全 文 ：　　表 3　黄芪皂苷对 S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响( x±s, n=10)
组别 剂量(mg/kg)
体重(g)
给药前 给药后　　
瘤重　　
(g)　　
抑瘤率
(%) 脾指数　 胸腺指数　
模型对照 21.08±1.02 25.54±2.95 1.60±0.66 65.98±17.69 29.09±11.04
DDP 1 21.05±1.62 18.31±1.72＊＊ 0.41±0.29＊＊ 74.39 30.45±8.69＊＊ 10.59±3.54＊＊
黄芪皂苷 50 21.32±1.13 26.42±1.47 0.75±0.46＊＊ 52.82 51.87±15.39 24.55±7.22
黄芪皂苷 100 20.85±1.49 26.61±1.95 0.70±0.29＊＊ 56.46 51.98±24.61 31.37±6.32
3　讨论
　　近年研究发现 ,许多中药可以通过多种因素干扰肿瘤的生
长 、代谢 、增殖过程 ,最终能使肿瘤细胞发生死亡或凋亡 [ 5] ,同时
发挥整体调节作用 ,对免疫 、内分泌、基因等进行综合调控 [ 6 , 7] ,减
轻恶性肿瘤患者的各种症状 ,改善肿瘤患者包括免疫功能在内的
机体机能状况 , 减轻化学治疗和放射治疗的毒副作用 ,从而提高
恶性肿瘤患者的生存质量和延长肿瘤患者的生存期 [ 8] 。
　　临床常将黄芪单独或组成各种方剂用于各类中 、晚期癌症
患者的治疗 [ 9, 10] 。本研究对黄芪的皂苷类组分进行了体内外抗
肿瘤活性的初步研究 ,结果显示 , 黄芪皂苷仅在在 100 mg/L时
才对 K562细胞的增殖有抑制作用 , 抑制率为 40.99%, 且对
HepG2、HCT116和 A549细胞的增殖无明显影响 , 说明黄芪皂苷
无明显体外抗肿瘤活性。黄芪皂苷灌胃给药 , 对小鼠移植性肿
瘤 H22和 S180的生长有一定的抑制作用 , 且随药物浓度增加
抑瘤率增加 , 且黄芪皂苷不降低小鼠的免疫功能 , 给药后小鼠
一般状态良好 , 体重有所增加。 黄芪皂苷无明显体外抗肿瘤活
性 , 但体内抗肿瘤活性较强 , 揭示其抗肿瘤作用机制可能与增
强机体免疫功能有关 ,有待进一步深入研究。
参考文献
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StudyonantitumoractivityofAstragalussaponins
LiuMinghua, RenMeiping, ChenJianping, SunYuhong, LiHua, ZhangZhuo, XiaoShunhan
(LaboratoryofPharmacologyandToxicology, DepartmentofPharmacology, LuzhouMedicalCollege, Luzhou　 646000)
　　Object:TostudytheantitumoractivityofAstragalussaponins(AS)invitroandinvivo.Methods:ThecytotoxicityofASonhuman
leukemiaK562, hepatomacarcinomaHepG2, humancoloncarcinomaHCT116andlungadenocarcinomaA549 cellinesweredeterminedby
CCK-8(cellcountingkit-8)assay.TheinhibitoryeffectofASontumorgrowthwasobservedbythemodelsofhepatoma22 (H22)andim-
plantedsarcoma180 (S180)inmice.Results:ASinhibitedtheproliferationofK562celsatconcentrationof100 mg/L, theinhibitoryrate
was40.99%, however, itdidnthavenoeffectontheproliferationofHepG2、HCT116andA549cels.Atdosesof50、 100 mg/kg, theinhibi-
toryratesofASonH22 andS180were36.62%, 42.24% and52.82%, 56.46%, respectively.Conclusion:ASdidnthavenoantitumor
activityinvitro, butsignificantlyexhibitedantitumoractivityinvivo.
