denote significant differences(P ＜ 0． 05)the same in fig． 2．
随着温度的升高，运动粘度各组之间变化不
大;十六烷值不断增大，35 ℃和 40 ℃时最高，分
别为 51． 55 和 50． 65;碘值则是先下降后升高，35
℃时最低，为 97． 64 gI2 /100 g(表 2)。
表 2 不同温度下绿球藻的生物柴油品质
Tab． 2 Quality items of biodiesel from Chlorococcum sp． at different temperature
品质指标
quality items
温度 /℃ temperature
20 25 30 35 40
运动粘度(Vis，mm2 /s) 3． 88 ± 0a 3． 87 ± 0b 3． 85 ± 0d 3． 86 ± 0c 3． 87 ± 0b
碘值(IV，gI2 /100 g) 145． 08 ± 0． 7a 130． 02 ± 0． 45b 110． 77 ± 2． 22c 97． 64 ± 0． 37d 101． 84 ± 5． 12d
十六烷值(CN) 40． 93 ± 0． 16d 44． 27 ± 0． 1cd 48． 57 ± 0． 5bd 51． 55 ± 0． 07ad 50． 65 ± 1． 14ad
3 讨论
温度是影响微藻生长的重要因素，高于或低
于其适宜生长范围，均会显著降低其生长率［6，16］。
曾蓓蓓对绿球藻 SHOU-F93 和绿球藻 SHOU-
F124 的研究表明，两株绿球藻的最适生长温度分
别为 19． 3 ℃和 24． 3 ℃［17］。本试验中，该株绿球
藻在 20 ～ 40 ℃之间都能较好地生长，若以生物
量为评价指标，经回归分析得该株绿球藻的最适
生长温度为 32． 7 ℃，其最适生长温度和对高温
596
上 海 海 洋 大 学 学 报 25 卷
的耐受性均较曾蓓蓓等［17］报道的两种绿球藻高，
推测是由于藻株的来源不同而引起的。鉴于该
株绿球藻属于典型的广温性耐高温藻株，因此可
在室外光生物反应器中大规模培养。周连宁
等［18］认为温度对微藻生长的影响主要通过影响
酶的活性和营养物质的运输实现，温度较低时，
细胞膜的运输和呼吸功能会受到影响，生长速率
较慢;但随着温度的上升，酶活性不断增强，生长
速率也不断加快;温度过高时，可能会破坏细胞
和酶的活性，导致生长速率降低甚至出现负增
长。而 BEＲＲY 等［19］则认为高温抑制微藻生长
主要与叶绿体有关，在植物的所有代谢过程中，
叶绿体的光合作用被认为是对高温胁迫最敏感
的，当植物的叶子或藻类受到高温胁迫时，它们
的放氧、碳同化和光合磷酸化活性均显著下降。
高温胁迫可导致捕光色素复合体同光系统Ⅱ(PS
Ⅱ)的反应中心分离进而致使类囊体膜解垛
叠［20］，还可导致捕光色素复合体的结构发生变
化［21］，放氧复合体的活性丧失［22］，以及从 QA 到
QB的电子传递受抑制［23 － 24］。
早期研究表明，在极端高温或低温条件下，
微藻合成脂肪的量减少［25］。OPUTE等［26］认为存
在脂肪合成的最适温度，且因种而异，在极端温
度下合成受限可能是相关酶发生不可逆损伤所
致。丁彦聪等［27］研究了温度对小球藻细胞内叶
绿素荧光参数的影响，结果表明温度过高会使活
性反应中心的数量下降，进而捕获和用于电子传
递的能量减少，造成油脂积累量下降。周连宁
等［18］和张桂艳等［28］得出小球藻 Chlorella sp．
XQ-200419 和 Chlorella vulgaris 的油脂含量随温
度升高均先上升后下降，二者最适油脂积累温度
分别为 35 ℃和 25 ℃。本试验中，随着温度的升
高，绿球藻的总脂含量和总脂产量先上升后下
降，均在 35 ℃时达到最高，分别为 23． 67% 和
21． 65 mg /L。回归分析表明，获得该绿球藻藻株
最高总脂含量和最大油脂产量的培养温度分别
为 33． 30 ℃和 34． 11 ℃。40 ℃下，总脂含量和总
脂产量仍处于较高水平，说明 40 ℃并不能使参
与脂质合成的酶失活，只能使其活性较 35 ℃稍
有下降。
COHEN等［29］和曹春晖等［30］认为是不同温
度下的不同生长状况导致了某些藻类脂肪酸组
成的差异，且不饱和脂肪酸合成过程中的碳链延
伸酶活性、去饱和酶的活性和去饱和酶基因的转
录活性也与温度有关;VIGH 等［31］认为，低温之
所以能增加多不饱和脂肪酸含量是由于去饱和
酶基因收到来自细胞膜上特异温度感应器的信
号的原因。SKAMOTO 等［32］研究发现，当培养温
度由 34 ℃降至 22 ℃，Synechococcus PCC7002 去
饱和酶 B基因表达量增加了 10 倍;郑亚君等［33］
研究了温度对杜氏盐藻生长和脂肪酸组成的影
响，结果表明:杜氏盐藻的脂肪酸以 C16 和 C18
为主，随着培养温度的升高，藻株内饱和脂肪酸
和单不饱和脂肪酸所占比例增加，多不饱和脂肪
酸所占比例减少。本试验中，该株绿球藻的脂肪
酸以 C16 和 C18 为主，二者总量最高可达
92． 32%。随着温度的升高，高不饱和脂肪酸的含
量逐渐降低，与此同时，亚麻酸(C18:3n3)含量也
由 20． 02%降至 4． 30%，表明多不饱和脂肪酸的
降低主要是由亚麻酸的降低引起的;饱和脂肪酸
的含量先上升后下降，在 35 ℃时达到最高(41．
90%)，而棕榈酸(C16∶ 0)的含量也是先上升后下
降，在 35 ℃时达到最高，表明棕榈酸的变化导致
了饱和脂肪酸含量的变化。而这也符合前人的
研究结果:温度降低时，为了保证细胞膜的流动
性，细胞内不饱和脂肪酸含量会上升［34］，相反地，
温度升高时，为了保证细胞膜的完整性，饱和脂
肪酸的含量会上升［35］。
HAＲＲINGTON 等［36］研究表明，柴油的替代
品应该具有 C16 ～ C19 的链长，碳链较长可以保
证有较高的沸点，有利于安全储运、运输和使用，
但过长会导致熔点过高而引起流动性和低温性
能变差。本试验中，绿球藻的脂肪酸以 C16 和
C18 为主，在适宜范围内。十六烷值(CN)表示柴
油燃料的点火时间和燃烧性能，是衡量柴油品质
的重要指标。CN 一般在 47 ～ 60 为宜，CN 过高
会导致燃料与空气未经适宜混合就予以燃烧而
导致燃烧不完全并产生黑烟，CN 太小则燃料点
火困难，不易启动并导致发动机爆震［11，37］。生物
柴油的 CN主要是由于原料油中 C16:0 和 C18:0
两种饱和脂肪酸的含量决定的［38］。本试验中，随
着温度的升高，CN 从 40． 93 升高至 51． 55，但只
