全 文 ：论 　 　著
　　基金项目:武汉市科学技术局课题(200951499481)。
皂荚提取物对肝癌细胞小鼠 Smad4和
Smad7蛋白表达的影响
杜进军1 ,张赤志 2 ,许汉林 2 ,杨浩3 ,熊振芳 2 ,罗漪4 ,罗云 2 ,姜胜攀2
(1.武汉市中医医院 ,湖北 武汉 430014;2.湖北中医药大学 , 湖北 武汉 430061;
3.长江航运总医院 ,湖北 武汉 430015;4.武汉市第九医院 ,湖北 武汉 430081)
摘　要:目的　研究皂荚提取物对小鼠肝癌细胞 Smad4和 Smad7蛋白调控的影响。方法　造模采用小鼠右腋
皮下接种肝癌 H22细胞悬液的方法。实验分为模型对照组 、皂荚提取物 3个浓度组(26mg/d、 13mg/d、 7.8mg/d)和
阳性对照组(金龙胶囊)。通过免疫组化(Envision二步法)方法检测肝组织 Smad4和 Smad7蛋白的表达。结果　
阳性对照组和皂荚提取物高剂量组 Smad4、Smad7蛋白表达 、皂荚提取物中剂量组 Smad7表达与模型对照组比较差
异有统计学意义(P<0.05, P<0.01)。结论　皂荚提取物能增强 Smad4蛋白的表达和下调 Smad7蛋白的表达 , 从
而抑制肝癌细胞的生长。
关键词:肝癌细胞;鼠荚提取物;Smad4;Smad7;蛋白表达
中图分类号:R285　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1000-0704(2011)02-0003-02
　　皂荚又名皂角。其味辛 、咸 , 温 , 有小毒 , 归肺 、大肠经。 具
有 “祛顽痰 ,通窍开闭 , 祛风杀虫” [ 1]的作用。 2005年美国国立
癌症研究所和香港理工大学研究发现 , 皂荚具有抑制乳腺癌 、肝
癌等实体癌细胞生长的作用 [ 2] 。近年来研究发现 TGF-β /
Smads信号转导通路的异常传导是肝癌发生和发展的重要因素。
TGF-β /Smads信号转导通路传导发生障碍 , TGF-β 介导的抗
增殖信号不能正常下传 ,使细胞生长周期发生紊乱 ,导致细胞持
续分裂增殖 , 肝细胞发生癌变 [ 3] 。本实验观察皂荚提取物(乙酸
乙酯提取)对 TGF-β /Smads信号系统中 TGF-β 作用的底物
Smad4和 Smad7两个重要蛋白表达的影响 , 为研究皂荚提取物
抗肝癌的理论提供依据。
1　材料与方法
1.1　动物
昆明种小鼠 50只 ,体重(20±2)g, 雄性 , 清洁级(华中科技
大学同济医学院实验动物中心 , 合格证号:SCXK(鄂)2004 -
0007)。
1.2药物
皂荚提取物(由湖北中医药大学药学院许汉林教授研制并
提供)。金龙胶囊(北京建生药业有限公司)。
1.3　主要试剂与仪器
Smad4和 Smad7抗体(北京博奥森生物技术有限公司);两
步法抗兔 /鼠通用型免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限
公司)。超薄切片机(PowerTomePCUltramicrotome, 美国);电子
天平(AX205,梅特勒);离心机 (BFX5-320型 , 白洋离心机厂)
;生物组织自动包埋机(TB-718E型 , 中国);自动组织脱水机
(HD-300, 湖北惠达仪器有限公司);免疫组化图像分析软件
(ImageProPlusv6.0英文版)。
1.4　小鼠肝癌 H22细胞来源
腹水含有小鼠肝癌 H22细胞的昆明种小鼠 1只(由华中科
技大学同济医学院基础医学院雷章博士友情提供)。
1.5　造摸方法
通过颈椎脱臼法将荷瘤昆明种小鼠处死。收集含有 H22肝
癌细胞的腹水约 15mL, 4000r/min离心 3次 , 每次 3min, 间隔
1min。加入生理盐水调整细胞悬液中的细胞浓度至 4 ×109 /
L[ 4] 。于每只小鼠右腋下注射 0.2mL肿瘤细胞悬液。
1.6　分组与给药方法
造摸 1天后 , 随机将小鼠分为 5组:模型对照组(溶剂吐温
80对照组);皂荚提取物 3个浓度组(高剂量 26mg/d、中剂量
13mg/d、低剂量 7.8mg/d);阳性对照组(金龙胶囊组)。每组 10
·3·2011年 2月第 33卷第 2期Feb.2011.Vol.33, No.2 　　　　　　　　　　　　　　 湖北中医杂志HubeiJournalofTCM
只。每只小鼠灌胃量为 0.4mL/d。连续灌胃给药 15天后 ,第 16
天颈椎脱臼法处死小鼠 ,进行相关指标的检测。
1.7　Smad4和 Smad7蛋白免疫组化染色
取每只小鼠肝脏组织 ,采用病理学常规组织切片制作方法 ,
制作普通病理切片。然后对病理切片进行免疫组织化学染色。
免疫组化采用 Envision二步法 , 实验步骤如下:(1)石蜡切
片置于 65℃烘箱中 , 烘片 2h, 脱蜡至水 , 用 PBS(pH7.4)冲洗 3
次 , 每次 5min。 (2)柠檬酸微波修复:225mL蒸馏水 +4.5mL柠
檬酸(0.1mol/L)+20.5mL柠檬酸钠(0.1mol/L)混匀后倒入微
波修复盒内 , 将切片放入修复液内 , 高火 3min※中火 7min※低火
3min, PBS(pH7.4)冲洗 3次 ,每次 5min。 (3)甩去 PBS液 , 第一
抗体Smad4、Smad7按 1∶100浓度稀释。每张切片加入 50μL稀
释液 , 4℃过夜。 (4)PBS冲洗 3次 , 每次 5min。 (5)甩去 PBS
液 , 每张切片加 100μLA液(ChemMateTMEnVision+/HRP), 室