Keywords　 Astragalussaponins;antitumor;CCK-8;H22;S180
日本粗榧果肉中三种二萜类化合物体外抗癌活性研究＊
潘永梅 ,王建华 ,曹聪梅 ,史清文＊＊
(河北医科大学药学院 ,石家庄　050017)
　　摘　要　目的:观察从日本粗榧果肉中分离得到的三种二萜类化合物 18-hydroxyferruginol(A)、kayadiol(B)及 hinokiol(C)对
70 中药药理与临床 2009;25(2)
＊ 基金项目:河北省中医药管理局课题 (20066053)、河北省归国留学人员科技活动项目(2000600), 英国先正达研究基金会的资助(2008-He-
beiMedicalUniversity-Syngenta-02)课题　　　　＊＊通讯作者
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2009.02.033
人白血病细胞 K562和鼠肉瘤细胞 S180生长的影响。方法:以人白血病细胞 K562为研究对象 , 采用 MTT法检测上述三种二萜类化
合物对 K562细胞生长的抑制率 , 用相差倒置显微镜观察细胞形态变化。根据检测结果 , 对三种化合物进行抗癌活性筛选 , 将筛选
出的有效化合物 kayadiol再作用于鼠肉瘤细胞S180, 观察其对 S180细胞的作用。结果:18-hydroxyferruginol及 kayadiol对 K562细胞
有抑制其增殖的作用;其有效浓度分别是 1×10-4mol/L和 1×10-8mol/L ～ 1 ×10-4mol/L, kayadiol对 S180细胞也有一定的抑制作
用。 hinokiol对于 K562细胞的增殖没有明显的抑制作用。结论:日本粗榧果肉中分离得到的二萜类化合物 18-hydroxyferruginol
(A)、kayadiol(B)对人白血病细胞 K562的生长具有一定的抑制作用。
　　关键词　二萜类化合物;日本粗榧;K562细胞
　　日本粗榧 Torreyanucifera(L.)Sieb.etZucc.主要分布在
日本 、朝鲜 ,我国南京 、青岛等地引种栽培。榧树的种子即中药
榧子 , 始载于《神农本草经》 ,历版药典均收录 , 有杀虫消积 、润
燥通便之功效。
　　关于日本榧树的研究主要集中在它的叶子和心材的化学
成分上 ,倍半萜 、二萜 、木脂素 、黄酮等化学成分被认为是其中的
活性成分 [ 1 ～ 4] 。本文对从日本粗榧果实中分离得到的三种二萜
类化合物 18-hydroxyferruginol(A)、kayadiol(B)及 hinokiol(C)
进行抗肿瘤细胞的活性初步研究。
1 　材料与方法
1.1　 试验药物　三种二萜类化合物 18-hydroxyferruginol(8,
11, 13-abietatriene-12, 18-diol)(A);kayadiol(8(17), 13-lab-
diene-15, 18-diol)(B)和 hinokiol(8, 11, 13-abietatriene-3, 12-di-
ol)(C)由史清文教授从日本榧树果实中分离得到 , 通过核磁
共振光谱确定结构 , 纯度 99﹪。
1.2　试剂　 RPMIl640培养基(GiBCO), 胰蛋白酶(GiBCO),
型胶原酶Ⅱ(Sigma), 胎牛血清(北京鼎国生物试剂公司), 噻唑
蓝 (MTT, Sigma)。
1.3　细胞系和培养条件　人白血病 K562细胞和鼠肉瘤细胞
S180均由河北医科大学第四医院实验中心引进 , 接种在 100ml
的细胞培养瓶中 , 加入含 10%胎牛血清的 RPMIl640培养基 ,
37℃, 5%CO2培养箱中培养 , 每 1-2天传代一次。
1.4　方法　 K562细胞生长迅速 , 10天左右可以得到 32瓶细
胞 , 从中选择生长良好的 K562细胞 18瓶 , 每瓶加入胰蛋白酶
2ml消化一分钟 ,弃去胰蛋白酶 , 再每瓶加入 10ml含 10%胎牛
血清的 RPMIl640培养基 , 轻轻吹打细胞制成细胞悬液。细胞
计数后 , 用含 10%小牛血清的 RPMIl640培养基稀释成 4×104 /
ml的细胞悬液 ,将细胞悬液均匀的以每孔 200μl加入 9块 96孔
培养板 , 37℃, 5%CO2 培养箱中培养。 镜下观察 , 待细胞 70%
