全 文 ：农业环境科学学报 2007,26(4):1375-1379
JournalofAgro-EnvironmentScience
摘 要:以 1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)处理后斜生栅藻的生长状况、蛋白质含量、叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶
(POD)活性、丙二醛(MDA)含量和培养液总有机碳(TOC)含量的改变来检测1,2,4-TCB对斜生珊藻的毒性效应及其毒性作用机制。
结果表明,1,2,4-TCB对斜生栅藻的生长有一定的抑制作用,表现出一定的浓度和时间依赖性;1,2,4-TCB处理 4d后,斜生栅藻细
胞蛋白质含量下降,10mg·L-1和15mg·L-11,2,4-TCB处理后,藻细胞中可溶性蛋白质含量比对照组分别下降了 62.89%和 80.22%,
叶绿素 a,b和总叶绿素含量下降,叶绿素 a含量下降最显著,在 5mg·L-1处理组即表现出显著的统计学差异;膜结合酶 SOD和
POD活性降低,15mg·L-1TCB组藻细胞的SOD和 POD活性分别是对照组的 40.57%和 77.42%;脂质过氧化产物 MDA含量升高,
培养液中TOC含量升高,其中10mg·L-1和15mg·L-11,2,4-TCB处理组TOC含量分别比对照组高57.95%和72.55%。这表明1,2,4-
TCB对斜生栅藻的生长及各种生理功能产生毒害效应,其作用机制可能与藻细胞生物膜通透性和生物膜及其他生物大分子的脂质
过氧化有关。
关键词:1,2,4-三氯苯;斜生栅藻;毒性效应
中图分类号:X592 文献标识码:A 文章编号:1672-2043(2007)04-1375-05
收稿日期:2006-11-06
基金项目:国家“985”工程二期项目(32000-3253282)
作者简介:杜青平(1972—),女,山西人,博士,主要从事环境毒理学方
面的研究。E-mail:qpdu2008@126.com
通讯作者:贾晓珊
1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)是一种氯代芳香烃类
化合物,主要用作印染载体、电解液、润滑剂、导热剂
等的生产原料和中间体[1、2],后来在电化学工业中用作
多氯联苯的代用物曾大量投入使用[3]。美国环境保护
局已将1,2,4-三氯苯确定为重要的环境污染物。许多
国家已经禁止使用或者限制使用三氯苯产品。因此近
十年国外大量的三氯苯产品销往我国和一些不发达
国家。且随着我国经济近年来的飞速发展,一些大规
模三氯苯生产企业投入生产,我国环境中的 1,2,4-
1,2,4-三氯苯对斜生栅藻的毒性效应及其机制研究
杜青平 1,2,黄彩娜 1,贾晓珊 1
(1.中山大学环境科学与工程学院,广东 广州 510275;2.广东工业大学环境科学与工程学院,广东 广州 510006)
ToxicEfectsandMechanismsof1,2,4-TrichlorobenzeneonScenedesmusobliquus
DUQing-ping1,2,HUANGCai-na1,JIAXiao-shan1
(1.SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China;2.FacultyofEnvironmentalSci-
enceandEngineering,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)
Abstract:Toxicefectsof1,2,4-trichlorobenzene(1,2,4-TCB)onScenedesmusobliquuswerestudiedthroughinvestigatingthegrowth,the
contentofproteinandthecontentofchlorophyl.Thetoxicmechanismsof1,2,4-TCBwereanalyzedbydeterminingtheSODandPODactivi-
ties,thecontentofMDAandTOCinthealgae.Thegrowthofalgaewasinhibitedby1,2,4-TCBintime-responseanddose-responseman-
ners.Comparedwiththecontrol,thecontentofsolubleproteininS.obliquusdecreasedby62.89%and80.22%,respectively,aftertreated
with10mg·L-1and15mg·L-11,2,4-TCB.Thecontentsofchlorophyla,bandtotalchlorophyl,especialythecontentofthechlorophyla,
decreasedsignificantlywhentreatedwith1,2,4-TCBfor4d.TheactivitiesofSODandPODdecreased40.57%and77.42%thanthoseofthe
control,respectively.ThecontentofMDAincreasedindose-responsemanners.Furthermore,thecontentofTOCintheculturewith10mg·
L-1and15mg·L-11,2,4-TCBincreased57.95%and72.55%,respectively.Theseresultssuggestedthat1,2,4-TCBafectedthephysiological
activitiesofS.obliquus,andthetoxicmechanismwasrelatedtothepermeabilityofcelularmembraneandthelipidperoxidationofotheror-
ganicmacromoleculesofS.obliquuscels.
