全 文 ：华北农学报·2015，30(2) :161 -165
收稿日期:2015 － 02 － 10
基金项目:内蒙古自然科学基金项目(2010MS0308)
作者简介:胡小利(1987 －) ，女，内蒙古赤峰人，在读硕士，主要从事向日葵遗传育种研究。
通讯作者:马 庆(1958 －) ，男，内蒙古呼和浩特人，教授，硕士生导师，主要从事作物遗传育种研究。
食用向日葵 SSＲ-PCＲ反应体系的优化
胡小利1，马 庆1，包海柱2，范 瑞1，孙希利1，马 蓉1
(1．内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特 010019;2．内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031)
摘要:为建立食用向日葵分子标记反应体系，以食用向日葵四叶期叶片为 DNA 模板提取材料，采用单因素试验
和正交试验设计，对 SSＲ-PCＲ 反应体系中的 6 因素(10 × PCＲ Buffer、Mg2 +、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶和 DNA 模
板)在 5 水平上进行正交优化试验，并比较了不同浓度 Mg2 +、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA 对扩增效果的影响，结果表
明，各因素水平变化对反应体系的影响为 Mg2 + ＞ Taq DNA 聚合酶(引物)＞ DNA 模板 ＞ 10 × PCＲ Buffer ＞ dNTPs。最
终建立食用向日葵 SSＲ-PCＲ 最佳反应体系为:在总体系为 20 μL 的 SSＲ-PCＲ 反应体系中包括 10 × PCＲ Buffer 0． 2
mmol /L、Mg2 + 2． 0 mmol /L、dNTPs 1． 8 mmol /L、Taq DNA聚合酶 0． 2 U、DNA 50 ng、引物 1． 5 mmol /L。
关键词:食用向日葵;SSＲ-PCＲ;体系优化
中图分类号:S565． 5 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2015)02 － 0161 － 05
doi:10． 7668 /hbnxb． 2015． 02． 029
Optimization of SSＲ-PCＲ Ｒeaction System in Confectionary Sunflower
HU Xiao-li1，MA Qing1，BAO Hai-zhu2，FAN Ｒui1，SUN Xi-li1，MA Ｒong1
(1． Agricultural College of Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010019，China;2． Inner Mongolia
Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China)
Abstract:In order to established confectionary sunflower molecular markers reaction system，the study assum-
ing DNA template from four-leaf stage of confectionary sunflowers leaves for experimental materials，this study used
the single factor test and orthogonal design for optimizing six SSＲ-PCＲ reaction system factors (10 × PCＲ Buffer，
Mg2 +，dNTPs，primers，Taq DNA polymerase，DNA template and compared different concentrations of Mg2 +，
dNTPs，Taq DNA polymerase and DNA template amplification effect of the impact in SSＲ-PCＲ reaction system． The