融合时 , 将含血清培养基吸弃 , 平衡盐溶液冲洗两次 , 预留 2行
不加药为空白对照 , 随机地分别于 9块 96孔培养板中加入含三
种药物 18-hydroxyferruginol、hinokiol及 kayadiol的无血清培养
基 , 每种药物加入 1×10-9 ～ 1 ×10-4mol/L六个浓度 , 于 96孔培
养板盖上做好标记 , 继续培养。
1.4.1　形态学观察　 光学显微镜下观察。
1.4.2　增殖实验　 按其增殖情况 , 培养不同时间后(24h,
48h, 72h, 或 12h, 24h, 36h), 分别将一块 96孔板从 CO2培养
箱中取出 , 每孔加入 5mg/ml的 MTT20μl, 继续孵育 4h, 取出 ,
吸弃培养基后 ,加入 150μl二甲基亚砜 , 10min后在酶标仪上检
测 492nm吸光度 [ 5] 。
　　在做 K562细胞实验的同时 , 做好鼠肉瘤细胞 S180培养及
传代 ,待 K562细胞增殖实验结束时 , 初步统计 , 将效果较好的
二萜类化合物 kayadiol作为干预因素 , 加入 S180细胞中 , 观察
其对S180细胞的抑制作用。操作方法类似于K562细胞的增殖
实验。
2　结果
　　镜下观察 ,肿瘤细胞不同于其它正常细胞 , 其细胞大小不
等 ,细胞铺满瓶底后有重叠现象 , 胞质和核的比例与正常细胞不
同 ,肿瘤细胞的核大胞质少 , 核仁增大或增多。加入含药培养基
培养后的细胞形态没有明显变化 ,只是体积稍微变小 。
2.1 　18-hydroxyferruginol(A)对人白血病细胞 k562增殖的影
响 　k562细胞在 1×10-4mol/L～ 1×10-9mol/L浓度的二萜类化
合物 18-hydroxyferruginol中培养 12h、 24h及 36h后 , 1 ×10-4
mol/L浓度表现出明显的抑制细胞增长的作用 , 见表 1。
　　表 1　不同浓度 18-hydroxyferruginol(A)对人白血病细胞 K562增
殖的影响(吸光度 A, n=10, x±s)
浓度
(mol/L)
培养时间(h)
12 24 36
0×10-9 0.469±0.019 0.454±0.025 0.482±0.019
1×10-9 0.638±0.034 0.617±0.126 0.637±0.069
1×10-8 0.474±0.025 0.487±0.011 0.481±0.027
1×10-7 0.468±0.012 0.455±0.014 0.487±0.026
1×10-6 0.511±0.016 0.486±0.017 0.501±0.025
1×10-5 0.580±0.017 0.548±0.116 0.518±0.025
1×10-4 0.419±0.020＊＊ 0.427±0.014＊＊ 0.462±0.018＊＊
　　与空白对照组相比较 ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01(下同)
2.2　kayadiol(B)对人白血病细胞k562增殖的影响 　k562细
胞在 1×10-4mol/L～ 1×10-9mol/L浓度的二萜类化合物kayadiol
71中药药理与临床 2009;25(2)
中培养 24h、48h及 72h均产生抑制增殖作用 , 其中 24h时以 1×
10-4mol/L和 1×10-5mol/L具有抑制增殖作用 , 48h时以 1×10-8
mol/L～ 1×10-4mol/L具有抑制增殖作用 , 72h时在 1×10-6mol/
L和 1×10-7mol/L浓度范围内均具有抑制增殖作用 ,见表 2。
　　表 2　不同浓度的 kayadiol(B)对人白血病细胞 k562增殖的影响
(A, n=10, x±s)
浓度
(mol/L)
培养时间(h)
24 48 72
0×10-9 0.523±0.090 0.732±0.033 1.337±0.141
1×10-9 0.540±0.041 0.709±0.035 1.444±0.132
1×10-8 0.516±0.028 0.678±0.038＊＊ 1.294±0.315
1×10-7 0.569±0.039 0.673±0.039＊＊ 1.186±0.254＊
1×10-6 0.546±0.059 0.658±0.031＊＊ 1.134±0.253＊