Keywords:1,2,4-trichlorobenzene;Scenedesmusobliquus;toxicefects
2007年7月
TCB污染逐渐加重[4]。目前研究表明 1,2,4-TCB对眼
睛具有一定的刺激作用,长时间、高浓度接触 1,2,4-
TCB的工人有神经衰弱症状[5],动物长期接触 1,2,4-
TCB会引起慢性肝、肾毒性,也可能损害甲状腺[6],并
具有潜在的“三致”作用[7~9]。藻类作为水生态系统的初
级生产者,对生态系统的平衡起着极其重要的作用。
水体中的污染物能显著影响藻类的分布[10],藻类测试
也是水生态毒理学研究中不可缺少的方法[11]。斜生栅
藻作为藻类测试的典型藻种,具有对毒物敏感,繁殖
快,容易培养等特点[12]。利用藻类作为毒物测试的对
象,在较短时间内即可得到化学物质对其世代及其种
群水平的影响[13]。本实验研究了不同浓度1,2,4-TCB
对斜生栅藻的生长、蛋白质含量、叶绿素含量、超氧化
物歧化酶活性(SOD)、过氧化物酶(POD)和脂质过氧
化产物丙二醛(MDA)含量的影响,旨在探讨 1,2,4-
TCB对藻类的致毒方式和机理。
1 材料和方法
1.1材料
实验藻种:斜生栅藻由暨南大学生物饵料保种室
提供。经实验室驯化培养后,取指数生长期的健康藻
种进行实验。
1.2方法
1.2.1藻种培养与药物处理
将斜生栅藻藻种接种到水生4号培养基[14]中,用
4层无菌纱布封口。温度(25±2)℃,光强2500~3000
lx,光暗比为12h∶12h,静置培养,每天定时摇动5
次,预培养3代,镜检细胞正常,进入对数生长期时进
行试验。分别用终浓度为0、1、5、10、15、20mg·L-11,2,
4-TCB处理藻细胞。每天更换培养液,减少 1,2,4-
TCB挥发对浓度的影响。
1.2.2细胞密度测定与相对抑制率计算
每日下午 4点定时取样。用 Lugol碘液固定样
品,细胞计数板计数。根据藻密度计算1,2,4-TCB的
相对抑制率。相对抑制率的计算公式如下:
相对抑制率=(1-N/N0)×100%
式中N为试验组的藻密度,N0为对照组的藻密度。用
概率单位法求出半数效应浓度值(96h-EC50)。
1.2.3可溶性蛋白质含量的测定
对 1,2,4-TCB处理 4d的藻样,通过离心得到藻
细胞,低温冷冻干燥至恒重,采用考马斯亮蓝法测定
可溶性蛋白质含量,以牛血清白蛋白作标准曲线[15]。
1.2.4叶绿素含量和培养液的有机碳(TOC)含量测定
叶绿素含量采用分光光度法测量。取培养4d的
藻样,用85%的丙酮抽提,抽提液在波长663、645、
630、750nm处测定吸光度值,并采用戴荣继等的方
法计算叶绿素的含量[16]。TOC用岛津总碳测定仪(TOC-
Vcpn型)测定。
1.2.5SOD、POD活性和MDA含量测定
将藻细胞液放入离心管中,4000r·min-1离心10
min,弃上清液,藻中加入5mL预 冷的0.05mol·L-1
pH7.6的磷酸缓冲液,0~4℃条件研磨,匀浆液在4000
r·min-1下离心5min,上清液即为粗酶液。采用氮蓝
四唑光化学还原法测定SOD活性。愈创木酚法测定
过氧化物酶的活性(POD),以每分钟OD值变化 0.01
为一个POD酶活力单位U[17]。硫代巴比妥酸(TBA)法
测定MDA[18]。
1.3实验数据的统计与分析
对所得数据用 SPSS10.0统计软件进行方差分
析,采用 t检验,检测不同浓度处理组与对照组间的
差异显著性。
2 结果
2.11,2,4-TCB对斜生栅藻生长的影响
不同浓度1,2,4-TCB处理后,斜生栅藻的生长曲
线发生改变,结果见图1。
从图1可见,随着1,2,4-TCB处理时间延长,各
浓度组的藻细胞生长速度减慢。低浓度的1,2,4-TCB
对藻细胞生长影响不大,甚至在较低浓度较短时间内
