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响应面法优化山葵异硫氰酸酯制备工艺研究



全 文 :食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用
· 216 ·
2016年 第41卷 第06期
山葵(Wasabia japonica)又名山萮菜,十字
收稿日期:2016-01-19 *通讯作者
作者简介:刘艳全(1989—),女,硕士研究生,主要从事天然活性物质研究与利用的研究工作。
花科大蒜芥族葱芥亚族山嵛菜属,生长于海拔
刘艳全,陈泽平,王征征,蒋珍菊,李玉锋*
(西华大学食品与生物工程学院,成都 610039)
摘要:以成熟山葵根为原料,二氯甲烷为提取溶剂,采用微波辅助制备山葵异硫氰酸酯。在单
因素的基础上,采用Plackett-Burman(PB)试验设计筛选出微波处理温度、微波处理时间、浸提时
间和微波功率为显著影响因素。采用响应面分析法进行工艺优化,得到微波辅助提取山葵异硫氰
酸酯的最佳工艺条件为微波温度55 ℃,微波时间3 min,浸提时间1.5 h,微波功率700 W。在此条
件下,异硫氰酸酯预测得率为0.218%,实测值为0.215%,高于传统水蒸气法、同时蒸馏萃取法。
这表明PB实验设计结合响应面分析法可很好地优化微波辅助山葵中异硫氰酸酯提取工艺。
关键词:山葵;异硫氰酸酯;微波;响应面
中图分类号:TS 201.4 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2016)06-0216-08
Optimization of microware-assisted extraction of isothiocyanates from
Wasabi japonica by response surface methodology
LIU Yan-quan, CHEN Ze-ping, WANG Zheng-zheng, JIANG Zhen-ju, LI Yu-feng*
(College of Food Science and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039)
Abstract: The isothiocyanates were extracted from Wasabi japonica by the method of microwave-assisted
extraction using Wasabi root as the raw material and dichloromethane as solvent. Base on the single-
factor experiments, microwave temperature, Effect of microwave procession time, the hours processed
by solvent and microwave power were picked as the significant factors through Plackett-Burman (PB)
experiment. Optimizing the craft by using the response surface methodology (RSM) and it showed that
the optimal extraction conditions of isothiocyanates by microwave-assisted method were microwave
temperature of 55 ℃, microwave extraction time of 3 min, solvent processed hours of 1.5 h and microwave
power of 700 W. It predicted that isothiocyanates was 0.218% and 0.215% in fact experiments, which is
higher to traditional methods and simultaneous distillation and solvent extraction. It showed PB and RSM
was perfect way to optimize the extraction yield of isothiocyanates from Wasabi japonica.
Key words: Wasabi japonica; isothiocyanates; microwave; response surface methodology