1×10-5 0.428±0.017＊＊ 0.530±0.047＊＊ 1.456±0.278
1×10-4 0.444±0.017＊＊ 0.653±0.03＊＊ 1.522±0.159
2.3　hinokiol(C)对人白血病细胞 k562增殖的影响 　k562细
胞在 1×10-4mol/L～ 1×10-9mol/L浓度的二萜类化合物 hinokiol
中培养 12h、24h及 36h均没有抑制增殖作用 ,见表 3。
　　表 3　不同浓度hinokiol(C)对人白血病细胞K562增殖的影响(吸
光度 A, n=10, x±s)
浓度
(mol/L)
培养时间(h)
12 24 36
0×10-9 0.416±0.040 0.522±0.105 0.547±0.124
1×10-9 0.451±0.037 0.490±0.042 0.504±0.033
1×10-8 0.484±0.030 0.494±0.013 0.508±0.043
1×10-7 0.463±0.030 0.486±0.023 0.492±0.039
1×10-6 0.475±0.037 0.528±0.083 0.524±0.074
1×10-5 0.516±0.064 0.494±0.015 0.510±0.036
1×10-4 0.464±0.023 0.476±0.047 0.497±0.060
2.4　 kayadiol(B)对鼠肉瘤 S180细胞增殖的影响　鼠肉瘤
S180细胞在 1×10-4mol/L～ 1×10-9mol/L浓度的二萜类化合物
kayadiol中培养 24h、48h及 72h均未产生明显的抑制增殖作用 ,
只有 72h时在 1×10-6mol/L浓度具有抑制细胞增殖的作用。
　　表 4　不同浓度的 kayadiol(B)对鼠肉瘤 S180细胞增殖的影响
浓度
(mol/L)
培养时间(h)
24 48 72
0×10-9 0.254±0.009 0.235±0.018 0.236±0.012
1×10-9 0.257±0.006 0.248±0.009 0.247±0.012
1×10-8 0.255±0.007 0.235±0.009 0.239±0.007
1×10-7 0.258±0.008 0.232±0.012 0.235±0.009
1×10-6 0.261±0.007 0.237±0.009 0.226±0.012＊
1×10-5 0.258±0.009 0.234±0.009 0.231±0.012
1×10-4 0.257±0.007 0.232±0.011 0.233±0.011
3　讨论
　　大量的研究发现 ,很多天然植物中的二萜类化合物在抑制
肿瘤方面有明显效果。如半边旗中二萜类化合物对人胃腺癌细
胞 、人低分化鼻咽癌细胞 、人肺腺癌细胞 、人早幼粒细胞白血病
细胞 HL-60、人红白细胞白血病 K562和人肝癌细胞等均具有抑
制作用。另外 ,穿心莲 、旱生香茶菜 、光叶番荔枝 、轮叶婆婆纳 、
高等真菌等中的二萜类成分等在抗肿瘤及免疫调节等方面也
显示活性分别对 HL-60细胞 、人肝癌细胞 、TJ905及 HeLa细胞
等具有显著的抗癌活性。国外在这方面也作了大量的工作 [ 6] 。
　　本研究结果显示 , 两种二萜类化合物 18-hydroxyferruginol
及 kayadiol可以明显抑制人白血病细胞 K562细胞的增殖 , 18-
hydroxyferruginol只在 1×10-4mol/L浓度有效 , 而 kayadiol作用
效果很明显 , 在 1 ×10-8mol/L～ 1×10-4mol/L浓度范围内均有
效 ,并且 kayadiol对鼠肉瘤细胞 S180细胞也有一定抑制作用 ,
是一个有开发潜力的化合物。
　　通过比较这三个二萜化合物的结构与其抑制肿瘤细胞增
殖的活性 ,我们发现 kayadiol属于苏丹烷(LAbdane)二环二萜类
化合物 , 而 18-hydroxyferruginol和 hinokiol属于三环二萜类化合
物 , kayadiol的活性明显高于 18-hydroxyferruginol和 hinokiol的
原因可能和 kayadiol少一个环有关 ,提示苏丹烷(LAbdane)二萜
类化合物 kayadiol具有较强的抑制肿瘤细胞的活性。
