全 文 ：　　收稿日期:2001-12-18
作者简介:李大志 ,男 , 1966年生 ,博士研究生。
通讯联系人:林炳承 ,男 ,研究员 ,博士生导师 ,电话/传真:(0411)4379065 , E-mail:bclin@dicp.ac.cn。
基金项目:国家自然科学重点基金面上基金资助项目(批准号:20035010)
记忆缺失性贝类毒素的主要成分 软骨藻酸的毛细管电泳分析
李大志1 , 　祝文君2 , 　宋文斌3 , 　林炳承1
(1.中国科学院大连化学物理研究所 , 辽宁 大连 116023;2.大连水产学院 , 辽宁 大连 116024;
3.辽宁省进出口检验检疫局 , 辽宁 大连 116001)
摘要:通过萃取 、离子交换等技术 ,建立了毛细管电泳/紫外检测法分析海洋赤潮生物毒素的重要种类之一 、记忆缺
失性贝类毒素的主要成分 软骨藻酸的方法。结果表明:软骨藻酸在 0.2 mg/ L～ 50 mg/ L时具有良好的线性关
系 ,相关系数 r=0.999 0;方法检出限为 0.063 mg/ L(S/ N>3)。在 3 个添加水平上进行加标回收试验(n =6), 平
均回收率分别为 97.24%, 96.92%和 97.55%, RSD分别为 2.74%, 2.59%和 1.95%。利用该方法对 5 种经济贝类
样品进行了测定。该方法简单 、灵敏 、高效 、成本低 , 对软骨藻酸的检测和监控具有重要意义。
关键词:毛细管电泳法;记忆缺失性贝类毒素;软骨藻酸;分析
中图分类号:O658　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-8713(2002)02-0125-04
Capillary Electrophoretic Analysis of Amnesic
Shellfish Toxin—Domoic Acid
LI Da-zhi1 , ZHU Wen-jun2 , SONG Wen-bin3 , LIN Bing-cheng1
(1.Dalian Institute of Chemical Physics , The Chinese Academy of Sciences , Dalian 116023 , China;
2.Dalian Fisheries College , Dalian 116024 , China;
3.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau , Dalian 116001 , China)
Abstract:Domoic acid , a main component of amnesic shellfish toxin(one of the four sorts of marine
red tide bio-toxins)was determined by capillary elect rophoresis w ith UV detection.The shellfish
samples were prepared by solvent ex traction , cleaned-up w ith a st rong anion-exchange cart ridge
(SAX:Part No.1210-2044 , Lot No.182639 , Varian)and a cation-exchange cart ridge (SCX:Part
No.1211-3039 , Lot No.171069 , Varian).The quant itative analysis was perfo rmed wi th ex ternal
standard under the optimum condit ions of capillary elect ropho retic analy sis.The calibration curve of
domoic acid showed good linearity in the range of 0.2 mg/L -50 mg/ L with r =0.999 0 , and the
detection limit w as 0.063 mg/L (S/ N >3).Spiked with standard at three levels(5.00μg/g , 10.00
μg/g and 20μg/g), the samples had the recoveries of 97.24%, 96.92%and 97.55%, and the RSDs
of 2.74%, 2.59% and 1.95%, respectively.Five kinds of shellfish samples no rmally consumed in
Dalian sea area w ere collected and quant if ied.The method has the advantages of being simple ,
convenient , sensitive and low cost.Therefore it can be used as one of the routine moni toring methods
for amnesic shellfish to xin.
