全 文 ：549※营养卫生 食品科学 2007, Vol. 28, No. 0
龙须菜藻红蛋白对H ela细胞增殖抑制及
其机制的研究
陈美珍，葛安山，崔鹏举，廖灶辉
(汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063)
摘 要：目的：探讨龙须菜藻红蛋白(PE)对人宫颈癌细胞Hela体外的抑制作用及其作用机制。方法：采用MTT
法检测不同浓度的藻红蛋白对Hela细胞增殖抑制效果。流式细胞仪和Annexin V-FITC / PI双荧光染色法观察藻红蛋
白对Hela细胞周期及细胞凋亡的影响。结果：PE可显著抑制Hela细胞的生长，并呈剂量－效应关系 (p＜0.01，
r=0.84)，剂量为20μg/ml，作用48h，其抑制率达70.88%，其48h的IC50值为4.12μg/ml。PE可阻滞Hela细胞从
G2/M期进入S期，诱导细胞凋亡。结论：PE对Hela细胞有较强的抑制作用，其作用机制部分与诱导Hela细胞调
亡有关。
关键词：龙须菜藻红蛋白； Hela细胞；细胞调亡
Study on Inhibition Effects of Phycoerythrin from Gracilaria lemaneiformis
on Hela Cells and Its Mechanism
CHEN Mei-zhen，GE An-shan，CUI Peng-ju，LIAO Zao-hui
(Department of Biology, College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)
Abstract ：Objective: To investigate the inhibition effects of phycoerythrin (PE) from Gracilaria leman iftheormison grow h
of Hela cells and its mechanism. Method: The proliferation of cell lines of Hela in vitrowas assayed by MTT me h d. Eff cts
of PE on Hela cells cycle and apoptosis were observed by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI fluorescence staining. Result:
PE could obviously inhibit the proliferation of Hela cells with a fair dose-effect relationship (p＜0.01，r =0.84). The
inhibitory rate at 48 h could reach more than 70% and its half inhibitory concentration (IC50) was 4.12μg/ml. PE could prevent
the transformation of Hela cell cycle from G2/M t S ph se to aus ap ptosis. Conclusion: PE shows potent inhibitory effects
on growth of Hela cells, and the mechanism is related to inducing the apoptosis of Hela cells.
Key words：phycoerythrin from Gracila ia lemaneiformis；Hela cell；apopt sis
中图分类号：R282.71；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)09-0549-04
收稿日期：2007-08-12
基金项目：汕头市科技计划资助项目(2006-149)
作者简介：陈美珍(1956-)，女，副教授，研究方向为天然活性物质。
藻红蛋白(phycoerythrin，PE)是大量存在于龙须菜
中的一种捕光色素蛋白，由载体蛋白和藻红胆素(发色
团)组成[1]。藻红蛋白作为光敏剂用于辅助激光治疗癌症
在国内外已得到广泛关注，李冠武等研究认为钝顶螺旋
藻R-藻红蛋白介导的光敏反应能诱导S180细胞和人肝癌
7721细胞的凋亡[2-4]。但藻红蛋白直接抗肿瘤作用的研究
鲜见报道。作者前期研究发现龙须菜藻红蛋白有清除体
外自由基作用，藻红蛋白粗提物能提高实验小鼠机体抗
氧化、抗突变和免疫能力，对小鼠移植性肿瘤S180的生
长有明显的抑制作用[5-7]。这说明龙须菜藻红蛋白潜在着
抗肿瘤活性。为了进一步了解龙须菜藻红蛋白的抗肿瘤
活性，本实验观察藻红蛋白体外对人宫颈癌细胞Hela生