呈现一定的 “兴奋效应”。1,2,4-TCB高浓度组(≥5
mg·L-1)细胞的生长从第2d就受到较强的抑制,尤其
是15mg·L-1组,藻细胞的生长速度缓慢,甚至随着药
0 1 2 3 4
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
细
胞
数
/1
06 ·
m
L-
1
0
1mg·L-1TCB
5mg·L-1TCB
10mg·L-1TCB
15mg·L-1TCB
t/d
图11,2,4-TCB对斜生栅藻生长的影响
Figure1Efectsof1,2,4-TCBonthegrowthofS.obliquus
杜青平等:1,2,4-三氯苯对斜生栅藻的毒性效应及其机制研究1376
第26卷第4期 农 业 环 境 科 学 学 报
物处理时间延长,细胞的死亡速度大于生长速度,细
胞数量开始减少。其生长抑制率在72h后达到95%
以上。其生长抑制率结果见图2。 这种抑制作用呈现
一定的时间-效应和剂量-效应的关系。
2.21,2,4-TCB对斜生栅藻中可溶性蛋白质含量的影
响
离心收集 1,2,4-TCB处理 4d的斜生栅藻细胞,
测定蛋白质的含量,结果见图3。
从图 3可见,用 1,2,4-TCB处理后,斜生栅藻细
胞中蛋白质含量逐渐下降,且随着处理浓度的升高,
蛋白质含量变化呈现浓度-效应关系。用10mg·L-1和
15mg·L-11,2,4-TCB处理后,藻细胞中蛋白质含量与
对照组相比分别下降了62.89%和80.22%。10mg·L-1
和 15mg·L-11,2,4-TCB处理组中蛋白质含量与对照
组相比,差异显著。5mg·L-11,2,4-TCB处理组蛋白质
含量比对照组下降了23.56%,差异不显著。
2.31,2,4-TCB对斜生栅藻叶绿素含量的影响
藻类常见的叶绿素是叶绿素a,b,叶绿素a在一
切浮游藻类里大约占有机物干重的1%～2%,是藻类
进行光合作用的物质基础。被1,2,4-TCB处理后,斜
生栅藻叶绿素a,b及总叶绿素的含量进行测定,结果
见表1和图4。
从表1可见,1,2,4-TCB处理后,除1mg·L-11,2,
4-TCB组斜生栅藻叶绿素 b含量和总叶绿素含量稍
高于对照组外,其他各组的值均小于对照组。大于5
mg·L-11,2,4-TCB组斜生栅藻叶绿素a含量与对照组
相比呈现极显著下降趋势(P<0.01)。叶绿素b含量与
对照组相比没有显著差异,叶绿素a/b值下降。总叶
绿素在 5mg·L-11,2,4-TCB组呈现显著下降 (P<
0.05),大于 5mg·L-11,2,4-TCB组极显著的下降(P<
0.01)。对比3组数据可见,1,2,4-TCB处理后,斜生栅
藻叶绿素 a含量改变比总叶绿素和叶绿素 b更为敏
感,但是叶绿素a与总叶绿素反映的毒性大小的顺序
一致。同时,显微镜镜检可观察到,斜生栅藻颜色随着
1,2,4-TCB处理浓度的升高而逐渐由深绿色变为淡绿
色,逐渐变浅。
2.41,2,4-TCB对斜生栅藻SOD和POD活性的影响
从表2和图5可见,随着1,2,4-TCB浓度升高,
斜生栅藻的SOD活性和POD活性均降低,呈现一定
的浓度-效应关系。且SOD活性降低的幅度大于POD
1 2 3 4
120
100
80
60
40
20
0
-20
1mg·L-1TCB
5mg·L-1TCB
10mg·L-1TCB
15mg·L-1TCB
时间t/d
相
对
抑
制
率
/%
图21,2,4-TCB对斜生栅藻生长抑制率
Figure2Theinhibitionrateof1,2,4-TCBonthe
growthofS.obliquus
0 1 5 10 15
浓度/mg·L-1
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
蛋
白
质
含
量
/!