温下孵育 45min。(6)PBS冲洗 3×3min。 (7)甩去 PBS液 ,每张
切片加 100μL新鲜配制的 DAB溶液 , 室温下孵育 5min, 显微镜
控制显色。 (8)显色完全后 , 蒸馏水或自来水冲洗 ,苏木素复染 ,
0.1%盐酸分化 ,自来水冲洗 , PBS冲洗返蓝。(9)切片经过梯度
酒精(70-100%)脱水干燥 ,二甲苯透明 ,中性树胶封固。
免疫组化采用 ImageProPlusv6.0图像分析软件进行分析。
Smad4和 Smad7蛋白在肝脏组织中的表达 , Smad4和 Smad7蛋白
染色为棕黄色颗粒 , 蓝色的为细胞核。 Smad4在细胞膜周围表
达较多。 Smad7主要在肝锁周围表达 , 也在其他细胞中有少量
的表达。
1.8　统计学方法
数据以均数 ±标准差( x±s)表示 , 组间比较采用 t检验 , 采
用 SPSS11.5软件进行统计学分析。
2　结果
2.1　皂荚提取物对荷瘤小鼠肝脏组织中 Smad4蛋白表达的影
响
阳性对照组和皂荚提取物高剂量组与模型对照组比较 ,
Smad4蛋白表达增强 , 差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。
皂荚提取物中剂量组和皂荚提取物低剂量组与阳性对照组比
较 , Smad4蛋白表达减弱 ,差异有统计学意义 , 见表 1。
表 1　皂荚提取物对荷瘤小鼠肝脏 Smad4蛋白表达的影响　( x±s)
组别 n Smad4平均 OD值
模型对照组 10 1196.399±837.360
阳性对照组 10 2973.190±248.540＊＊
皂荚提取物高剂量组 10 2295.187±820.119＊
皂荚提取物中剂量组 10 1558.835±302.801
皂荚提取物低剂量组 10 988.614±338.995
　　与模型对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
2.2　皂荚提取物对荷瘤小鼠肝脏组织中 Smad7蛋白表达的影
响
阳性对照组和皂荚提取物高剂量组与模型对照组比较 ,
Smad7蛋白表达减弱 , 差异有统计学意义(P<0.01)。皂荚提取
物低剂量组与阳性对照组比较 , Smad7蛋白表达增强 , 差异有统
计学意义 ,见表 2。
表 2　皂荚提取物对荷瘤小鼠肝脏Smad7蛋白表达的影响　( x±s)
组别 n Smad7平均OD值
模型对照组 10 2239.589±272.892
阳性对照组 10 1454.381±302.405＊＊
皂荚提取物高剂量组 10 1494.202±399.553＊＊
皂荚提取物中剂量组 10 1496.981±505.121＊
皂荚提取物低剂量组 10 2330.056±177.105
　　与模型对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
3　讨论
近年来研究发现 , Smad4和 Smad7是 Smads蛋白家族的主
要成员 ,它们作为 TGF-β /Smads信号系统转导途径的下游分
子 ,与肝癌的发生和发展的关系非常密切。
Smad4与各种不同的 Smads蛋白协同作用是 TGF-β /
Smads信号系统转导中的重要步骤 ,一旦 Smad4表达降低 ,整个
通道就会被破坏 , TGF-β /Smads信号系统途径在肿瘤发展中的
抑制效应就会消失。张宇恒 [ 5]的实验结果提示 , Smad4低表达
与肝癌的发生发展及恶性程度密切相关 ,可能在肝癌的启动 、促
进 、发展或转移等阶段起重要作用。
Smad7蛋白是 Smads蛋白家族的抑制型 Smad蛋白。 Smad7
蛋白表达增强 , 影响细胞对 TGF-β /Smads信号系统的应答 , 有
助于肿瘤的发生以及促进细胞的恶性化进展 [ 6] 。
本研究结果表明 , 皂荚提取物能明显提高荷瘤小鼠肝脏组
织中 Smad4蛋白的表达 , 并能明显降低荷瘤小鼠肝脏组织中
Smad7蛋白的表达。从而可以加强 TGF-β /Smads信号转导通
路信号的传导 ,抑制肝癌细胞增殖 , 起到抗癌作用。
参考文献:
[ 1] 　雷载权.中药学 [ M].上海:上海科学技术出版社 , 2001:227-228.
[ 2] 　香港理工大学.中药皂荚浓缩液具有抗癌特性 [ J] .山东中医药大
学学报 , 2005, 31(4):286.
[ 3] 　ShiY.StructuraLinsightsonSmadfunctioninTGFbetasignaLing
[ J].Bioessays, 2001, 23(3):223-232.
[ 4] 　杨丽华 ,杨金霞 ,王学美 ,等.温度及冻融对壁虎抗 H22肝癌作用
的影响 [ J].中西医结合肝病杂志 , 2008, 18(4):225-228.
[ 5] 　张宇恒 ,张连峰.原发性肝细胞癌组织 Smad4、p21蛋白的表达及其
临床意义 [ J].山东医药 , 2008;48(31):9.
[ 6] 　ImYH, LeeHS, LeeHJ, etal.Prognosticsignificanceoftheexpression
ofSmad4andSmad7inhumangastriccarcinomas[J] .AnnalsofOncol-
ogy, 2004;15:574-580.
(收稿日期:2010-10-21　编辑:林飞)
·4· 湖北中医杂志　　　　　　 　　　　　　　　　2011年第 33卷第 2期