全 文 ：第 3期第鹅急
1, 9 0年 5月
新 江 大 学 学 报 ( 自然科学版 》
J o u r n a l o全 Z场 j i a n g U n i v e r s i t y ( N a t u r a一 s e i en c e )
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绿球藻 T C 品系提取液促进
鼠肝癌细胞的生长 *
钱 凯 先
(浙江大学生物科学与技术系 )
G o r d o n H
.
S a t o
(美国W . A l t o n Jo n e s C e l l S e i e n c e C e n t e r )
以长期热诱导建立了一种绿球藻之C h l o r o e o e e u m i n f u s i o u 川 )的嗜温品系 , 简称 C T C S 。
在 P B (S 磷酸缓冲液 )中的 C T C S细胞提取液明显促进H 。 肝癌细胞株在D M E培养基和。 . 5 % F S B
(胎牛血清 )中的生长。 当C T C S提取液蛋白质浓度为 1 2 . 4微克 /毫升时 , 可使 H `肝癌细胞数量 在
6 天中比对照 (不加 C T C S提取液 )增加 12 . 5倍`。
关健词 : 绿球藻 T C品系 , 肝癌细胞 , 生长因子
O 前 言
这项研究的锲机是我们在加利福尼亚南部沙漠中以嗜温藻类品系作为蛋白质生产的一系
列研究时 ( 钱凯先 、 as ot , 1 984 ) 担心这些品系可能的毒性 。 我们采用动物细胞培养来检测
藻类提取液的毒性 , 并惊奇地发现在几种动物细胞株的培养中 , 某些藻类蛋白质提取液可刺
激它们的生长 。 为了确切探测嗜温藻类品系的这种生长因子活性 , 我们把藻类培养于动物细
胞培养基中加以选择 , 以进一步在半固体培养基上进行混合细胞培养试验和筛选分泌生长因
子的藻类 。
1 材料和方法
1
.
1 C T C S的建立
从加利福尼亚南部 aS l t o n ic yt 温泉中采集的藻类团块里分离出几种藻类细胞 , 其 中 有
一种是单细胞的水溪绿球藻 ( C h l or oc oc c u m i n ur : io u m ) 。 先将其分散地接种在琼脂 平 板
上形成许多群落 , 然后把所有细胞移入含有 10 % E B s 的 D M E培养液中置于 37 七和 20 o 0 L u x 光
照 ( 日光灯 ) 条件下进行无菌培养 。 10 天之后 , 大部分绿球藻细胞漂白死亡 , 那些少量存活
的细胞则用毛细吸管逐一分离出来并接入新鲜培养液中继续培养 。 以后每周照此筛选和更换
*本文研究是在美国W . A l t o n oJ n e s C e l l S e i e n e e C c n t e r进行和完成的。
本文于 1 989 年 3月 8 日收到
第3 期 . 钱凯先等 :绿球藻 丁 c品 系提取液促进 鼠肝疾细地的生长 , 35 7
培养液一次。 暗养容器是塑料细 胞 培 养 瓶
( F al c on )
。 如此反复培养六个月以上 , 获得
了一种能在动物细胞培养液中稳定生长繁殖
的嗜温绿球藻品系 , 我们称之为绿球藻cT 品
系 ( C T C s )。 C T C S的生长速率如下 : (图 1 ) 。
C T c S被培养于 D M E / 10 % F B s 培养液 、
3 7℃和 Zo 0 0 L u X 光强条件下 , 经 6夭生长繁
殖 , 细胞数量从 2 . 6 x i o 4 /m l 增加 到 2 . 6 x
1 0 “ nI/ l
。
C cT S也可以在下列无机培养液中生长 :
在每升蒸馏水中含 ( N H ` ) : 5 0 ` 0 . 2 9 、
K : H P O ; 0
.
0 3 9
、
M g SO
` · 7H : 0 0
.
0 89
、
N即任C O : 0 . 3 0 9 、 K C I 0 . 0 2 5 9 、 C a C I : 0 . 0 19
和 1 滴 1 % F e c l 。 溶液 。
1
.
2 扫描电子显橄镇观察
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2 3
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时间 (天 》
图 1 C T C S的生长曲线
将cT c S细胞收集于孔径为 0
.