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Efectsof3 DiterpenesfromTorreyanuciferaonInhibitingProliferation
ofCulturedHumanLeukemiaK562 Celsinvitro
PanYongmei, WangJianhua, ShiQingwen, etal
(FacultyofPharmacy, HebeiMedicalUniversity, Shijiazhuang　 050017)
　　Objective:Tostudytheeffectsof3 diterpenes(18-hydroxyferuginol(A)、kayadiol(B)andhinokiol(C))fromTorreyanuciferaon
InhibitingproliferationofculturedhumanLeukemiaK562cellsinvitro.Methods:MTTwasusedtoobservetheeffectofinhibitingprolifera-
tionofhumanLeukemiaK562culturedinvitrowiththe3 diterpenesofdiferentconcentrationinitfordifferentperiodsoftime.Results:It
wasfoundthatcompoundsAhadtheefectsoninhibitingproliferationofhumanLeukemiaK562 culturedfor12h, 24hand36hatdoseof1
×10-4mol/L, andforcompoundB, culturedfor24h, 1×10-4mol/L～ 1 ×10-4mol/Lwereefective;for48h1×10-4mol/L～ 1×10-8ol/L
72 中药药理与临床 2009;25(2)
wereefective, andfor72h1×10-6ol/L～ 1×10-7ol/Lwereefective.CompoundChadnoefect.Inaddition, compoundBhadtheefecton
inhibitingproliferationofS180celsculturedfor72hatdoseof1×10-6mol/L.Conclusion:Diterpenes18-hydroxyferruginol(A)andkaya-
diol(B)havetheefectsoninhibitingtheproliferationofculturedhumanLeukemiaK562 celsinvitro.kayadiol(B)ismoreefective.
Keywords　 Torreyanucifera;18-hydroxyferruginol;kayadiol;hinokiol;humanLeukemiaK562cels;inhibitionproliferation
三氧化二砷诱导白血病 K562细胞凋亡与线粒体和内质网的作用＊
马艳云 ,陈　静 ,易　娟 ,王　蓓 ,魏虎来＊＊
(兰州大学基础医学院医学实验中心 ,甘肃省新药临床前研究重点实验室 , 兰州　730000)
　　摘　要　目的:研究三氧化二砷(Arsenictrioxide, As2O3)诱导白血病 K562细胞凋亡的机制以及线粒体和内质网的作用。方
法:采用 MTT比色法测定细胞增殖活性 , 细胞形态学和 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡 ,电镜观察凋亡细胞内质网和线粒体形
态结构变化;流式细胞术(FCM)测定线粒体跨膜电位(Δψm)、细胞内 Ca2+浓度 、活性氧(ROS)水平 、细胞色素 c(Cytc)含量及
Caspase-3活性;RT-PCR检测 GRP78mRNA表达 , Westernblot法检测 GRP78/Bip蛋白表达。结果:2mol/L和 5 mol/LAs2O3显著抑
制 K562细胞的增殖和诱导其凋亡。 As2O3诱导 K562细胞发生凋亡过程中 , 线粒体内外膜融合 , 嵴紊乱 ,肿胀 , 内膜扩张呈空泡样
变 , 内质网明显扩张和脱颗粒;线粒体 Δψm降低 , 细胞内 Ca2+浓度 、Cytc释放和 ROS水平明显升高 , Caspase-3活性显著增强;