result showed that the range of the influence of six factors in the reaction system was Mg2 + ＞ Taq DNA polymerase
(primer)＞ DNA template ＞ 10 × PCＲ Buffer ＞ dNTPs． And this study established confectionary sunflower SSＲ-PCＲ
reaction system(20 μL) :10 × PCＲ Buffer 0． 2 mmol /L，Mg2 + 2． 0 mmol /L，dNTPs 1． 8 mmol /L，Taq DNA polymer-
ase 0． 2 U，DNA 50 ng，primer 1． 5 mmol /L．
Key words:Confectionary sunflower;SSＲ-PCＲ;Ｒeaction system
向日葵(Helianthus anuus L．)是我国北方地区
的重要油料作物和经济作物。按照加工用途可将向
日葵分为油用型(油用向日葵)和食用型(食用向日
葵)2 种，其中以食用向日葵在我国向日葵生产、消
费中比重较大;品种应用以“三系”为主［1 － 2］。长期
以来，我国食用向日葵新品种选育时主要是借鉴油
用向日葵的育种方法，采用基于表型选择的常规育
种方法为主，存在着经验育种、盲目性大、育种周期
长、育种效率低的问题;特别是对多基因控制的复杂
数量性状进行选择时，往往会误判和漏选，导致偏离
预期的育种目标。因此，将传统的育种技术和现代
分子标记技术相结合，对于完善现有食用向日葵杂
交育种程序和育种方法、缩短育种周期、提高育种效
率具有重要意义。
随着现代生物学的发展和分子标记技术的日趋
完善，为作物育种提供了新的思路。SSＲ(Simple se-
quence repeats)即简单序列重复，由于 SSＲ 标记来
源于基因本身的序列，具有高度的稳定性，通过对
162 华 北 农 学 报 30 卷
SSＲ标记的定位，能够相应地定位其来源基因，因而
SSＲ标记目前已成为构建遗传连锁图谱、系谱分析、
品种纯度检测以及目标性状分子标记筛选的较为理
想方法。微卫星 DNA 广泛分布在真核生物的基因
组中，并在两侧都有物种特异性的侧翼序列，鉴于基
序的重复次数变化很大，因此，SSＲ 与其他 DNA 标
记相比具有更高的多态性 ［3］。近年来，SSＲ标记在
向日葵上的应用主要是油用向日葵或观赏向日
葵［4 － 14］，而对于食用向日葵 SSＲ-PCＲ体系的建立目
前尚未有报道。因此，本研究通过从食用向日葵的
总 DNA提取、检测、PCＲ扩增以及反应条件着手，旨
在建立食用向日葵 SSＲ-PCＲ反应体系，为今后的食
用向日葵分子辅助育种提供依据。
1 材料和方法
1． 1 供试材料
供试材料为食用向日葵自交系，由内蒙古农业
大学农学院遗传育种教研室提供。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 基因组 DNA提取及检测 以食用向日葵四
叶期叶片为材料，采用北京天根生物技术有限公司
提供的植物基因组 DNA 提取试剂盒(Plant genomic
DNA kit)提取基因组 DNA，并用 1%琼脂糖凝胶电
泳和德国进口的核酸微量检测仪进行 DNA 质量和
浓度的检测，置于 － 20 ℃冰箱保存。
表 1 SSＲ-PCＲ体系的因素和水平
Tab． 1 Factors and levels of SSＲ-PCＲ system
水平
Levels
Mg2 +
/(mmol /L)
10 × PCＲ Buffer
/(mmol /L)
dNTPs
/(mmol /L)
Taq DNA聚合酶 /U
Taq DNA polymerase
DNA
/ng
引物 /(mmol /L)
Primer
1 0． 5 0． 2 1． 2 0． 1 10 0． 5
2 1． 0 0． 4 1． 4 0． 2 20 1． 0
3 1． 5 0． 6 1． 6 0． 3 30 1． 5
4 2． 0 0． 8 1． 8 0． 4 40 2． 0
5 2． 5 1． 0 2． 0 0． 5 50 2． 5
表 2 SSＲ-PCＲ［L25(5
6) ］正交试验设计
Tab． 2 Orthogonal design for SSＲ-PCＲ［L25(5
6) ］
水平
Levels
Mg2 +
/(mmol /L)
10 × PCＲ Buffer