响应面法优化山葵异硫氰酸酯制备
工艺研究
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2016.06.045
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 提取物与应用
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2016年 第41卷 第06期
(1300~2500) m高寒山区,是当今世界上所发现
的一种特殊的食用保健植物,被誉为“绿色黄
金”[1]。山葵具有较高的营养价值,蛋白质、还
原糖的含量丰富,脂肪含量相对较低,粗纤维、
钙、磷含量均较为丰富[2]。山葵组织中的芥子甙,
在内源性水解酶的作用下水解,生成多种具有生
物活性的物质,如异硫氰酸酯类、腈类、硫氰酸
酯类、环腈类和恶唑烷酮类。异硫氰酸酯类具有
杀菌 [3-4]、抗氧化[5-6]、抗血小板凝集、抗骨质疏
松、抗癌[7]、增进食欲[8]、美容护肤等功效。我国
异硫氰酸酯的研究起步较晚,国内从山葵中提取
异硫氰酸酯的研究很少。异硫氰酸酯的提取多采
用水蒸气法、溶剂浸提法和超临界CO2流体萃取
法。但水蒸气法会损失较多有效成分,一般溶剂
浸提时间较长,超临界CO2流体萃取法成本较高。
文章采用Plackett-Burman(PB)试验设计及响应面分
析法Response Surface Methodology(RSM)优化微波辅
助提取山葵异硫氰酸酯工艺,为其产业化生产及
山葵产品开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山葵:四川省广元市玺府生物科技有限公
司;二氯甲烷、六氢吡啶、浓盐酸、无水硫酸
钠、溴甲酚绿、甲基红、邻苯二甲酸氢钾、L-抗
坏血酸:分析纯;甲醇:高效液相色谱级试剂。
1.2 仪器与设备
RE-52A旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;
JJ-2型组织捣碎机:江苏金坛市金城国胜实验仪
器厂;SHZ-D(III)循环水式多用真空泵:巩义市予
华仪器有限责任公司;600型数显恒温水浴箱:金
坛市富华仪器有限公司;MWave-5000微波仪:上
海新仪微波化学科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 山葵中异硫氰酸酯的制备工艺 准确称取
100 g新鲜山葵根,捣碎后放于500 mL圆底烧瓶
中,加入pH4.0的 邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液,10
mg/mL抗坏血酸,采用微波辅助提取异硫氰酸
酯。将提取液进行真空抽滤,溶剂分3次洗涤滤
渣,合并滤液及洗涤液于圆底烧瓶,40 ℃水浴锅
保温1.5 h,最后加入过量无水硫酸钠,20 ℃旋转
蒸发至干,用甲醇溶解残留物。
1.3.2 ITCs含量测定[9] 取甲醇溶解的ITCs提取物
10 mL于磨口三角瓶中,加入0.05 mol/L六氢吡啶5
mL,加塞,室温放置45 min;加入(3~5)滴溴甲酚
绿-甲基红指示剂,混匀,以0.01 mol/L盐酸标准
溶液滴定至酒红色,即滴定终点,异硫氰酸酯的
提取率(以萝卜硫素计)的计算公式如下:
异硫氰酸酯提取率(%)= ( 1 7 7 . 3× (C 1V 1-
C2V2))/1000×100
式中:C1为六氢吡啶标准溶液浓度,mol/L;
C2为盐酸标准溶液的浓度,mol/L;
V1为六氢吡啶标准溶液的加入体积,
mL;
V2为滴定所消耗的盐酸标准溶液的体
积,mL;
177.3为萝卜硫素的相对分子质量。
1.4 分析方法
1.4.1 异硫氰酸酯制备单因素试验 以异硫氰酸
酯提取率为指标,考察8个因素对提取率的影响
规律。设定微波处理温度55 ℃,微波处理时间3
min,缓冲液体积300 mL,抗坏血酸体积10 mL,
微波功率700 W,浸提时间1.5 h,浸提温度40
℃,溶剂体积250 mL。固定其他7个条件,以异硫
氰酸酯的提取率为指标,分别考察不同微波处理
温度(45、50、55、60、65、70 ℃),不同微波处
理时间(1、2、3、4、5、6 min),不同缓冲液体积
(100、200、300、400、500、600 mL),不同抗坏
血酸体积(6、8、10、12、14、16 mL),不同微波
处理功率(400、500、600、700、800、900 W),不
同浸提温度(35、40、45、50、55、60 ℃),不同