Key words:capillary elect rophoresis;amnesic shellfish to xin;domoic acid;analy sis
　　不断加剧的海洋环境污染导致赤潮灾害频繁 ,
由赤潮生物产生的大量生物毒素通过食物链严重污
染了鱼类和其他海洋经济动物 ,给水产养殖和加工
业造成了巨大的损失 ,对公众健康构成了严重威
胁[ 1] 。记忆缺失性贝类毒素(amnesic shellf ish tox-
in , 简称 ASP)的主要成分 软骨藻酸(domoic
acid , 简称 DA)是一种具有生理活性的氨基酸类物
质 ,其分子结构为:
第 20卷第 2期
2002年 3月
色 谱
CHINESE JOU RNAL OF CHROMATOGRAPHY
Vol.20 No.2
March 2002
因最早从红藻属的树枝软骨藻(Chondria armata)
中分离出来而被命名为软骨藻酸。自 1987年加拿
大首次发生集体贝类食品中毒事件后 ,人们从赤潮
藻类中的硅藻属的多列尖刺菱形藻(Nitzsch pun-
gens f.mult iseries)中检测到了软骨藻酸 ,随后 ,美
国 、加拿大 、北欧一些国家以及澳大利亚 、日本等国
的科学工作者也先后从紫贻贝(Mylti lus edulis)、扇
贝(Pecten maximus)、文蛤(Call ista chione)等贝类
体内以及鱼是鱼 、鲭鱼和石蟹的内脏中检测到了软骨
藻酸 。鱼 、贝类通过滤食毒藻 ,将软骨藻酸富集在体
内 ,人类因食用被软骨藻酸污染的鱼 、贝而中毒 ,中
毒症状包括恶心 、呕吐 、腹痛 、腹泻等 ,同时有昏眩 、
昏迷等类似神经性中毒症状 ,永久性丧失部分记忆
是此类中毒后的典型特征 ,因此它被称为记忆缺失
性贝类毒素 。美国食品药品管理局(FDA)将它确定
为4种主要海洋生物毒素之一[ 2] ,并首先和加拿大
制定了贝肉中软骨藻酸的安全剂量为 20 μg/g的规
定[ 3] ,日本也随后将该种毒素列为贝类常规检测项
目。
　　小白鼠生物检测方法首先被应用于记忆缺失性
贝类毒素的检测[ 4] ,随后酶联免疫 、细胞毒性检测
和受体检测等生物检测法相继建立[ 5] 。近年来 ,仪
器分析法因其灵敏 、准确 、快速等特点而得到广泛应
用。通常的仪 器分析法有高 效液相色谱 法
(HPLC)[ 6 ～ 10]和毛细管电泳法(CE)[ 11 ,12] 。毛细管
电泳法是近几年发展起来的海洋生物毒素分离检测
技术之一[ 13] ,它的基本原理是带电粒子因其不同的
质荷比在电场中具有不同的迁移速度而得到分
离[ 14] 。软骨藻酸分子中的官能团使其具有质子化
的能力 ,因此它能产生带电粒子并易于毛细管电泳
分离 。
　　在参考现有 CE分离分析方法所采用的萃取技
术的基础上 ,本文采用甲醇-水作为提取液 ,结合阴
离子交换柱和阳离子交换柱的净化 ,避免了基体中
色氨酸的干扰 ,使样品回收率得到较大的提高;同时
通过对分析条件的优化 ,将软骨藻酸分离的线性范
围由 1.5 mg/L ～ 8.0 mg/L[ 12] 扩大到 0.2 mg/L ～
50.0 mg/ L ,为建立贝类活体及其生物制品中所含
的微量软骨藻酸的 CE/UV 常规分析奠定了基础 。
对大连海域几种常见的经济贝类体内的软骨藻酸进
行分析的结果表明 ,该方法简便 、灵敏 、成本低 ,是贝
类体内软骨藻酸含量常规检测较理想的方法 。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
　　BioFocus 3000 全自动毛细管电泳仪(Bio-Rad
Laboratories , Hercules , CA , USA)配有紫外检测器;
JZ 型组织匀浆器(铁道部电气化设计研究院四方电
器设备厂);TG L-16型台式高速离心机(上海医用
分析仪器厂);KQ-250 型超声波清洗器(昆山市淀
山湖检测仪器厂);PHS-3C 精密 pH 计。
软骨藻酸标准品(纯度 95%)购于 Sigma公司 ,
于-18 ℃下保存至使用;MUS-1标准物质(贝类组
织参照物质 , DA 的含量为 98 μg/g)由辽宁进出口
检疫检验局卫锋提供(购自 National Research Coun-
cil , Canada);四硼酸钠(50 mmol/L , pH 9.3 , 分析
纯);乙腈(色谱纯);甲醇(色谱纯);甲酸(分析纯);
实验用水为自制二次去离子水;阴离子交换柱
(SAX:Part No.1210-2044 , Lot No.182639 , Varian)
和阳离子交换柱(SCX:Part No.1211-3039 , Lot
No.171069 , Varian)。
1.2　样品的制备和分离分析
1.2.1　样品的萃取
　　在 4 g 贝类组织中加入 16.0 mL 甲醇-水(体积
比为 1∶1)溶液 ,匀浆 3 min ,在 4 500 r/min速率下
离心 10 min ,将上清液通过 0.45 μm 滤膜(Millex-
HV)过滤后放入冰箱中储存 ,备用。
1.2.2　样品的洗脱
　　参考 Zhao 等[ 15]的方法 ,并做适当的改进。具
体方法为:
a.取 5.0 mL 粗提取液 ,移入依次经甲醇 、水和
