全 文 ：分子植物育种，2010年，第 8卷，第 4期，第 800-803页
Molecular Plant Breeding, 2010, Vol.8, No.4, 800-803
研究资源
A Resource
单叶省藤三种组织 RNA提取和全长 cDNA文库构建
杨帆 1,2 李发根 1 翁启杰 1 李梅 1 洪亚辉 2 甘四明 1*
1中国林业科学研究院热带林业研究所,广州, 510520; 2湖南农业大学生物科学技术学院,长沙, 410128
*通讯作者, Siming.Gan@ritf.ac.cn
摘 要 本实验比较了 3种 RNA提取方法提取单叶省藤的茎、雄花序和根的结果，改良 CTAB法和 Trizol
法提取的 RNA无明显降解、完整性好，均可用于 cDNA文库构建，而异硫氰酸胍法提取的 RNA降解严重；
考虑到改良 CTAB法成本较低，故推荐为首选方法。将茎、雄花序和根三种组织的 RNA等量混合后，利用
SMART策略构建了全长 cDNA文库；通过涂平板培养后的菌落计数，测得初库滴度为 2.91×105 cfu/μL；从
培养平板上随机挑取 16个菌落进行 PCR检测，文库重组率为 87.5%，插入片段平均长度为 1.5 kb左右。所
建文库的质量可靠，为下一步的 EST测序和候选基因发现提供了材料基础。
关键词 单叶省藤, RNA提取, cDNA文库
Comparison of Three RNA Isolation Methods for Three Tissues of Calamus
simplicifolius and Construction of a Full-length cDNA Library
Yang Fan 1,2 Li Fagen 1 Weng Qijie 1 Li Mei 1 Hong Yahui 2 Gan Siming 1*
1 Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou, 510520; 2 College of Biological Science and Technology, Hunan
Agricultural University, Changsha, 410128
* Corresponding author, siming.gan@ritf.ac.cn
DOI: 10.3969/mpb.008.000800
Abstract In this research, by comparing the results among three procedures for isolating total RNA from stem,
male inflorescence and root of Calamus simplicifolius, we found that modified CTAB method and Trizol method
were better than guanidnium isothiocyanate method on yield and quality of RNA from all the three tisues. As
modified CTAB method was more cost-effective than the Trizol, it was recommended as the sound choice of RNA
isolation. Then, we constructed a full-length cDNA library in accordance with SMART strategy and by using a
mixture of RNA of the three tissues. The titer of the library was 2.91×105 cfu/μL. PCR of 16 colonies selected ran-
domly from the culture indicated that the recombination rate and mean insert size were 87.5% and around 1.5 kb, re-
spectively. The cDNA library constructed here should be qualified for subsequent EST sequencing and candidate
gene discovery in C. simplicifolius.
Keywords Calamus simplicifolius, RNA isolation, cDNA library
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.008.000800
基金项目：本研究由国家科技支撑计划(2006BAD19B0901)和国家高技术研究发展计划重点项目(2006AA100109)共同资助
单叶省藤 (Calamus simplicifolius Wei.)，棕榈科
(Palmae)、省藤亚科(Calamoideae)、省藤族(Calameae)
植物，是我国特有藤种之一，天然分布于海南岛东部
以及南部 300~1 100 m的原始林和次生林(许煌灿,
2002)。单叶省藤的藤茎具有良好的工艺特性，是编
制家具和工艺品的优良材料。目前，该藤种已引种到
广东、广西和福建等省(区)，是华南地区推广栽培的
优良藤种之一。虽然已开展了一些单叶省藤常规育