有 30 ℃(48． 57)、35 ℃(51． 55)和 40 ℃(50． 65)
组的 CN 在 47 ～ 60 范围内，符合生物柴油的标
准。运动粘度是液体流动时内摩檫力的量度，其
值随温度升高而降低，是衡量燃料流动性能及雾
696
5 期 穆亮亮，等:温度对一株耐高氨氮绿球藻生长及油脂特性的影响
化性能的指标，轻质柴油适宜的运动粘度为
1． 9 ～ 6． 0 mm2 /s［39］。本试验中，各试验组运动粘
度变化不大，在 3． 85 mm2 /s 左右，均符合生物柴
油品质标准。碘值是对油脂分子碳链不饱和度的
度量，指每100 g油脂吸收碘的克数，碘值高，十六
烷值低，冷滤点低，碳链不饱和程度越高则碘值
越高。本试验中，20 ℃组绿球藻脂肪酸的不饱和
程度最高，其对应碘值最大，为 145，但不符合欧
盟和德国的生物柴油品质标准，而 30 ℃(110． 77
gI2 /100 g)、35 ℃ (97． 64 gI2 /100 g)和 40 ℃
(101． 84 gI2 /100 g)组都符合标准。
表 3 不同国家生物柴油标准的品质指标
Tab． 3 Quality items of biodiesel standards of different countries
品质指标
quality items
美国 欧盟 德国 中国
ASTMD6751—2003 EN14214—2002 DIN51606—1997 GB /T20828—2007
运动粘度(Vis，mm2 /s) 1． 6 ～ 9． 0 3． 5 ～ 5． 0 3． 5 ～ 5． 0 1． 6 ～ 9． 0
碘值(IV，gI2 /100 g) － ≤120 ≤115 －
十六烷值(CN) 47 － 65 ≥51 ≥49 ≥49
综上所述，考虑到该高耐氨绿球藻藻株的生
长性能、油脂含量、油脂产量和达到生物柴油品
质标准，建议 30 ～ 35 ℃为该藻株适宜的培养温
度。
参考文献:
［1］ ＲAWAT I，KUMAＲ Ｒ Ｒ，MUTANDA T，et al． Biodiesel
from microalgae:a critical evaluation from laboratory to large
scale production［J］． Applied Energy，2013，103:444 －
467．
［2］ ABOU-SHANAB Ｒ A I，JI M K，KIM H C，et al． Microalgal
species growing on piggery wastewater as a valuable candidate
for nutrient removal and biodiesel production［J］． Journal of
Environmental Management，2013，115:257 － 264．
［3］ ZHU L D，WANG Z M，SHU Q，et al． Nutrient removal and
biodiesel production by integration of freshwater algae
cultivation with piggery wastewater treatment［J］． Water
Ｒesearch，2013，47(13):4294 － 4302．
［4］ 邱昌恩，况琪军，刘国祥，等． 不同氮浓度对绿球藻生长
及生理特性的影响［J］． 中国环境科学，2005，25(4):
408 － 411．
QIU C E，KUANG Q J，LIU G X，et al． Influence of
different nitrogen concentrations on the growth and
physiological characteristics of Chlorococcum sp．［J］． China
Environmental Science，2005，25(4) :408 － 411．
［5］ ＲAVEN J A，GEIDEＲ Ｒ J． Temperature and algal growth
［J］． The New Phytologist，1988，110(4) :441 － 461．
［6］ 蒋汉明，翟静，张媛英，等． 温度对海洋微藻生长及脂肪
酸组成的影响［J］． 食品研究与开发，2005，26(6):9 －
12．
JIANG H M，ZHAI J，ZHANG Y Y，et al． Influences of
temperature on the growth and fatty acid composition in
marine microalgae［J］． Food Ｒesearch and Development，
2005，26(6) :9 － 12．
［7］ 华雪铭，周洪琪，丁卓平． 温度和光照对微藻的生长、总
脂肪含量及脂肪酸组成的影响［J］． 上海水产大学学报，
1999，8(4):309 － 315．
HUANG X M，ZHOU H Q，DING Z P． Effect of temperature
and illumination on the microalgae s growth，total lipid and
fatty acid composition［J］． Journal of Shanghai Fisheries
University，1999，8(4) :309 － 315．
［8］ 潘瑾，俞建中，马晓磊，等． 温度影响三角褐指藻生长和
脂肪酸组成的初步探讨［J］． 渔业科学进展，2010，31
(6):90 － 94．
PAN J，YU J Z，MA X L，et al． Effect of temperature on the
growth and fatty acid composition of Phaeodactylum
tricornutum［J］． Progress in Fishery Sciences，2010，31
(6) :90 － 94．
［9］ FOLCH J M S，LEES M M，STANLEY G H S． A simple
method for the isolation and purification of total lipid from
animal tissue［J］． Journal of the Science of Food and
Agriculture，1957，22(1) :24 － 36．
［10］ GＲIFFITHS M J，VAN HILLE Ｒ P，HAＲＲISON S T L．