/(mmol /L)
dNTPs
/(mmol /L)
Taq DNA聚合酶 /U
Taq DNA polymerase
DNA
/ng
引物 /(mmol /L)
Primer
1 0． 5 0． 2 1． 0 0． 1 10 0． 5
2 0． 5 0． 4 1． 4 0． 2 20 1． 0
3 0． 5 0． 6 1． 6 0． 3 30 1． 5
4 0． 5 0． 8 1． 8 0． 4 40 2． 0
5 0． 5 1． 0 2． 0 0． 5 50 2． 5
6 1． 0 0． 2 1． 4 0． 3 40 2． 5
7 1． 0 0． 4 1． 6 0． 4 50 0． 5
8 1． 0 0． 6 1． 8 0． 5 10 1． 0
9 1． 0 0． 8 2． 0 0． 1 20 1． 5
10 1． 0 1． 0 1． 0 0． 2 30 2． 0
11 1． 5 0． 2 1． 6 0． 5 20 2． 0
12 1． 5 0． 4 1． 8 0． 1 30 2． 5
13 1． 5 0． 6 2． 0 0． 2 40 0． 5
14 1． 5 0． 6 1． 0 0． 3 50 1． 0
15 1． 5 1． 0 1． 4 0． 4 10 1． 5
16 2． 0 0． 2 1． 8 0． 2 50 1． 5
17 2． 0 0． 4 2． 0 0． 3 10 2． 0
18 2． 0 0． 6 1． 0 0． 4 20 2． 5
19 2． 0 0． 8 1． 4 0． 5 30 0． 5
20 2． 0 1． 0 1． 6 0． 1 40 1． 0
21 2． 5 0． 2 2． 0 0． 4 30 1． 0
22 2． 5 0． 4 1． 0 0． 5 40 1． 5
23 2． 5 0． 6 1． 4 0． 1 50 2． 0
24 2． 5 0． 8 1． 6 0． 2 10 2． 5
25 2． 5 1． 0 1． 8 0． 3 20 0． 5
注:以上所有组分的总和为 20 μL，加入其他组分后未达到 20 μL的用 ddH2O补足。
Note:The total volume of reaction was 20 μL，after adding the components，the insufficiency was supplemented with ddH2O．
2 期 胡小利等:食用向日葵 SSＲ-PCＲ反应体系的优化 163
1． 2． 2 PCＲ 反应体系正交试验设计 采用 L25
(56)正交试验设计，对 10 × PCＲ Buffer、Mg2 +、
dNTPs、引物及 Taq DNA 聚合酶和 DNA模板 6 种因
素 5 个水平进行筛选方案如表 1，2。SSＲ 引物来自
于 NCBI(http / /www． ncbi． cn)查询的引物序列由中
美泰和生物技术(北京)公司合成。Mg2 +、dNTPs 均
由天根公司提供，10 × PCＲ Buffer、Taq DNA 聚合酶
从大连 TaKaＲa公司购买。
1． 2． 3 PCＲ反应条件 根据表 2 制备总体积为 20
μL的 PCＲ反应体系，PCＲ扩增程序为 94 ℃预变性
6 min;94 ℃变性 45 s，53 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 10
min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存，扩增反
应在美国 BIO-ＲAD 公司的 C1000 型 PCＲ 仪上进
行。扩增产物用 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分
离，快速银染检测。
1． 2． 4 单因素试验设计 根据正交设计筛选出
SSＲ-PCＲ反应体系进行 Mg2 +和 Tap DNA 聚合酶的
单因素试验设计，方案如表 3，4。
表 3 SSＲ-PCＲ反应体系优化单因素Mg2 +筛选试验
Tab． 3 Optional concentration gradient of each factor Mg2 + in SSＲ-PCＲ system
水平
Levels
10 × PCＲ Buffer
/(mmol /L)
Mg2 +
/(mmol /L)
dNTPs
/(mmol /L)
Taq DNA聚合酶 /U
Taq DNA polymerase