g·
m
g-
1 D
W
图31,2,4-TCB对斜生栅藻蛋白质含量的影响
Figure3Efectsof1,2,4-TCBontheprotein
contentsofS.obliquus
表11,2,4-TCB对斜生栅藻叶绿素含量的影响
Table1Efectsof1,2,4-TCBonthechlorophal
contentsinS.obliquus
注:*为P<0.05,**为P<0.01,与对照组相比。
表21,2,4-TCB对斜生栅藻POD和SOD酶活力的影响
Table2Efectsof1,2,4-TCBonPODandSOD
activitiesofS.obliquus
注:*为P<0.05,**为P<0.01,与对照组相比。
1377
2007年7月
活性。在15mg·L-1TCB组,藻细胞的SOD和POD活
性分别是对照组的40.57%和77.42%。而1mg·L-1组
藻细胞的POD活性稍高于对照组,这可能是低剂量
的1,2,4-TCB诱导了藻细胞发生“应激”反应。由此可
见,经1,2,4-TCB的处理后,藻细胞的 SOD酶活力的
改变比POD酶活力更为敏感。
2.51,2,4-TCB对斜生栅藻 MDA含量和培养液中
TOC含量的影响
从图6可见,1,2,4-TCB处理后,斜生栅藻脂质过
氧化产物MDA含量增加,在高浓度的 10mg·L-1和
15mg·L-1处理组MDA含量与对照组相比,均有极显
著的统计学差异(n=10,**P<0.01)。MDA含量改变与
1,2,4-TCB处理浓度呈现明显的剂量-效应关系。这
表明 1,2,4-TCB引起藻细胞内脂质过氧化水平的升
高。培养液中 TOC含量随着 1,2,4-TCB处理浓度的
升高而升高。在大于5mg·L-11,2,4-TCB处理组培养
液中TOC含量与对照组相比,有显著的统计学差异
(P<0.01)。10mg·L-1和 15mg·L-11,2,4-TCB处理组
TOC含量分别比对照组高57.95%和72.55%。
3 讨论
对于浮游植物而言,蛋白质含量和叶绿素含量被
认为是生物量的指标。蛋白质含量和叶绿素含量的高
低,表明浮游植物的存活情况和生物量的大小。本研
究以斜生栅藻为研究对象,探讨了1,2,4-TCB处理前
后,藻类的生长状况、藻细胞中蛋白质和叶绿素含量
的变化。结果表明,斜生栅藻在低浓度(<5mg·L-1)短
期(24h)接触 1,2,4-TCB处理后,藻细胞的生长表现
出一定的“兴奋”效应,而浓度较高或者时间延长则使
藻细胞的生长受到抑制,藻类生长的相对抑制率增
大。1,2,4-TCB处理后,斜生栅藻的可溶性蛋白质含量
和叶绿素 a,b及总叶绿素含量降低,其中,叶绿素 a
含量下降最明显,可作为生理毒性指标。这些生理指
标的改变与1,2,4-TCB处理之间呈现一定的浓度-效
应关系和时间-效应关系。这表明1,2,4-TCB对藻细
胞亚细胞结构 (叶绿体)和蛋白质造成损伤。1,2,4-
TCB对藻细胞叶绿体结构或功能损伤,使生物的光合
作用无法正常进行,藻类的生存受到威胁。
藻细胞蛋白质不仅是藻细胞体(包括叶绿体)的
有机成分,而且一些蛋白质作为酶和细胞生长的调节
成分,是藻细胞正常生理功能的物质保障。1,2,4-TCB
处理后斜生栅藻不仅表现出蛋白质含量下降,而且藻
细胞POD和SOD酶活性降低,藻细胞的抗氧化功能
降低。从一个侧面反映了其所处的环境状况。说明了
环境中污染物含量增加,导致细胞内解毒酶系统被破