浸提时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h)和不同溶剂体
积(50、100、150、200、250、300 mL)对异硫氰酸
酯提取率的影响。
1.4.2 Plackett-Burman试验 采用PB试验设计方法
进行关键因素筛选,在单因素试验的基础上确定
试验设计的各个因素和水平,如表1所示。
表1 Plackett-Burman试验因素及水平
因素
水平
-1 1
微波温度/℃ A 45 60
微波时间/min B 1 4
缓冲液体积/mL C 200 400
抗坏血酸体积/mL D 6 10
微波功率/W E 500 800
浸提温度/℃ F 35 55
浸提时间/h G 1 2
溶剂体积/mL H 150 300
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1.4.3 响应面优化试验 在PB试验设计分析基础
上,选取微波温度、微波时间、浸提时间和微波
功率作为自变量,采用4因素3水平的响应面分析
方法优化山葵异硫氰酸酯的提取工艺条件,试验
因素和水平见表2。
表2 响应面分析试验因素水平表
水平
因素
微波温度/℃
A
微波时间/min
B
浸提时间/h
C
微波功率/W
D
-1 50 2 1 600
0 55 3 1.5 700
1 60 4 2 800
2 结果与分析
2.1 山葵异硫氰酸酯制备工艺单因素试验
2.1.1 微波温度对山葵异硫氰酸酯得率的影响
从图2可看出,3 min时提取率达到最大,随
后时间对提取率急剧下降,微波时间对提取率存
在显著差异(P<0.05)。这可能是酶解产生的异硫
氰酸酯逐渐降解,以及长时间处理致温度升高,
部分物质挥发[11],考虑到异硫氰酸酯降解会产生
有害物质及影响提取率,故确定最佳微波时间为
(1~4) min。
2.1.3 缓冲液体积对山葵异硫氰酸酯得率的影响
注:不同小写字母代表差异显著,下图同。
图1 微波处理温度对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
图2 微波处理时间对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
图3 缓冲液体积对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
图4 抗坏血酸体积对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
如图1所示,在(45~60) ℃范围内,提取率随
温度升高逐渐增大,60 ℃时达到最大值,随后
提取率有明显的降低,这主要是由于高温下芥子
苷酶活性降低及酶解产物发生进一步降解[10],单
因素方差分析显示,微波温度对提取率存在显著
性差异(P<0.05),由于异硫氰酸酯不稳定,选择
(45~60) ℃为最佳微波提取温度范围。
2.1.2 微波时间对山葵异硫氰酸酯得率的影响
如图3所示,可看出缓冲液体积为300 mL之
前,异硫氰酸酯得率随体积的增加而逐渐提高,
之后随着缓冲液体积的增加提取率先缓慢下降后
急剧下降,主要是因为异硫氰酸酯在酸性条件下
易发生水解[12],水解产物有待进一步研究,缓冲
液体积对提取率存在显著影响(P<0.05),确定最佳
缓冲液体积为(200~400) mL。
2.1.4 不同抗坏血酸体积对山葵异硫氰酸酯得率
的影响
由图4可 看出,随体积增加提取率先增加后
降低,主要是因为抗坏血酸对芥子苷酶的活性有
关,当抗坏血酸达到一定浓度时会激活此酶,促
进芥子苷分解异硫氰酸酯,浓度过大时,溶液偏
向酸性,异硫氰酸酯不稳定进一步降解[21],选择
体积为(6~10) mL。
2.1.5 微波功率对山葵异硫氰酸酯得率的影响
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如图5所示,可知提取率在(400~800) W范围
内随功率的增大而增大,800 W时达到最大值,
且不同功率之间的提取率差异显著(P<0.05)。这主
要是因为微波处理会使降解产物种类发生变化,
功率越大,反应的速度增加,产物的种类更多,
异硫氰酸酯的得率降低[13]。考虑到能量和成本问
题,微波功率为(500~800) W范围内。
2.1.6 浸提温度对山葵异硫氰酸酯得率的影响
由图7可知,提取率随时间先增加后降低,在
1.5 h时达到最大值,之后缓慢降低,这主要是异
硫氰酸酯中有部分易挥发成分,时间越长损失越
多,需要对异硫氰酸酯进行及时保存。不同浸提
时间存在差异显著(P<0.05),考虑到提取率和设备
利用率问题选择浸提时间为(1~2) h。
2.1.8 溶剂体积对山葵异硫氰酸酯得率的影响