DNA
/ng
引物 /(mmol /L)
Primer
1 0． 2 0． 5 1． 6 0． 1 50 1． 5
2 0． 2 1． 0 1． 6 0． 1 50 1． 5
3 0． 2 1． 5 1． 6 0． 1 50 1． 5
4 0． 2 2． 0 1． 6 0． 1 50 1． 5
5 0． 2 2． 5 1． 6 0． 1 50 1． 5
表 4 SSＲ-PCＲ反应体系优化单因素 Taq DNA聚合酶筛选试验
Tab． 4 Optional concentration gradient of each factor Taq DNA polymerase in SSＲ-PCＲ system
水平
Levels
10 × PCＲ Buffer
/(mmol /L)
Mg2 +
/(mmol /L)
dNTPs
/(mmol /L)
Taq DNA聚合酶 /U
Taq DNA polymerase
DNA
/ng
引物 /(mmol /L)
Primer
1 0． 2 2． 0 1． 6 0． 1 50 1． 5
2 0． 2 2． 0 1． 6 0． 2 50 1． 5
3 0． 2 2． 0 1． 6 0． 3 50 1． 5
4 0． 2 2． 0 1． 6 0． 4 50 1． 5
5 0． 2 2． 0 1． 6 0． 5 50 1． 5
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA质量和浓度的检测
根据用试剂盒提取的 DNA 对部分进行质量和
浓度检测，其结果表明所提取的基因组 DNA质量和
浓度皆可用于后续的试验。
2． 2 SSＲ-PCＲ反应体系正交设计试验结果分析
食用向日葵的 25 个正交设计试验结果如图 1
所示，图中的 25 个泳道分别是表 2 每次正交试验对
应的电泳结果，由图所示 1 ～ 12、15、21、25 次试验没
有对应的扩增谱带，由此说明 1 ～ 12、15、21、25 所对
应的 PCＲ反应体系不适合向日葵的 SSＲ-PCＲ，而第
13、14、16 ～ 20、22 ～ 24 次试验所对应的 SSＲ-PCＲ的
反应体系可以扩增出对应谱带并且第 16 次试验所
扩增的结果清晰，目的片段明显没有扎带干扰试验
结果，从图中所示初步建立食用向日葵 SSＲ-PCＲ 的
反应体系为:20 μL 的体系中包括 10 × PCＲ Buffer
0． 2 mmol /L、Mg2 + 2． 0 mmol /L、dNTPs 1． 8 mmol /L、
Taq DNA聚合酶 0． 2 U、DNA 50 ng、引物 1． 5 mmol /L。
为了进一步证明初步结论的准确性根据李志勇［15］
对正交设计试验中的各组分浓度组合进行分析(表
5) ，其中 K值代表某水平下某因子参与反应所产生
的扩增条带的总和;k 代表某因子在某水平参与反
应所产生的扩增条带的平均值;Ｒ 为某因子的极差，
即某因子在不同水平下最大平均值与最小平均值之
差。Ｒ 值的大小反映了该因子对试验结果影响的大
小，Ｒ 值越大，影响越显著。10 × PCＲ Buffer、Mg2 +、
dNTPS、Taq DNA聚合酶、模板 DNA、引物这 6 个因
素在选定的 5 个水平内对结果的影响由大到小依次
为Mg2 + ＞Taq DNA 聚合酶(引物)＞ DNA模板 ＞10 ×
PCＲ Buffer ＞ dNTPs。k 值反映了影响因素各水平对
反应体系的影响情况，k 值越大，反应水平越好。
10 × PCＲ Buffer 1 水平最好，Mg2 + 4 水平最好，
dNTPs 1、4、5 水平最好，Taq DNA聚合酶 2水平最好，
模板 DNA 5水平最好，引物 3 水平最好(表 5)。这 6
因素的最佳反应体系为:10 × PCＲ Buffer 0． 2 mmol /L、
Mg2 +2． 0 mmol /L、dNTPs 1． 8 mmol /L、Taq DNA聚合酶
0． 2 U、DNA 50 ng、引物1． 5 mmol /L与观察值相吻合。
164 华 北 农 学 报 30 卷
表 5 SSＲ-PCＲ正交试验设计各处理统计分析
Tab． 5 The result of SSＲ-PCＲ by orthogonal design
项目
Item Mg
2 + 10 × PCＲ Buffer dNTPs
Taq DNA聚合酶
Taq DNA polymerase
DNA 引物
Primer