坏。这种反应是发生在细胞内分子水平上,其变化要
比生物的生长或繁殖对环境的变化更灵敏。在本实验
中,除了藻体SOD、POD酶活性的变化,随1,2,4-TCB
浓度增加,藻体脂质过氧化产物 MDA含量升高。这
表明,1,2,4-TCB对藻细胞产生活性氧自由基引起脂
0 1 5 10 15
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1,2,4-TCB含量/mg·L-1
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
叶
绿
素
含
量
/m
g·
L-
1
叶
绿
素
a/
b
图41,2,4-TCB对斜生栅藻叶绿素含量的影响
Figure4Efectsof1,2,4-TCBonthechlorophal
contentsinS.obliquus
叶绿素a
叶绿素b
总叶绿素
叶绿素a/b
0 1 5 10 15
1,2,4-TCB含量/mg·L-1
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
SO
D
含
量
/!
·
g-
1 F
W
PO
D
含
量
/n·
m
in
-1 ·
g-
1 F
W
图51,2,4-TCB对斜生栅藻POD和SOD酶活力的影响
Figure5Efectsof1,2,4-TCBonPODandSOD
activitiesofS.obliquus
SOD
POD
0 1 5 10 15
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1,2,4-TCB含量/mg·L-1
M
D
A
含
量
/n
m
ol·
g-
1 F
W
TO
C
含
量
/m
g·
L-
1
图61,2,4-TCB对斜生栅藻MDA和TOC含量的影响
Figure6Efectsof1,2,4-TCBonMDAcontentsandTOC
contentsofS.obliquus
MDA
TOC
杜青平等:1,2,4-三氯苯对斜生栅藻的毒性效应及其机制研究1378
第26卷第4期 农 业 环 境 科 学 学 报
质及其他生物大分子的氧化损伤可能是其毒性作用
的主要机制。而藻细胞生物膜脂质过氧化水平升高将
可能导致膜的选择通透性升高。而 1,2,4-TCB处理
后,培养液中的TOC含量升高,这表明 1,2,4-TCB处
理,导致藻体细胞膜损伤,细胞内的TOC释放到培养
液中。藻细胞膜的损伤可能与生物膜脂质过氧化之间
存在着内在联系。
本论文结果提示有机污染物 1,2,4-TCB处理能
导致斜生栅藻的生长速率减慢,生理活性降低,细胞
的各种功能酶活性失调,而引起藻细胞的毒性机制与
细胞膜的通透性和生物膜脂质过氧化有关。
4 结论
(1)1,2,4-TCB处理后,斜生栅藻生长速度降低、
藻细胞中可溶性蛋白质和叶绿素含量减少。
(1)1,2,4-TCB使斜生栅藻 SOD和 POD酶活性
下降,而脂质过氧化产物MDA含量升高。
(3)1,2,4-TCB使斜生栅藻培养液中的TOC含量
升高,藻细胞膜通透性升高。
(4)1,2,4-TCB对藻细胞产生活性氧自由基,并引
起生物膜脂质成分及其他生物大分子的过氧化损伤
可能是其毒性作用的主要机制。
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