图5 微波功率对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
图6 浸提温度对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
图7 浸提时间对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
图8 溶剂体积对山葵异硫氰酸酯提取率的影响
由图6可知,提取率在40 ℃时达到最大值,
之后随温度升高而显著降低,不同温度之间的差
异显著(P<0.05)。这主要是异硫氰酸酯对温度极敏
感,微波处理加快异硫氰酸酯分解,温度升高会
增加降解酶活性,加快产物进一步分解,选择浸
提温度为(35~50) ℃。
2.1.7 浸提时间对山葵异硫氰酸酯得率的影响
如图8所示,可知需要合适的固液比才能使
异硫氰酸酯充分提取出来,在溶剂体积为250 mL
时达到最大值,而且不同体积之间的差异显著
(P<0.05),可能是因为溶剂过多增加含氧量使部分
含不饱和键的异硫氰酸酯发生氧化[14],氧化产物
需进一步研究,试验中选择体积为(150~300) mL。
2.2 Plackett-Burman试验设计对关键影响因素
的确定
单因素试验的基础上,PB试验设计及响应值
见表3。利用Mintab17.0对试验结果进行分析,结
果见表4。
表3 Plackett-Burman试验设计及响应值
试验

因素 得率
/% YA B C D E F G H
1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 0.181
2 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 0.137
3 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 0.131
4 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 0.171
5 1 1 1 -1 1 1 -1 1 0.215
6 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 0.172
7 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0.123
8 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 0.161
9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 0.137
10 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 0.123
11 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 0.158
12 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 0.198
由表4可知,模型的P值为0.01,表明PB试
验设计因素在所选取的水平范围内对异硫氰酸
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酯的提取率的影响极显著,模型决定系数R2为
96.46%,说明回归有效。由方差来源的P值可知,
微波温度、微波时间、微波功率、浸提时间为主
要影响因素,在响应面试验设计中主要考察此4个
因素的最优水平组合,其余4个因素取单因素的
最佳值:缓冲液体积为300 mL,抗坏血酸体积10
mL,浸提温度为40 ℃,溶剂体积为250 mL。
2.3 响应面优化山葵异硫氰酸酯提取率工艺
2.3.1 响应面试验设计方案及实验结果 根据表
5中的试验数据,对自变量编码A、B、C、D用
Expert-Design9.0.6软件拟合,建立异硫氰酸酯得
率的多元二次响应面回归方程:
Y=0.21-0 .012A-0 .013B-0 .0001667C-
0.002667D+0.011AB+0.00625AC+0.005500AD-
0.0035BC+0.00325BD-0.0007500CD-0.039A2-
0.030B2-0.028C2-0.034D2
由表6可知,模型的P值小于0.001,表明该模
型二次方程极显著,方程决定系数R2为0.9740,
方程能很好地描述各因素与响应值之间的真实
关系,失拟项不显著(P=0.1233),故模型的选取
适合,可以用其确定最佳提取工艺条件。由回归
方程和表6可以看出,方程中因素一次项A、B极
显著,二次项AB、A2、B2、C2、D2对异硫氰酸酯