长的抑制作用，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1材料
龙须菜藻红蛋白(PE)，纯度(A570/A280)达3.76，由
本实验室用新鲜龙须菜经提取、硫酸铵沉淀、羟基磷
灰石柱等分离纯化制得。
1.2试剂
RPMI-1640培养液、胰蛋白酶、MTT Sigma公
司；牛血清白蛋白(BSA)、考马斯亮兰G-250 Fluka公
2007, Vol. 28, No. 09 食品科学 ※营养卫生550
司；标准Mmark蛋白 上海生化研究所；小牛血清 杭
州四季青生物工程材料有限公司；Annexin V-FITC/PI凋
亡检测试剂盒 北京宝赛生物技术有限公司。
1.3细胞株
人宫颈癌细胞Hela 中科院上海生物细胞研究所。
1.4方法
1.4.1MTT法测定PE对Hela细胞生长的抑制作用[8-9]
取对数生长期的人宫颈癌细胞Hela，0.25%胰酶消
化，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调成细胞悬
液，浓度为5×104个细胞/ml，接种于96孔培养板中，
每孔20μl。于37℃，5% CO2培养箱中培养24h。然
后洗去培养液，每孔加入180μl含1%小牛血清的RPMI-
1640培养液，各孔分别加入不同浓度PE溶液各20μl(浓
度分别为：1.25、2.5 、5、10、20μg/ml)，每个浓
度设6个平行孔，阴性对照组加20μl无菌去离子水，
分别在培养24h和48h后取出3个平行孔，每孔各加入
20μl，5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h，小心吸弃
培养上清液，每孔加入20μl，37℃预温的DMSO液，
振荡10min，酶标仪作双波长检测，参考波长630nm，
测定570nm处的吸光度(A)，重复三次。统计数据，计
算抑制率。
1一实验组A值
癌细胞抑制率(%)＝ ————————× 100
对照组A值
1.4.2流式细胞仪测定细胞周期 [10]
Hela细胞制成2.5×105个/ ml的细胞悬液，取1ml
接种到25ml培养瓶中，另加2ml RPMI-1640培养液，于
CO2培养箱中培养18h使细胞贴壁。吸弃培养液，无菌
PBS洗涤三次，加入3ml终浓度为2.5、、10μg/ml的
PE作用液，同时设空白，继续培养48h。弃去PE作
用液，PBS浸洗两次，收集细胞，加入 0.25ml PBS和
5ml预冷的70%乙醇于4℃下固定12h，离心，PBS洗
涤除尽乙醇，离心后PI染色30min，用流式细胞仪检测
各组细胞周期。
1.4.3Anexin V-FITC / PI双荧光染色检测凋亡细
胞[11-12]
细胞凋亡早期由于细胞内钙离子的流动，谷氨酰胺
转移酶的转化，使胞浆膜磷脂分布的不对称性被破坏，
导致细胞膜内层的磷酯酰丝氨酸(PS)翻转到膜外，而
Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋
亡过程中翻转到膜外的PS特异性结合，以标记了FITC(显
示绿色荧光)的Annexin V作为荧光探针可检测细胞凋亡的
发生[12-13]。propidium iodide(PI)是一种极性核酸染料，对
活细胞不起作用，仅能进入凋亡晚期或坏死细胞的细胞
核，与DNA结合使之发出红色荧光[14]。将Annexin V与
PI匹配使用，可将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及坏
死细胞区分开[15]。Annexin V-FITC / PI双荧光染色是一种
较新的细胞调亡检测方法，实验操作如下。
选取对数期生长的Hela细胞，常规消化，RPMI-
1640培养液制成5×105个/ml的细胞悬液。 将盖玻片置
于6孔板中，加入2ml 10%小牛血清、1ml细胞悬液于
CO2培养箱中培养18h。细胞贴壁后小心吸弃培养液，
PBS浸洗三次，然后加入不同浓度的PE溶液(2.5、5、
10μg/ml)3ml，空白对照组加等量的PBS，继续培养24h
和48h。弃去培养液，PBS洗涤数次，得细胞爬片。将
制备好的细胞爬片立即放入Annexin V-FITC / PI双荧光
染色工作液中室温避光染色15min，细胞面朝上放于载
玻片上，荧光显微镜观察拍照。
Annexin V-FITC / PI双荧光染色工作液组成[11]：
20μg/ml的 Annexin V-FITC 10μl，Binding 缓冲液50μl，
50μg/ml的 PI 5μl。
1.5数据处理
用SPSS10.0统计软件，统计数据采用均数±标准差
(X±S)表示，组间差别均采用t检验。
2 结果与分析
2.1PE对Hela细胞株体外生长的影响
MTT法检测了PE对Hela细胞生长的抑制作用，结
果如表1。对表1中PE的浓度与抑制率作相关分析，得
到作用24h的r=0.74、半数抑制率(IC50)为8.9μg/ml，作
用48h的r=0.84、IC50为4.12μg/ml。