Selection of direct transesterification as the preferred method
for assay of fatty acid content of microalgae［J］． Lipids，
2010，45(11) :1053 － 1060．
［11］ HUANG X X，WEI L K，HUANG Z Z，et al． Effect of high
ferric ion concentrations on total lipids and lipid
characteristics of Tetraselmis subcordiformis，Nannochloropsis
oculata and Pavlova viridis ［J］． Journal of Applied
Phycology，2014，26(1) :105 － 114．
［12］ 段敏． 小球藻油制备生物柴油的试验和优化工艺研究
［D］． 杭州:浙江大学，2011．
DUAN M． Optimization of biodiesel preparation from
Chlorella oil［D］． Hangzhou:Zhejiang University，2011．
［13］ KALAYASIＲI P，JEYASHOKE N，KＲISNANGKUＲA K．
Survey of seed oils for use as diesel fuels［J］． Journal of the
American Oil Chemists’Society，1996，73(4):471 － 474．
［14］ ＲAMOS M J，FEＲNNDEZ C M，CASAS A， et al．
796
上 海 海 洋 大 学 学 报 25 卷
Influence of fatty acid composition of raw materials on
biodiesel properties［J］． Bioresource Technology，2009，100
(1):261 － 268．
［15］ KＲISNANGKUＲA K． A simple method for estimation of
cetane index of vegetable oil methyl esters［J］． Journal of the
American Oil Chemists Society，1986，63(4) :552 － 553．
［16］ UGWU C U，AOYAGI H，UCHIYAMA H． Influence of
irradiance，dissolved oxygen concentration，and temperature
on the growth of Chlorella sorokiniana［J］． Photosynthetica，
2007，45(2) :309 － 311．
［17］ 曾蓓蓓，黄旭雄，危立坤，等． 4 株淡水微藻的适宜温度、
光照强度及其细胞组成［J］． 上海海洋大学学报，2014，
23(6):856 － 862．
ZENG B B，HUANG X X，WEI L K，et al． The suitable
culture temperature， light intensity for four freshwater
microalgae and analysis on cellular biochemical compositions
［J］． Journal of Shanghai Ocean University，2014，23(6) :
856 － 862．
［18］ 周连宁，王波，吴锋，等． 培养条件对小球藻生长及油脂
积累的影响研究［J］． 生物学杂志，2015，32(3):46 －
50．
ZHOU L N，WANG B，WU F，et al． The impact of different
culture conditions on the chlorella’s growth and fat
accumulation［J］． Journal of Biology，2015，32(3) :46 －
50．
［19］ BEＲＲY J，BJＲKAMAN O． Photosynthetic response and
adaptation to temperature in higher plants［J］． Annual
Ｒeview of Plant Physiology，2003，31:491 － 543．
［20］ AＲMOND P A， BJＲKMAN O， STAEHELIN L A．
Dissociation of supramolecular complexes in chloroplast
membranes． A manifestation of heat damage to the
photosynthetic apparatus［J］． Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Biomembranes，1980，601(3) :433-443．
［21］ SＲIVASTAVA A，GUISS B，GＲEPPIN H，et al． Ｒegulation of
antenna structure and electron transport in Photosystem II of
Pisum sativum under elevated temperature probed by the fast
polyphasic chlorophyll a fluorescence transient:OKJIP［J］．
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics，1997，
1320(1) :95 － 106．
［22］ YAMANE Y，KASHINO Y，KOIKE H，et al． Effects of high
temperatures on the photosynthetic systems in spinach:
oxygen-evolving activities， fluorescence characteristics and
the denaturation process［J］． Photosynthesis Ｒesearch，
1998，57(1) :51-59．