2 微米的硝化纤维滤纸上 , 用 pH 7 . 4的缓冲液 ( 0 . IM 二 甲
肿酸钠 + 。 . 05 % C a C I : · ZH : O )冲洗几次 。 在 4℃用含 2 . 5%戊二醛的相同缓冲液固定 4小时 ,
接着在室温下用 1 % 四氧化饿再固定 2 小时 。 用梯度浓度的乙醇逐级 脱水 (J ac k so n a n d
s hi n
, 198 2 )
, 然后 , 用 1 0 % 乙醇作为中间液 , C o : 作为移动流 , 使细胞进行临界点干燥 。 在
D e sk 一 1 喷镀器中将细胞喷镀金膜 , 以 15 k V的A M R A Y 1 2 0O型扫描电子显微镜进行观察。
野生型水溪绿球藻的形态是光滑的卵球形 , 长轴约 10 微米 , 短轴约 7 微米 。 C T C s 的形
态有明显变化 , 在细胞长轴的两端各长出一个直径约 1 微米的球状突起 。
1
.
3 C CT
S提取液
在指数生长期时 , 用离心取出 10 毫克鲜重的C T C s细胞并置于匀浆器中 , 加入 10 毫 升
p B S和 0 . 5克金钢砂粉 ( 1 0 0目 ) , 在冰浴中匀浆 3 0分钟 。 在 4℃以 i s 0 0 0 r p m离心 1 小时 。 取出
上清液 , 用 0 . 2 微米硝化纤维滤膜进行超滤而获得无菌的 C T C s提取液 。 随之测定其蛋白 质
含量 。
1
.
4 肝痛细胞的培养和试验
大鼠月 `肝癌细胞 株 ( H盯 。 t e · 1 9 8弓)培养于 D M E ( D u l b e e e o , 5 M o d i f i e d E a g l e 培养基 ,
iG cb o) 中, 并加入 10 % F B S 。 在本文试验中以 DM E + 。 . 5% F B S作为对照培养 液 , 因 为 H `
肝癌细胞在这种对照培养液中仅仅只有非常微弱的生长 。
图多表明了 H `肝癌细胞在含不同浓度 F B s 的 DM s中培养 6 天的生长速率。 显然 , 当E B s
为0 . 5%时 , H 4肝癌细胞数几乎保持恒定 。
肝癌细胞培养于六联的币3 5m m塑料培养皿中 ( F a l 。 。 n ) , 置于 C 。 : 自动 培 养 箱 ( v w R
m o d e l 1 7 2 0 ) , 温度为 3 7 oC 士 0 . 0 1 , 相对湿度 9 5% , C o : 浓度为 5% 。
H
; 肝癌细胞在培养皿底面贴壁生长成单层细胞 , 用 0 . 25 %胰蛋白酶 ( D i f c o) 处理使其 均
匀悬浮 。 然后以 z B I C o u l t e r c o u n t e r 自动计数细胞数 。 试验时 , 用 DM E / 0 . 5% F B S培养液
3 5 8浙 江 大 学 学 报 ( 自然科学版 )1 9 90 午
0 9的7
0 6 一日\ 专
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配制密度为0 .5 、1 x0 1 4 m /l的细胞悬液 ,
分别移入六联仍 s m m培养皿 , 每皿 中为 2
毫升 。 然后分别加入不同体积的 C T C S 提取
液 , 使 C T C S蛋白质浓度分别 为 1 . 03 、 12 . 40
吓m/ 1。 用未加入 cT c S 提取液的一组作为
对照 。 经 6天培养后 , 进行细胞数量的自动
计数 。
本文试验均系无菌操作 。
1
.