GRP78 mRNA和蛋白表达无明显改变。结论:线粒体和内质网均参与 As2O3诱导 K562细胞的凋亡过程 , 但不能触发内质网应激反
应性凋亡。
　　关键词　三氧化二砷;K562细胞;线粒体;内质网;细胞凋亡
　　三氧化二砷(Arsenictrioxide, As2O3)是砒霜的活性成分 ,对
白血病及其它实体肿瘤均具有较强的抗肿瘤效应 , 且与常规化
疗药物无交叉耐药性 [ 1] 。我们的研究证实 As2O3可诱导白血
病 K562/ADM耐药细胞凋亡 , 并对多种凋亡相关基因的表达具
有调控作用 [ 2 ～5] 。 As2O3诱导抗肿瘤作用的机制比较复杂 , 包
括抑制细胞增殖 、诱导细胞分化 、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤血
管生成等 [ 1 ～ 4, 6] 。 本文以白血病 K562细胞为靶细胞 , 探讨
As2O3诱导白血病细胞凋亡的机制及线粒体和内质网的作用。
1　材料与方法
1.1　 试验药物　 As2O3为 Sigma公司产品 , 用 1.0mol/L的
NaOH溶解 ,调 pH至 7.0,配成 1 mmol/L溶液贮存备用。
1.2　材料　TRIzol试剂为美国 Invitrogen公司产品;AnnexinV/
PI试剂盒 、FITC荧光标记的活性 Caspase-3抑制物 DEVD-FMK
均为 Biovision公司产品。双氢-乙酰乙酸二荧光黄(2, 7-dichlo-
rodihydrofluoresceindiacetate, DCFH-DA)购自 Sigma公司。 FITC
标记抗细胞色素 c(Cytochromec, Cytc)单抗和 IgG1同型抗体
购自eBioscience公司;钙离子荧光探针Fluo-3/AM为 Biotium公
司产品。兔抗人 GRP78(Bip)抗体为 Spring公司产品 , 鼠抗人
β -actin抗体为 Biovision公司产品;IRDye700DX标记的羊抗兔
和 IRDye800CW标记的羊抗鼠红外荧光 IgG抗体购自 LI-COR
公司。 GRP78和 β -actin特异性引物由上海生物工程有限公司
合成。
1.3　靶细胞和细胞培养　K562细胞由兰州大学医学实验中
心保存。
1.4　方法　细胞接种于含 10%新生牛血清(兰州荣晔公司)的
RPMI1640培养液(美国 GibcoBRL公司)中 , 置 37℃、 5%CO2
和 100%湿度条件下培养。 K562细胞按 1×105 /ml接种 , 加入 2
mol/L和 5 mol/LAs2O3 , 置 CO2 培养箱 (HERACELL 150,
Heraeus)培养 12h-72h,收集细胞用于后续实验。
1.4.1　MTT比色法测细胞增殖活性。 　K562细胞接种 96孔
细胞培养板 ,加入不同浓度 As2O3培养 24、48和 72 h, 离培养终
点 4h加入 MTT,继续培养 4 h, 加入 10% SDS(含 0.01 Mol/L
HCl)过夜 , 自动酶标仪(Bio-TekPowerwave200X, 美国 Bio-Tek
公司出产)于 570 nm处测吸光度(A)值 , 并计算细胞增殖抑制
率(%)
1.4.2　 AnnexinV/PI双标记法检测凋亡细胞　收集 As2O3处
理的 K562细胞 , PBS洗涤 , 重悬于 BindingBufer中 , 加入 FITC
标记的 AnnexinV和 PI,室温避光染色 5min, 流式细胞仪(FCM,
Beckmann-CoulterEpicsXL, 美国 Beckman-Coulter公司出产)检
测 [ 4] 。
1.4.3　 细胞 、内质网和线粒体形态学观察　 离心收集 K562
细胞 , 3%戊二醛固定 ,经脱水 , 环氧树脂包埋 ,超薄切片 , 铀铅双
重染色后用透射电镜(JEM-1230, 日本电子公司出产)观察细
胞 、内质网和线粒体的形态学结构和及特征。
1.4.4　细胞内 Ca2+浓度测定　收集细胞 , PBS洗涤 , 加入荧
光探针附载剂 PF-123和 Ca2+荧光探针 Fluo-3 /AM, 37℃孵育
73中药药理与临床 2009;25(2)
＊ 基金项目:甘肃省科技攻关计划资助项目(编号:GS022-A43-137)　　　　＊＊通讯作者