种、组织培养(许煌灿, 2002)及性别早期鉴定(Li et al.,
2010)等研究工作，但功能基因研究方面尚是空白。
cDNA文库及其测序是功能基因研究和基于基
因的分子标记开发的重要资源。本文以单叶省藤的
茎、雄花序和根为材料，在比较三种 RNA提取方法
的基础上，构建了全长 cDNA文库，以期为单叶省藤
cDNA测序和功能基因研究提供便利。
1结果与分析
1.1 RNA提取效果的比较
改良 CTAB法、Trizol法和异硫氰酸胍法提取的
单叶省藤三种组织 RNA的电泳结果见图 1。总的来
说，改良 CTAB法提取的 RNA具有明显的 28S和
18S以及较弱的 5S谱带，表明 RNA无明显降解、完
整性好；Trizol法提取的 RNA的 28S和 18S谱带较
明亮，表明 RNA仍然比较完整；异硫氰酸胍法提取
的 RNA的 28S和 18S很弱，降解严重，而 5S浓度极
高。改良 CTAB法和 Trizol法提取的 RNA无明显降
解，18S浓度约为 28S的一半，无其它杂带，表明
RNA纯度较高，没有 DNA、蛋白质和酚类物质污染，
应可用于文库构建。但考虑到改良 CTAB法成本较
低，推荐为首选的 RNA提取方法。
改良 CTAB法提取的茎、雄花序和根 RNA的浓
度分别为 620 ng/μL、2 400 ng/μL和 770 ng/μL。各取
12.9 μL、3.3 μL和 10.3 μL等量混合后，OD260值为
60.7，OD280值为 29.3，OD260/OD280比值为 2.05，表明
RNA纯度高、完整性好，满足 cDNA合成的需要。
1.2 cDNA合成与检测
合成的双链 cDNA 的电泳结果见图 2。双链
cDNA的弥散条带主要分布在 100~4 000 bp，表明成
功进行了双链 cDNA的合成。1 000~4 000 bp的条带
也较明亮，表明切取该范围的双链 cDNA用于连接
转化是可行的。
1.3文库质量检测
文库稀释 10 倍的平板菌落数为 1 672 个单克
隆、稀释 100倍为 124个单克隆，则初库滴度为：
[(1672/10+124)/2]×100/0.5=2.91×105 cfu/μL。
从培养平板中随机挑取 16个单菌落进行 PCR
检测(图 3)，平均片段长度约为 1.5 kb；出现 2个空载
片段 (图 3,菌落 6和 16)，其余 14个为有效插入片
段，重组率为: 14/16=87.5%。
2讨论
单叶省藤多种组织的表皮角质化程度较高，如何
提取高质量的 RNA是构建文库的基础。改良 CTAB
法可有效去除多糖和多酚类物质(刘洋等, 2006)，并
图 1三种方法提取单叶省藤茎、雄花序和根 RNA
注: A:改良 CTAB法; B: Trizol法; C:异硫氰酸胍法; M: DNA分子量标准; 1:茎; 2:雄花序; 3:根
Figure 1 Total RNA isolated from three tissues of Calamus simplicifolius using three isolation methods
Note: A: Modified CTAB method; B: Trizol method; C: Guanidnium isothiocyanate method; M: DNA size ladder; 1: Stem; 2: Male in-
florescence; 3: Root
图 2双链 cDNA的凝胶电泳
注: M: DNA分子量标准; 1:双链 cDNA
Figure 2 Gel electrophoresis of double strand cDNA
Note: M: DNA size ladder; 1: Double strand cDNA
图 3随机挑取 16个菌落的 PCR检测
注: M: DNA分子量标准; 1~16:菌落
Figure 3 PCR of randomly selected 16 colonies
Note: M: DNA size ladder; 1~16: Colonies
单叶省藤三种组织 RNA提取和全长 cDNA文库构建
Comparison of Isolation Methods for Tissues of C. simplicifolius and Construction of a Full-length cDNA Library
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding
且操作简捷、成本低。本研究中，利用改良 CTAB法
提取的单叶省藤茎、雄花序和根的总 RNA的杂质
少、纯度高、完整性好，因此，该法的适用性较强。但
要注意的是，LiCl浓度不宜过高，因为残留的 LiCl会
对之后的第一链合成带来不利影响(林海妹等, 2009)。
另外，Trizol法提取的 RNA也较完整，可用于文库构
建，但是考虑到试剂盒的成本较高，推荐在经费允许
的条件下使用。
异硫氰酸胍法提取的单叶省藤三种组织的
RNA的 18S和 28S浓度极低，是一种不适用的方
法。该法中，细胞裂解液的主要作用是破坏蛋白的二
级结构，肌氨酸钠和柠檬酸钠等组分不能有效去除
多糖等次生代谢物质，因而不适合根和花等多糖含
量较高的组织的 RNA提取。
本实验将三种组织的 RNA等量混合后再进行建
库，这样可以有效减少后期表达序列标签(expressed
sequence tag, EST)测序的冗余度，降低成本。类似做法
也广泛用于其它植物，如大豆(Glycine max (L.) Merr.)