S C T C S蛋白质洲定
采用 L o w r y 等的方法 ( 1 9 5 1 ) 。 F o l i n 一
酚试剂购自S i gm a 化学公司 。
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2 试验结果
生长因子 ( g r o w t h f a e t o r )是一类蛋白
质或多肤激素 , 在细胞培养中能促进动物或
人体细胞的生长 。 生长因子的分子结构和性
质完全不同于植物激素这类小分子物质 。 由
于藻类是植物细胞 , C T C S 可能也会存在植
物生长素 。 为了探明植物生长素对 H` 肝 癌
细胞生长的影响 , 我们对一些有代表性的植
物生长素进行了 试验 。
图 3说明了色胺和叫噪 一 3 一 乙酸 (I A A )
对 H ` 肝癌细胞生长的影响 。 虽然这些植 物
生长素能活跃促进许多植物细胞的核糖核酸
和蛋白质合成 ( R i e h a r d M . K一e i n等 , 1 9 70 ) ,
但 H `肝癌细胞在 10 ~ 20 0拜g / m l 浓度的色胺
或 I A A中经 6 天培养 , 细胞数量均无变化 。
以上试验结果证明了植物生长素 对 H `
肝癌细胞的生长不起作用 。 因此 , 我们可以
排除 c T C s中可能存在的这类物质对 H `肝癌
细胞的作用 。 也就是说 , 我们可以不考虑在
C T C S 中是否存在植物生长素这个因素 。
0 2 2 3 ` 5 6 -
时间 (天〕
图 Z H ` 肝癌细胞在含有不同浓度 F B S的
D M E培养液中的生长速率
▲为 2 0% F S B ; ; 为 I C% F B S ; 万为 5% F B S ;
O为 2% F B S ; O为 1% F B S ; * 为 0 . 5% F B S ;
△为 0 . 2% F B S 。
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1 0 5 0
一冬勿;致辛 ( 毯了二、 、
图 3 植物生长素对H ; 肝癌细胞生长的
影响
图中曲线表示经 6 天培养后 , H ;肝癌细胞的数量 。
件为 D M E / 0 . 5% F B S + 色胺 ; ▲为D M E /0 . 5%
F B S + I A A
。
进而 , 我们对一些不同的藻类分别以其提取液对H 4肝癌细胞进行了试 验 。 结 果 , 野 生
型绿球藻 、 螺旋藻 、 石著、 马尾藻和石花菜的提取液均不表现出任何影响 , 而唯独 C T C S 提
取液对 H ` 肝癌细胞的生长具有明显的促进作用 。 当C T C S提取液的加入 量 为 1 . 24 、 3 . 1。、
导. 20 、 9 . 30 和 1 2 . 4 0拼g / m l蛋白质时 , 经 6 天培养 , H 4肝癌细胞的数量分别从 o . s x l o 名个m/ 1
第 3 期 钱凯 先等: 绿球藻 T C 品 系提取液促进鼠肝癌细 胞的生长势 3 59
增加到 2 . 3 6 X i o ` 、 ’ 2 . 7 o X l o 4 、 5 . 3工x l o 4 、 9 . 4 0 丫 1 0 4 和 i Z . s 4 x i o `个m/ l。 卜 而 未 加
CT cs 提取液帅对照组仅从 0 . 8 父 10 `个 / m l增加到1 . 2 6 x 10 `个加 1。 显然 , 当加入 C T C S提取
液蛋白质为 1“ · 4。“ gm/ l时 , 可使H `肝癌细胞数量在 “ 天中比对照增加 1 “ · 5倩, 其细胞 数 量
倍增时间接近 24小时。 在 C T C s提取液蛋 白质浓度在 12 . 4 0 ; g /m l范围内 , 其对 H `肝癌细胞生
长的促进作用随蛋 白质林度的增加而增大 ( 图 4 及图 5 ) 。
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一日\令己工x裁理斑、
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。 议4 拟 0 6 . 2 0 9 . 30 12 , 4 0
C T C S 蛋自质 ( , g加 1)
图 4 不同量的 C T C S提取浓蛋白质对H `
肝癌细胞生长的影响。
图中均为培养 6天后的细胞数。 其中, 纵坐标上
的数量是未加C T C S提取液的对照组。
0 2 4 6
、
时间`天】
图 S H ` 肝癌细胞在不同量 C T C S
蛋白质中的生长曲线
图中 : 巴为 1 . 24 1` g/ m t C T C S蛋白质 ; ▲为
6 2 0协幻 m l ; 介为 12 . 4 0p g /m l 。
试验开始时 , 经胰蛋 白酶处理而分散悬浮的 H ` 肝癌细胞逐渐沉降和附着到培养皿底 面 ,
然后开始贴壁生长 , 逐步形成成纤维细胞状的细胞单层 。 从试验第 6天摄取的细胞生长显微
相片来比较 , 当加入不同量 C T C S提取液蛋白质时 , H `肝癌细胞贴壁生长扩展的速度具有 极
大的差别 ( 图 a6 、 d6 ) 。 对照 组的 H `肝癌细胞只有微小的生长扩展 (图 a6 ) , 当 C T C S蛋 白质
为 1 . 2 4拼g /m l时 , 细胞的生长扩展比对照快 , 已呈现出对细胞生长的促进 作 用 ( 图 6b ) , 而
cT c s蛋白质分别为 6
.