剂量(μg/ml)
24h 48h
A570 抑制率(%) A570 抑制率(%)
0 1.04±0.08－ 1.06±0.16 －
1.25 0.86±0.0817.820.57±0.14△ 48.04
2.5 0.56±0.06* 46.150.44±0.09△ 58.97
5 0.48±0.03* 54.640.40±0.06△ 63.24
10 0.45±0.03* 57.070.38±0.05△ 64.31
20 0.38±0.06* 64.180.32±0.06△ 70.88
表1 PE对Hela细胞的抑制作用
Table 1 MTT detection results of PE on Hela cell
注：与空白组比较，*p＜0.01；△p＜0.01。
从表1数据分析可见，PE对人宫颈癌细胞Hela
的生长有显著的抑制作用，并呈剂量依赖性，剂量
为20μg/ml、作用24h和48h后，其抑制率分别为
64.18%和70.88%。
2.2PE对Hela细胞周期的影响
Hela细胞经PE作用24h和48h后，细胞中S期细胞
的百分比随着剂量的增加明显下降，G2/M期细胞百分比
上升，提示PE可将细胞周期阻滞在G2/M期，降低Hela
细胞分裂能力，抑制其增殖，结果见表2和图1。
551※营养卫生 食品科学 2007, Vol. 28, No. 0
PE剂量(μg/ml)
24h 48h
G1/G0 S G2/M G1/G0 S G2/M
0 51 39.49.6 52.237.810.2
2.5 51 28.420.456.18.825.1
5 53.121.825.157.512.829.7
10 2.720.826.557.412.430.2
表2 PE对Hela 细胞周期分布的影响(%)
Table 2 Influence of PE on cell cycle distribution of Hela cells(%)
660
550
440
330
220
110
0
0 64 128 192
细
胞
数
FL3 LIN
2
420
350
280
210
140
70
0
0 64 128 192
细
胞
数
FL3 LIN
3
60
50
40
30
20
10
0
0 64 128 192
细
胞
数
FL3 LIN
4
2.3PE对Hela细胞凋亡的影响
对由不同剂量的PE分别作用Hela细胞24h和48h，
经Annexin V-FITC / PI双荧光染色后的
细胞照片见图2。
从图2中可见，在剂量为0～10μg/ml范围内，随
720
600
480
360
240
120
0
0 64 128 192
细
胞
数
FL3 LIN
1
1～4 PE的浓度分别为0、2.5、、10μg/ml。
图1 PE对Hela细胞周期的影响(作用48h)
Fig.1 Cell cycle distribution by flow cytonmetry analysis in PE-
treated Hela cells after 48 hours
着PE剂量的增加和作用时间的延长，呈绿色荧光和红
色荧光的细胞均随之增多，说明凋亡细胞和凋亡晚期或
坏死细胞增加。
3 讨 论
鉴于体外培养的动物细胞系不能很好地预测人体的
反应，利用人肿瘤细胞系进行抗肿瘤药物的研究被普遍
采纳。体外实验表明，PE对人宫颈癌Hela细胞的生长
有显著的抑制作用，这种作用具有明显的剂量依赖性。
藻红蛋白能将Hela细胞周期阻滞在G2/M期，抑制细胞
a b
c d
e f
2007, Vol. 28, No. 09 食品科学 ※营养卫生552
[2]PHILIPS D. Chemical mechanisms in phothodynamic therapy with
phthalocyanines[J]. Prog Reaction Kinetics, 1997, 22: 175-300 .
[3]张小强, 龚兴国, 梁倩, 等. 三种藻胆蛋白对人乳腺癌Bcap-37细胞
的光动力杀伤效果[J]. 浙江大学学报: 理学版, 2005, 32(4): 438-441.
[4]李冠武, 王广策, 温博贵, 等. 藻红蛋白介导的光敏反应可诱导人肝
癌7721细胞凋亡[J]. 肿瘤防治杂志, 2002, 9(2): 144-146.
[5]陈美珍, 张永雨, 余杰, 等. 龙须菜藻胆蛋白的分离及其清除自由基
作用的初步研究[J]. 食品科学, 2004, 25(3): 159-162.
[6]陈美珍, 余杰, 钟秋玲, 等. 龙须菜藻胆蛋白免疫功能和抗氧化作用
的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(9): 456-459.
[7]张永雨, 陈美珍, 余杰, 等. 龙须菜藻胆蛋白抗突变与抗肿瘤作用的
研究[J]. 中国海洋药物, 2005, 35(3): 159-162.
[8]杨汉民. 细胞生物学实验[M]. 北京: 高等教育出版社, 1997: 112-119.