［23］ CAO J，GOVINDJEE． Chlorophyll a fluorescence transient as
an indicator of active and inactive photosystem Ⅱ in
thylakoid membranes［J］． Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Bioenergetics，1990，1015(2) :180-188．
［24］ 武宝玕，韩志国，藏汝波． 热胁对海洋红藻及绿藻叶绿素
荧光的影响［J］． 暨南大学学报(自然科学与医学版)，
2002，23(1) :108 － 112．
WU B G，HAN Z G，ZANG Ｒ B． Effects of heat stress in
marine red and green algae by chlorophyll fluorescence
method［J］． Journal of Jinan University (Natural Science ＆
Medicine Edition) ，2002，23(1) :108 － 112．
［25］ AＲONSON S． Effect of incubation temperature on the
macromolecular and lipid content of the phytoflagellate
Ochromonas danica［J］． Journal of Phycology，1973，9(1) :
111 － 113．
［26］ OPUTE F I． Studies on fat accumulation in Nitzschia palea
Kütz［J］． Annals of Botany，1974，38(157) :889 － 902．
［27］ 丁彦聪，高群，刘家尧，等． 环境因子对小球藻生长的影
响及高产油培养条件的优化［J］． 生态学报，2011，31
(18):5307 － 5315．
DING Y C，GAO Q，LIU J Y，et al． Effect of environmental
factors on growth of Chlorella sp． and optimization of culture
conditions for high oil production［J］． Acta Ecologica Sinica，
2011，31(18) :5307 － 5315．
［28］ 张桂艳，温小斌，梁芳，等． 重要理化因子对小球藻生长
和油脂产量的影响［J］． 生态学报，2011，31(8):2076 －
2085．
ZHANG G Y，WEN X B，LANG F，et al． The effects of
physical and chemical factors on the growth and lipid
production of Chlorella［J］． Acta Ecologica Sinica，2011，31
(8) :2076 － 2085．
［29］ COHEN Z， VONSHAK A， ＲICHMOND A． Effect of
environmental conditions on fatty acid composition of the red
alga Porphyridium cruentum:correlation to growth rate［J］．
Journal of Phycology，1988，24(3) :328 － 332．
［30］ 曹春晖，孙世春，麦康森，等． 温度对四株海洋绿藻总脂
含量和脂肪酸组成的影响［J］． 海湖盐与化工，2006，35
(3):16 － 18．
CAO C H，SUN S Y，MAI K S，et al． Effect of temperature
on the total lipid contents and fatty acid composition of 4
strains of marine green algae［J］． Sea-Lake Salt ＆ Chemical
Industry，2006，35(3) :16 － 18．
［31］ VIGH L，LOS D A，HOＲVTH I，et al． The primary signal
in the biological perception of temperature:Pd-catalyzed
hydrogenation of membrane lipids stimulated the expression of
the desA gene in Synechocystis PCC6803［J］． Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of
America，1993，90(19) :9090-9094．
［32］ SAKAMOTO T，HIGASHI S，WADA H， et al． Low-
temperature-induced desaturation of fatty acids and
expression of desaturase genes in the cyanobacterium
synechococcus sp． PCC 7002［J］． FEMS Microbiology
Letters，1997，152(2) :313 － 320．
［33］ 郑亚君，王翠红，许萌萌，等． 温度对杜氏藻生长和脂肪
酸组成的影响［J］． 山西大学学报(自然科学版)，2011，
34(S2) :123 － 126．
ZHENG Y J，WANG C H，XU M M，et al． Effects of
temperature on growth and fatty acid composition of Dunaliella
salina［J］． Journal of Shanxi University (Natural Science
Edition) ，2011，34(S2) :123 － 126．
896
5 期 穆亮亮，等:温度对一株耐高氨氮绿球藻生长及油脂特性的影响
［34］ LOS D A． MUＲATA N． Membrane fluidity and its roles in
the perception of environmental signals［J］． Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes，2004，1666(1 /