甲醇-水(体积比为 1∶1)预处理过的 SAX柱 ,待液体
以 1 滴/ s 的速度流出后 , 再依次用 5 mL 乙腈-水
(体积比为 1∶9)洗脱液以 1 滴/ s的流出速度过柱 ,
弃去流出液 ,最后用 2 mL 柠檬酸洗脱液洗脱吸附
在柱上的软骨藻酸 。
b.依次用甲醇 、水和 0.1 mol/L 甲酸预处理
SCX柱 ,然后加入 0.5 mL 经 SAX 洗脱的样品液 ,
用 5 mL的 0.01 mol/L 甲酸冲洗 ,弃去流出液 ,再用
5 mL 的 25 mmoL/ L硼酸钠(pH 9.2)-乙腈(体积比
为 9∶1)溶液淋洗 ,最后 2 mL的 25 mmoL/L 的硼酸
钠(pH 9.2)-乙腈(体积比为9∶1)溶液分 3等份进行
洗脱 ,第 3份洗脱液的流出液中开始含有软骨藻酸 ,
收集该流出液用于 CE分析。
1.2.3　样品的 CE/UV分析
　　河北永年光导纤维厂生产的非涂渍石英毛细管
柱(内径 50 μm ,检测窗口距出口端 4.5 cm ,柱 1长
40 cm ,柱 2长 34.5 cm);检测波长 242 nm;分离电
压 15.0 kV;柱温 25 ℃;压力进样 41.37 kPa×1 s
(6 psi×1 s);冲洗及运行缓冲液为 25 mmol/L 硼酸
盐溶液 。
·126· 色 谱 第 20卷
2　结果与讨论
2.1　提取溶剂的选择
　　基于软骨藻酸具有水溶性的特点 ,常用酸性水
溶液对其进行提取[ 15] 。但实验表明软骨藻酸在酸
性条件下易分解 ,不利于提高回收率和重现性 。本
实验采用甲醇-水溶液作为提取液 ,结合 SAX 柱和
SCX柱的净化 ,避免了基体中色氨酸的干扰 , 得到
了 97.23%的回收率。
2.2　CE检测条件的优化
　　软骨藻酸为记忆缺失性贝类毒素的主要成分 ,
它含有 3个羧基和 1 个氨基基团 ,具有很强的电离
能力。根据溶液 pH 值的不同 ,软骨藻酸具有 5 种
荷电状态 , 其 pK a 值分别为 2.10 , 3.72 , 4.97 和
9.82 ,因此 ,我们可以采用不同运行模式或电泳条件
对其进行检测。
图 1　不同浓度的硼酸缓冲液对 DA淌度的影响
Fig.1　Effect of different borate buffer
concentrations on the mobil ity of domoic acid
C onditions:bare fused-silica column 1 (40 cm ×50μm i.d.;
borate buffer(pH 9.3);separat ion voltage , 15kV , positi ve pole to
cathode;41.37 kPa×1 s(6 psi×1 s)for injections , the UV detec-
tion at 242 nm.
Borate buf fer concentrat ions:a.12.5 mmol/ L;b.25 mmol/ L;
c.50 mmol/ L.
　　根据 Pinei ro 等人[ 11]的研究 ,硼酸盐溶液是软
骨藻酸分析的最佳缓冲液 ,因此我们采用不同浓度
的硼酸盐缓冲液(12.5 mmol/L , 25 mmol/L 和 50
mmol/ L)和不同的运行电压(18.0 kV , 15.0 kV 和
12.0 kV)对软骨藻酸标准品进行检测(见图 1和图
2),以便找到最佳分离效率和分辨率的毛细管电泳
条件。当使用高浓度(50 mmol/L)缓冲液时 ,由于
缓冲液中的盐度高 ,使得电流增大 、峰展宽 ,毛细管
中产生焦耳热效应 ,而这种效应会导致溶剂蒸发和
电泳分离前样品的损失 ,同时离子强度的增加会延
长带电粒子的迁移时间 ,使软骨藻酸的检测时间延
长;使用低浓度(12.5 mmol/L)缓冲液时 ,虽然软骨
藻酸的检测时间缩短 ,但检测噪声增大 ,导致软骨藻
酸的检出限降低;而使用 25 mmol/L 的硼酸盐溶液
则可以克服上述两种浓度的缓冲液的不足 ,提高了
电泳分离的选择性和分辨率 ,同时峰形更尖锐 ,电泳
分离效率更高 ,因此 25 mmol/ L 的硼酸盐缓冲液是
CE分离软骨藻酸的最佳缓冲液 。在选择电压时 ,采
用较高的分离电压(18.0 kV)可以使软骨藻酸迁移
时间缩短 ,但同样会出现电流增大和焦耳热效应等
缺点;而低电压(12.0 kV)又导致软骨藻酸迁移时
间延长 。实验证明 15.0 kV 的电压是毛细管电泳测
定软骨藻酸的最佳分离电压 。
图 2　不同分离电压对 DA淌度的影响
Fig.2　Effect of di fferent separation voltages
on the mobil ity of domoic acid
Condi tions:bare fused-silica column 2(34.5 cm×50μm i.d.;
running buf fer , 25 mmol/ L borate buffer(pH 9.3);separation volt-
age , positive pole to cathode;41.37 kPa×1 s(6 psi×1 s)for injec-
ti ons;the UV detect ion at 242 nm.