[9]BANK U, REINHOLA D, ANSORGE S. Measurement of cellular activ-
ity with the MTT test: optimization of the method[J]. Allerg Immunol
(Leipz), 1991, 37: 3-4.
[10]BOWEN W P, CYTOMETRY M. A high throughput approach to cell
cycle analysis[J]. Microscopy, 2005(1): 1-2.
[11]赵卫红, 寿好长, 闫福岭. 细胞凋亡[M]. 郑州: 河南医科大学出版社,
1997: 256-180.
[12]VERMES I, HAANEN C, STEFFENS N H, et al. A novel assay for
apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression
on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V[J]. Immunol
Methods, 1995, 184: 39.
[13]初开秋, 韩俐, 王斌, 等. SLE 病人外周血淋巴细胞早期凋亡状态的
检测[J]. 齐鲁医学杂志, 2003, 18(1): 15-17.
[14]王兴武, 魏玲, 宋现让, 等. 三氧化二砷对人宫颈癌Hela细胞生长增
殖的影响[J]. 中国现代医学志, 2006, 15(5): 699-702.
[15]HUANG W W , YANG J S, LIN C F, et al. Pycnogenol induces
differentiation and apoptosis in human promyeloid leukemia HL-60 cells
[J]. Leuk Res, 2005, 29(6): 685-692.
图2 PE作用Hela细胞 24～48h的荧光照片
Fig.2 Fluorescence photo of PE on hela cell after 24～48 hours
a：空白；b、c、d分别为：2.5、、10μg/ml，处理24h，×400；
e：空白；f、g、h分别为：2.5、、10μg/ml，处理48h，×400。
g h
增殖并诱导细胞调亡。目前认为很多肿瘤的发生是由于
其细胞凋亡通道受阻而引起的，因此诱导肿瘤细胞凋亡
是一条抗肿瘤的有效途径。我们的研究还发现PE对小
鼠体内移植性S180肉瘤和肝癌H22肿瘤的生长都有一定的
抑制作用，但一定剂量的PE对正常小鼠和细胞生长均
有促进作用。研究结果揭示了龙须菜藻红蛋白具有抗肿
瘤等生理活性。我国龙须菜资源日益丰富，其藻体含
19.14%的粗蛋白，而藻红蛋白占总蛋白的50%以上，但
藻红蛋白至今未被利用。如果在提取龙须菜琼脂的同
时，也能够将其PE提取综合利用，开发成保健食品或
海洋药物，这对提高龙须菜的经济价值将会起着重要的
作用。
参考文献：
[1]张成武, 殷志敏, 欧阳平凯. 藻胆蛋白的开发与利用[J]. 中国海洋
药物, 1995(3): 53-54.
????????
信 息
????????
?
?
? 研究显示一种蛋白可用来简单鉴别干细胞
美国研究人员发现，一种特定蛋白也许可用来区分干细胞和干细胞分化的细胞，从而使从各种组织中分离干细
胞变得简单。
干细胞能分化成其他细胞，但并非一蹴而就，而是分多个阶段完成并在这个过程中逐渐失去干细胞的特性。干
细胞第一阶段分化的是祖细胞。美国约翰斯·霍普金斯大学的尼古拉斯·加亚诺等人发现，一种名为CFB1的蛋
白与这一阶段密切相关。
研究人员在最新一期《自然》杂志上撰文说，他们用基因工程技术培育出了一种小鼠胚胎，当CFB1蛋白发
挥作用时，这种胚胎就会发绿光。
他们发现，随着胚胎的发育，其中一些通常被认为是神经干细胞的细胞不再发光，这表明CFB1蛋白已失去了
效用。进一步研究显示，这些细胞已不再是真正的神经干细胞，而是分化成了祖细胞。研究人员因此推测，CFB1
蛋白能区分神经干细胞是否已发育成祖细胞。
实验还证明，当神经干细胞中的CFB1蛋白被“关闭”时，神经干细胞迅速分化为祖细胞。不过，当CFB1
蛋白被再次“打开”时，祖细胞并不能再还原为干细胞。研究人员说，从生物化学角度看，一旦CFB1蛋白被
“关闭”，“所发生的一切就好似开通了一条单行道”。
研究人员此前进行的另一项小鼠实验表明，在血液干细胞分化过程中，CFB1蛋白也扮演着同样角色。他们因
此推测，CFB1蛋白能在多个组织中用来区分干细胞和干细胞分化的细胞。