得率的影响极其显著(P<0.01);因素C、D、AC、
AD、BC、BD、CD对异硫氰酸得率的影响不显著
(P>0.05)。另外,对模型的方差分析结果是:一次
项和交互项均不显著,二次项显著,各因素对提
取率影响大小顺序:微波时间>微波温度>微波
功率>浸提时间,微波处理时间对异硫氰酸酯提
取率影响最大。
2.3.2 两因素交互作用的分析
2.3.2.1 微波温度和微波时间 由图9可知,当微
波时间和微波温度的增大或减小时,异硫氰酸酯
得率随着增大而减小,当微波时间达到3 min,微
波温度为55 ℃时得率最高,超过此范围,得率则
下降。响应面中曲线较陡说明微波温度和微波时
间对异硫氰酸酯得率影响显著,图中等值线呈椭
圆形,表明各因素彼此间交互作用显著。
2.3.2.2 微波温度和浸提时间 由图10 可知,当微
波温度和浸提时间的增大或减小时,异硫氰酸酯
得率随着增大而减小,当微波温度为55 ℃,浸提
时间为1.5 h时得率最高,超过此范围,得率则下
降。响应面中微波温度曲面比浸提时间曲面陡,
说明浸提时间对得率影响较微波温度显著性低,
等高线图中等值线呈圆形,表明微波温度和浸提
表5 响应面分析实验结果
试验

因素 提取率/%
Y微波温度/℃ A
微波时间/
min B
浸提时间
/h C
微波功率
/W D
1 1 0 -1 0 0.132
2 0 0 0 0 0.218
3 -1 -1 0 0 0.176
4 1 1 0 0 0.133
5 0 -1 1 0 0.176
6 1 -1 0 0 0.135
7 0 0 0 0 0.219
8 0 -1 0 1 0.163
9 -1 0 1 0 0.153
10 0 -1 0 -1 0.163
11 1 0 0 1 0.131
12 -1 0 0 -1 0.167
13 -1 0 -1 0 0.172
14 1 0 0 -1 0.129
15 0 1 0 1 0.145
16 0 -1 -1 0 0.174
17 0 0 0 0 0.215
18 0 0 1 -1 0.163
19 -1 0 0 1 0.147
20 0 0 0 0 0.209
21 0 0 -1 1 0.139
22 0 0 0 0 0.213
23 0 1 -1 0 0.149
24 0 1 1 0 0.137
25 0 1 0 -1 0.132
26 -1 1 0 0 0.131
27 0 0 1 1 0.148
28 0 0 -1 -1 0.151
29 1 0 1 0 0.138
表4 试验设计方差分析结果
变量 自由度 标准偏差 F P
模型 8 0.009768 104.91 0.001
微波温度 1 0.004921 422.79 <0.001
微波时间 1 0.001430 122.87 0.002
缓冲液体积 1 0.000290 24.92 0.015
抗坏血酸体积 1 0.000114 9.80 0.052
微波功率 1 0.002494 214.29 <0.001
浸提温度 1 0.000070 6.02 0.091
浸提时间 1 0.000397 34.09 0.010
溶剂体积 1 0.000052 4.47 0.125
残差 3 0.000035
误差总变异 11 0.009803
S=0.0102252,R-sq=96.46%,R-sq(调整)=87.02,
R-sq(预测)=43.35%
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图9 微波温度和微波时间及其交互作用对异硫氰酸酯得率影响的响应面图(a)及等高线(b)
图10 微波温度和浸提时间及其交互作用对异硫氰酸酯得率影响的响应面图(a)及等高线(b)
时间两因素的交互作用不显著。
2.3.2.3 微波温度和微波功率 由图11可知,随微
波功率的增大,异硫氰酸酯得率增大,当功率达
到700 W时,提取率最大,随后又逐渐降低,响应
面中微波温度曲面相对微波功率曲面陡,说明微
波功率对得率影响没有微波温度显著,等高线图
中等值线近似圆形,表明微波温度和微波功率两
因素的交互作用不显著。
2.3.2.4 微波时间和浸提时间 由图12可知,当微
波时间和浸提时间的增大或减小时,异硫氰酸酯
得率随着增大而减小,当微波时间3 min,浸提
时间为1.5 h时得率最高,超过此范围,得率则下
降。响应面中曲面随微波时间的变化较浸提时间
陡,说明微波时间对得率影响比浸提时间显著,
等高线图中等值线呈椭圆形,表明微波温度和浸
提时间两因素的交互作用比较显著。
2.3.2.5 微波时间和微波功率 由图13可知,当微
波时间3 min,微波功率700 W时得率最高,响应
面中曲面随微波时间的变化较微波功率变化大,
说明微波时间对异硫氰酸酯得率影响比微波功率