2。; g /m l和 1 2 . 4 。; g /m l时 , 细胞生长扩展速度很快 , 各细胞扩展 区 域
( a) 对照 (不加 C T C S提取液 ) ( b ) C T CS蛋白质 : 1 . 2 4夕g / m早
36 0
}
浙 江 大 学 学 报 (自然扦学版 )19 9 0丰
( e )T C C S蛋白质 :6 . 2 0拼 g / ml。 (d )CT C S蛋白质 :22. 4环 g /l m。图 6
正在或者已经汇合 , 分别接近形成和形成了整片的细胞生长单层 。 这清楚地证明了 C T C s 提
取液对 H `肝癌细胞生长的明显促进作用 。
图 a6 一 d6 , 加入不同量 C T c s提取液蛋 白质经 6 天培养后 , H 4肝癌细胞的生长扩展显微
相片 ( N i e o n倒置显微镜 ) 。
在以上试验结果上 , 我们用不同孔径的透析薄膜管对 C T C s 提取液逐级进行了分子量截
留 , 进而进行对 H `肝癌缅胞生长影响的试验 。 结果发现分子量 > 3 5。 o的组分与未经 透 析 的
提取液对 H ` 肝癌细胞具有相似的生长促进活性 , 分子量 > 6 0 0 0~ 8 0 0 0的组分,. 其这 种 活性
大大降低 , 而分子量 > 1 4 0 0 0的组分活性更低 ( 图 7 ) 。
图 7 中的试验所使用的 C T C s提取液蛋白质浓度均为 6 , 2 0拼g / m l , 细胞数是在 培养 4 天
后测定的 `。 从细胞数量 的 增 长 可 以 证 明
C T c s提取液中对 H ; 肝癌细胞具有促进生长
活性的组分是 分子量为 3 5 0 0 ` 8 0 0 0的分子 。
3 讨 论
l
一,
\今己闷火粼魏职本文试验结果证明 C T C S 提取液能明显
促进大鼠H `肝癌细胞的生长 。 这种活 性 在
野生型绿球藻和其它一些藻类中均未发现 。
用作比较活性的对照是在培养液中加入
0
.
5% F B S
, 这一血清蛋白质含量大大 多 于
各试验中所加入 C T C S提取液所含蛋白质 的
含量 。 透析试验表明具有生长刺激作用的组
分在分子量为 3 50 0~ 8 0 0 0的范围内 , 它不可
能是那些小分子量的生长调节物质或植物激
素 。 因此 , 其很可能是一种多肤生长因子 ,
只要微量的这种生长因子就能明显 促进 H `
肝癌细袍的生长 。 这种生长因子有待进一步
C T C S 提取浓的分离组分
图 7 , C T C S提取液不同分子量组分对H `
肝癌细胞生长的影响
A为未透析的提取液 ; B为分子量> 3 50 矛 C为分子
量> 80 00 ; D为分子量 > 1 4 0 00缉兮 ,
第 3期 钱凯先等 : 绿球藻 T C品系提取液促进 鼠肝疾 细 胞的生长苦 6 1 3
纯化和鉴证 。
致 谢 : 本研究完成于 美国w .Al t o n j o n e s Ce l l s Ci e n c e c e n t e r 。 我们感谢 M i c h a e l
W h i t c u t t博士的校审 , 感谢M a o a t o s h i T o g a二 i博士提供细胞株 , C h a r l e s T u r n e t 先生帮助
扫描 电子显微 镜技术 , M ar i n a aL D L,k e女士绘制 图版和 C ar al C cl y en 女士打印本文之 英文
稿 。
参 考 文 献
1
2
3
4
5
6
7
8
钱凯先 , G or d o n H . S a ot .鞭 犷藻与其突变体提取液对人膀肚细胞生长的影响 。 浙江大学学报 , 1 9即 ; 23
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6 2 3浙 汉 大 学 学 报 (自然科学版 )1 90 9年
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