2):142 － 157．
［35］ JIANG Y，CHEN F． Effects of temperature and temperature
shift on docosahexaenoic acid production by the marine
microalge Crypthecodinium cohnii ［J］． Journal of the
American Oil Chemists’Society，2000，77(6) :613 － 617．
［36］ HAＲＲINGTON K J． Chemical and physical properties of
vegetable oil esters and their effect on diesel fuel performance
［J］． Biomass，1986，9(1) :1 － 17．
［37］ KNOTHE G，VAN GEＲPEN J，KＲAHL J． The Biodiesel
Handbook［M］． Champaign，Illinois:CＲC Press，2005．
［38］ KNOTHE G，MATHEAUS A C，ＲYAN III T W． Cetane
numbers of branched and straight-chain fatty esters
determined in an ignition quality tester［J］． Fuel，2003，82
(8) :971 － 975．
［39］ 梅帅，赵凤敏，曹有福，等． 三种小球藻生物柴油品质指
标评价［J］． 农业工程学报，2013，29(15):229 － 235．
MEI S，ZHAO F M，CAO Y F，et al． Evaluation of quality
items for biodiesel made from three kinds of Chlorella vulgaris
［J］． Transactions of the Chinese Society of Agricultural
Engineering，2013，29(15) :229 － 235．
The effect of temperature on the growth and lipid characteristics of a high
amonia tolerant microalgae，Chlorococcum sp．
MU Liangliang1，HUANG Xuxiong1，2，3，CAI Jing1，WEI Likun1
(1． Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Ｒesources，Shanghai Ocean University，Ministry of Agriculture，Shanghai
201306，China;2． Shanghai Engineering Ｒesearch Center of Aquaculture，Shanghai 201306，China;3． Aquatic Animal
Genetic Breeding Center Collaborative Innovation Center in Shanghai，Shanghai 201306，China)
Abstract:Sewage purification by microalgae coupled with microalgal biodiesel production is the highlight of
the microalgae technology． This paper studied the growth and lipid characteristics of a high ammonia tolerant
microalgae，Chlorococcum sp．，which was cultured at 20，25，30，35 and 40 ℃ respectively for 7 days． The
initial inoculation density was 300 × 104 cells /mL． The result showed that the growth performance of
Chlorococcum sp． was affected significantly by culture temperature． The cell density and biomass first
increased then decreased along with the increasing temperature． The peaks of cell density and biomass were
3 604 × 104 cells /mL and 0． 92 g /L respectively，which appeared at 35 ℃ ． The analysis on lipid
characteristics of the biomass revealed that the lipid content and lipid yield also first increased，then decreased
along with the increasing temperature． The peaks of lipid content and lipid yield appeared at 35 ℃ and were
23． 67% and 21． 65 mg /L respectively． The saturated fatty acid content in microalgae first increased，then
decreased while the poly-unsaturated fatty acid content always decreased along with the increasing
temperature． It is therefore suggested that 30 － 35 ℃ is the suitable culture temperature for Chlorococcum sp．
cultivation．
Key words:Chlorococcum sp．;temperature;growth;total lipid;fatty acid;biodiesel
996