显著,等高线图中等值线呈椭圆形,表明微波温
度和浸提时间两因素的交互作用较显著。
2.3.2.6 浸提时间和微波功率 由图14可知,随浸
表6 回归模型的ANOVA分析
变异
来源 平方和
自由
度 均方 F值 P值
显著

模型 0.023 14 1.656E-003 37.41 <0.0001 ***
A 1.825E-003 1 1.825E-003 41.23 <0.0001 ***
B 2.133E-003 1 2.133E-003 48.19 <0.0001 ***
C 3.333E-007 1 3.333E-007 7.529E-003 0.9321 *
D 8.533E-005 1 8.533E-005 1.93 0.1867 *
AB 4.622E-004 1 4.622E-004 10.44 0.0060 ***
AC 1.563E-004 1 1.563E-004 3.53 0.0813 *
AD 1.210E-004 1 1.210E-004 2.73 0.1205 *
BC 4.900E-005 1 4.900E-005 1.11 0.3106 *
BD 4.225E-005 1 4.225E-005 0.95 0.3452 *
CD 2.250E-006 1 2.250E-006 0.051 0.8249 *
A2 9.731E-003 1 9.731E-003 219.81 <0.0001 ***
B2 5.831E-003 1 5.831E-003 131.72 <0.0001 ***
C2 4.989E-003 1 4.989E-003 112.69 <0.0001 ***
D2 7.713E-003 1 7.713E-003 174.22 <0.0001 ***
残差 6.198E-004 14 4.427E-005
失拟项 5.550E-004 10 5.550E-005 3.43 0.1233
纯误差 6.480E-005 4 1.620E-005
总和 0.024 28
R2 0.9740
Radj2 0.9479
注:P>0.05,*说明模型或考察因素无显著影响;P<0.05,**说明模
型或考察因素有显著影响;P<0.01,***说明影响极显著。
(a) (b)
(a)
(b)
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图11 微波温度和微波功率及其交互作用对异硫氰酸酯得率影响的响应面图(a)及等高线(b)
图12 微波时间和浸提时间及其交互作用对异硫氰酸酯得率影响的响应面图(a)及等高线(b)
图13 微波时间和微波功率及其交互作用对异硫氰酸酯得率影响的响应面图(a)及等高线(b)
图14 浸提时间和微波功率及其交互作用对异硫氰酸酯得率影响的响应面图(a)及等高线(b)
(a) (b)
(a) (b)
(a) (b)
(a) (b)
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 提取物与应用
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2016年 第41卷 第06期
提时间和微波功率的增加,异硫氰酸酯得率逐渐
增大,当浸提时间为1.5 h,微波功率为700 W时得
率达到最大,等高线图中等值线呈椭圆形,表明
浸提时间和微波功率两因素的交互作用较显著。
2.3.3 模型的验证性试验 采用Design-Expert9.0.6
软件拟合后的模型方程进行最优工艺预测,当
微波处理温度A为53.994 ℃、微波时间B为2.738
min、浸提时间C为1.496 h、微波功率D为693.349
W时异硫氰酸酯的得率可达到0.218%,考虑到试
验条件,将其修订为:A为55 ℃,B为3 min,C为
1.5 h,D为700 W。按照此工艺参数,平行试验3
次,平均值为0.215,相对于理论值相差0.014%,
因此采用响应面法优化异硫氰酸酯制备工艺条件
有一定的参考价值。
3 结论
影响山葵中芥子苷酶解的因素很多,在单因
素试验结果上,通过PB试验筛选出对异硫氰酸酯
得率影响较显著的单因素,再采用响应面分析法
优化提取工艺条件。根据试验具体条件修正后微
波处理温度55 ℃,微波处理时间3 min,浸提时
间1.5 h,微波功率700 W,异硫氰酸酯的得率为
0.215%,与理论最佳值(0.218%)相差0.014%,高
于一般的水蒸气法、同时蒸馏萃取法,因此本试
验模型能够显著优化山葵硫苷酶解产物异硫氰酸
酯得率,为提高异硫氰酸酯得率提供技术和理论
支持。
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