Separation voltages:a.18 kV;b.15 kV;c.12 kV.
2.3　线性关系 、精密度和最低检测限
　　分别配制质量浓度为 50.0 mg/ L ,35.0 mg/L ,
20.0 mg/L , 10.0 mg/L , 1.0 mg/L , 0.4 mg/ L , 0.2
mg/L 的软骨藻酸标准溶液 ,用毛细管柱 2按选定
的条件进行 CE分析 ,每个样品测定 3次 ,以软骨藻
酸的质量浓度 x(mg/L)为横坐标 ,以 3次测定的软
骨藻酸的平均峰面积 y 为纵坐标 ,结果表明软骨藻
酸在 0.2 mg/L ～ 50.0 mg/L 时 ,其峰面积与质量浓
度具有良好的线性关系(r =0.999 0),回归方程为
y =55 531+102 414 x , P<0.000 1。其峰面积的相
对标准偏差(RSD)为 1.90%(24 h), 3.60%(48 h),
迁移时间的相对标准偏差为 1.60%(24 h), 1.86%
(48 h)。本方法的最低检出限为 0.063 mg/L(按
S/ N >3计)。
2.4　回收率的测定
　　本实验进行了 3个添加水平的加标回收试验。
在空白样品中分别按 5.00 μg/g , 10.00 μg/g 和
20.00μg/g 添加软骨藻酸标准品 ,然后按“1.2”节
方法处理 ,每一水平测定 6次 ,结果见表 1。
·127·　第 2期 李大志等:记忆缺失性贝类毒素的主要成分 软骨藻酸的毛细管电泳分析
表 1　软骨藻酸的回收率测定(n=6)
Table 1　Recovery of domoic acid(n=6)
Added
(μg/ g)
Found(mean±SD)
(μg/ g)
Recovery
(%)
RSD
(%)
5.00 4.86±0.14 97.24 2.74
10.00 9.69±0.25 96.92 2.59
20.00 19.51±0.39 97.55 1.95
2.5　样品检测
　　对 2001年 5月 2 ～ 8日在大连海域(黑石礁海
区)采集的 5 种贝类(1#为菲律宾蛤仔 、2#为紫贻
贝 、3#为牡蛎 、4#为文蛤 、5#为扇贝)和参照标准物
质(6# ,MUS-1)进行分析 ,分析结果(见表 2和图 3)
表明:大连海域黑石礁海区的扇贝受到了软骨藻酸
的污染 。
表 2　贝类样品的分析结果(n=3)
Table 2　Analytical results of the samples(n=3)
Sample
code1)
Found
(μg/g)
Sample
code
Found
(μg/ g)
1 ND2) 4 ND 2)
2 ND2) 5 5.2
3 ND2) 6 32.6±1.1
　1)1.R udi taps phi lipp inarum ;2.My lti lus edu lis;3.Oyster;
4.Ca lli sta chione;5.Ch lamys farrer i;6.MUS-1 reference mate-
rial.2)Not detected.
图 3　样品的毛细管电泳色谱图
Fig.3　Electropherograms of the samples
C onditions:bare fused-si lica column 2;running buf fer ,25 mmol/ L borate buf fer(pH 9.3);separation vol tage , 15 kV , positive pole to cath-
ode;41.37 kPa×1 s(6 psi×1 s)for injections;the UV detection at 242 nm.
a.Rud itaps phi lip pinarum sam ple;b.Chlamys far reri sample;c.domoic acid standard;d.MUS-1 reference material.
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·128· 色 谱 第 20卷