全长 cDNA文库构建中利用多种组织的混合 RNA
(Umezawa et al., 2008)、日本柳杉(Cryptomeria japonica
D. Don) 雄球果全长 cDNA文库构建中利用不同发
育时期的混合 RNA (Futanura et al., 2008)。
许德荣等(2010)利用类似方法构建了狼毒大戟
(Euphorbia fischeriana Steud.)根的全长 cDNA文库，
滴度、重组率和插入片段长度分别为 2.0×105 cfu/μL、
91%和 1.0 kb以上，并进行有效的 EST测序，发现了
一批候选基因。本文所建文库滴度 2.91×105 cfu/μL、
重组率 87.5%、插入片段平均长度为 1.5 kb左右，与
许德荣等(2010)的文库参数非常接近。因此，文库质
量可靠，这为下一步的 EST测序和候选基因发现提
供了材料基础。
3材料与方法
3.1植物材料
单叶省藤的根和茎采自中国林科院热带林业研
究所苗圃的幼苗，雄花序采自中国林科院热带林业
实验中心的单叶省藤人工林，样品洗净后立即放入
液氮保存。
3.2 RNA提取
利用三种 RNA提取方法，包括改良 CTAB法、异
硫氰酸胍法和 Trizol法。茎、雄花序和根各取 500 mg。
改良 CTAB法参考刘洋等(2006)，提取液 700 μL/样：
2% CTAB、2% PVP、100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、
25 mmol/L EDTA (pH 8.0)、2 mol/L NaCl，使用前加
入 2%的 β-巯基乙醇；沉降过程中LiCl浓度调整为
10 mol/L。异硫氰酸胍法参考何秋伶等(2006)，异硫
氰酸胍变性裂解液 700 μL/ 样：0.78 mol/L 柠檬酸
钠、10%肌氨酸钠、66.1%异硫氰酸胍，使用前加入
1%的 β-巯基乙醇。Trizol法参考陈士林等(2008)，
Trizol提取液购自英杰公司，500 μL/样。
最后获得的 RNA沉淀用适量的 RNAse-free水
重悬。RNA完整性通过 1.1%琼脂糖凝胶电泳测定，
RNA 浓度和纯度利用核酸蛋白仪 Biophotometer
(Eppendorf)测定。提取的 RNA保存于-70℃备用。
3.3 cDNA合成和文库构建
本实验利用各组织的质量最好的 RNA等量混
合，采用 Creator SMART cDNA Library Construction
Kit (Clonetech)建库。建库过程中，cDNA第一链的合
成、双链 DNA的合成以及双链 DNA的蛋白酶 K消
化和 SfiⅠ限制性酶消化参考试验盒的说明进行。
双链 cDNA的分级分离通过琼脂糖凝胶电泳后
切胶回收。双链 cDNA 90 μL与Marker在不同泳道
经琼脂糖凝胶(未加染料)电泳后，切下 Marker置于
Goldview染料(20倍稀释) 20 min，再将 Marker放回
凝胶原来位置，在紫外灯下切取 1~4 kb范围的双链
cDNA片段。胶块 68℃水浴 10 min，加入 2.5%融胶
酶、水浴 30 min。加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:
24:1)抽提一次和氯仿:异戊醇(24:1)抽提二次，再加等
体积异丙醇、1/10 体积的 3 mol/L 醋酸钠和 3 μL
Takara m-s核酸共沉剂，-20℃沉降 20 min，15 000×g
离心 30 min，沉淀用 80%乙醇洗涤，真空干燥 10 min，
加入 20 μL去离子水重悬沉淀。取 2 μL溶液进行琼
脂糖凝胶电泳检测。
利用载体 pDNR-LIB (Clonetech)连接回收的双
链 cDNA。连接体系 14 μL：6 μL cDNA、1 μL载体、
7μLSolution (内含ATP、buffer和DNA连接酶)。12℃
温育过夜，按上一步抽提、沉降、洗涤和重悬，即建成
初级文库。
连接产物通过电激转化感受态细胞DH10B。连接
产物 0.5μL加入感受态细胞 49μL，电激电压 1 800V、
时间 3.9 ms。转化产物加入 950μL无抗 LB液体培养
基，37℃ 1 h振荡培养 (230 r/min)。培养产物加入 LB
液体培养基(2倍浓度)+甘油(40%)混合物中，-70℃保
存，即完成文库构建。
3.4文库质量测定
取保存文库 30 μL加入 270 μL LB液体培养基
(稀释 10倍)，混匀后取出 100μL涂布于含有 50 μg/mL
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氯霉素的 LB 固体培养基上，再取出 30 μL 加入
270 μL LB液体培养基(稀释 100倍)、取 100 μL涂
板。37℃倒置培养 18 h左右，进行菌落计数，并计算
文库滴度，公式为：滴度(cfu/μL)=菌落数×(电转后菌
液总量 /涂板量)/用于电转量。
随机挑取 16 个单菌落于 PCR 管中，PCR 体系
为 20 μL：5 pmol通用引物 M13-F (5-GTAAAACG
ACGGCCAGT-3)、5 pmol M13-R (5-AAACAGCTA
TGACCATGTTCA-3)、Advantagek polymerase mix
0.4 μL。PCR扩增程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃
30 s，72℃ 3 min，30个循环；72℃延伸 10 min。PCR
产物经 1.1%琼脂糖凝胶电泳检测。
参考文献
Chen S.L., Sun Y.Q., Song J.Y., Li Y., Li C.J., Hu S.N., and
Zhang X.W., 2008, Analysis of expressed sequence tags
(EST) from Panax quinquefolium root, Yaoxue Xuebao (Acta
Pharmaceutica Sinica), 43(6): 657-663 (陈士林,孙永巧,宋
经元,李滢,李晨吉,胡松年,李西文,姚辉,张晓伟, 2008,
西洋参 cDNA文库构建及表达序列标签(EST)分析,药学
学报, 43(6): 657-663)
Futanura N., Totoki Y., Toyoda A., Igasaki T., Nanjo T., Seki M.,
Sakaki Y., Mari A., Shinozaki K., and Shinohara K., 2008,
Characterization of expressed sequence tags from a full-length
enriched cDNA library of Cryptomeria japonica male strobili,
BMC Genomics, 9: 383
HeQ.L., Chen Y., Li T., Zhang L., Zhou J., HuangM., andWangM.,
2006, Construction and characterization of cDNA library
from petals of Lycoris longituba, Zhongguo Shengwu
Gongcheng Zazhi (China Biotechnology), 26(S): 65-68 (何
秋伶,陈英,李恬,张露,周坚,黄敏仁,王明庥, 2006,长筒
石蒜花瓣 cDNA文库的构建与分析,中国生物工程杂志,
26(S): 65-68)
Li M., Yang H., Li F., Yang F., Yin G., Gan S., 2010, A
male-specific SCAR marker in Calamus simplicifolius, a
dioecious rattan species endemic to China, Mol. Breed., 25:
549-551
Lin H.M., Guo A.P., Wang X.L., Guo Y.L., Kong H., and He L.K.,
2009, Comparison study on three modified extracting meth
ods for Oryza longisatminata root and leaves total RNA, Fenzi
Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 7(1): 204-208
(林海妹,郭安平,王晓玲,郭运玲,孔华,贺立卡, 2009,三
种改良提取长雄野生稻根叶总 RNA方法的比较研究,分
子植物育种, 7(1): 204-208)
Liu Y., He X.R., Ma H.B., Wu Y.L., and Yang Y.M., 2006, Ex-
traction of total RNA from cotton (Gossypium hirsutum L.)
tissues with CTAB-PVP method, Zhongguo Nongye Daxue
Xuebao (Journal of China Agricultural University), 11(1):
53-56 (刘洋,何心尧,马红波,吴泳历，杨佑明，2006,用
CTAB-PVP法提取棉花各组织总 RNA的研究,中国农业
大学学报, 11(1): 53-56)
Umezawa T., Sakurai T., Totoki Y., Toyoda A., Seki M., Ishiwata
A., Akiyama K., Kurotani A., Yoshida T., Mochida K., Ka-
suga M., Todaka D., Maruyama K., Nakashima K., Enju A.,
Mizukado S., Ahmed S., Yoshiwara K., Harada K., Tsub-
okura Y., Hayashi M., Sato S., Anai T., Ishimoto M., Fu-
natsuki H., Teraishi M., Osaki M., Shinano T., Akashi R.,
Sakaki Y., Yamaguchi-Shinozaki K., and Shinozaki K.,
2008, Sequencing and analysis of approximately 40 000
soybean cDNA clones from a full-length-enriched cDNA li-
brary, DNA Res., 15: 333-346
Xu D.R., Tang Q., Liang Y.H., Cao H.B., Wang X.S., Zhou H.K.,
Li Y.L., Liu G., Liu G.J., and Qiu D.Y., 2010, cDNA library
construction and EST sequencing of Euphorbia fischeriana,
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 8(1):
139-144 (许德荣,唐其,染延海,曹海波,王雪松,赵厚坤,
李云龙,刘光,刘官久,邱德有, 2010,狼毒大戟 cDNA文
库构建及 EST测序,分子植物育种, 8(1): 139-144)
Xu H.C., Yin G.T., Sun Q.P., and Wu J.K., 2002, Research and
development of rattan in China, Linye Kexue (Scientia Silvae
Sinicae), 38(2): 51-56 (许煌灿,尹光天,孙清鹏,吴金坤, 2002,
棕榈藤的研究和发展,林业科学, 38(2): 51-56)
单叶省藤三种组织 RNA提取和全长 cDNA文库构建
Comparison of Isolation Methods for Tissues of C. simplicifolius and Construction of a Full-length cDNA Library
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