K1 0 10． 0 9． 0 7． 0 5． 0 9． 0
K2 1． 0 5． 0 5． 0 11． 0 7． 0 7． 0
K3 8． 0 8． 0 8． 0 9． 0 7． 0 13． 0
K4 18． 0 6． 0 9． 0 8． 0 10． 0 5． 0
K5 14． 0 8． 0 9． 0 3． 0 12． 0 6． 0
k1 0 2． 0 1． 8 1． 4 1． 0 1． 8
k2 0． 2 1． 0 1． 0 2． 2 1． 4 1． 4
k3 1． 6 1． 6 1． 6 1． 8 1． 4 2． 6
k4 3． 6 1． 2 1． 8 1． 6 2． 0 1． 0
k5 2． 8 1． 6 1． 8 0． 6 2． 4 1． 2
Ｒ 3． 6 1． 0 0． 8 1． 6 1． 4 1． 6
图 1 SSＲ-PCＲ正交试验扩增结果电泳图
Fig． 1 Amplification of SSＲ-PCＲ by
orthogonal design［L25(5
6) ］
2． 3 单因素对 SSＲ-PCＲ 反应结果的影响
2． 3． 1 Mg2 +浓度 在单因素试验中 Mg2 +设有 5 个
浓度梯度(图 2) ，每个浓度梯度重复 3 次。浓度为
2． 0 mmol /L较浓度为 0． 5，1． 0，1． 5 mmol /L 的扩增
条带清晰并且相对浓度为 2． 5 mmol /L 没有杂带不
影响最终的统计结果，所以浓度为 2． 0 mmol /L最为
合适。即在一定范围内，扩增产物随 Mg2 +浓度的增
加而增加，但当达到其最适宜的浓度后再增加 Mg2 +
浓度反而影响其扩增效果。
Mg2 +浓度从左到右浓度分别为 0． 5，1． 0，1． 5，2． 0，2． 5 mmol /L。
Mg2 + concentration from right to left were 0． 5，1． 0，1． 5，2． 0，2． 5 mmol /L．
图 2 Mg2 +浓度对 SSＲ-PCＲ扩增结果的影响
Fig．2 Effects of Mg2 + concentration on SSＲ-PCＲ amplication
2． 3． 2 Taq DNA聚合酶浓度 对其设置 5 个浓度
梯度结果如图 3 所示。本试验设计 5 个 Taq DNA
聚合酶浓度为 0． 1 U扩增产物 1 条，浓度为 0． 2，0. 3
U扩增带数为 4 条，浓度为 0． 4，0． 5 U 虽然扩增条
带较多但其杂带也随之增加，所以避免影响结果，统
计 0． 2，0． 3 U较适合，在不影响试验结果的同时，尽
可能减少试验费用，所以综合试验结果和试验费用
考虑 Taq DNA聚合酶浓度为 0． 2 U最为合适。
Taq DNA聚合酶浓度从右到左分别为 0． 1，0． 2，0． 3，0． 4，0． 5 U。
Taq DNA concentration from right to left were 0． 1，0． 2，0． 3，0． 4，0． 5 U．
图 3 Taq of DNA聚合酶浓度对 SSＲ-PCＲ扩增结果的影响
Fig． 3 Effects of Taq DNA concentration on
SSＲ-PCＲ amplication
3 结论与讨论
本研究优化了适用食用向日葵分子标记的 PCＲ
反应体系(20 μL) :10 × PCＲ Buffer 0． 2 mmol /L、Mg2 +
2． 0 mmol /L、dNTPs 1． 8 mmol /L、Taq DNA 聚合酶
0． 2 U、DNA 50 ng、引物 1． 5 mmol /L ddH2O 补足至
20 μL，PCＲ扩增程序为 94 ℃预变性 6 min;94 ℃变
性 45 s，53 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 10 min，35 个循
环;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。影响 SSＲ 扩增结
果的因素很多，目前对 SSＲ-PCＲ体系进行优化的方
法包括:单因素设计和正交设计 ［16］，正交试验方法
虽然可以分析因素之间的交互作用，但试验体系较
小所受试验操作影响误差较大而且也不能顾及个别
因素的影响，而单因素试验可以补充正交试验的不
足，所以本试验采取单因素与正交试验相结合的方
法，提高了试验的准确性。SSＲ是由许多因素组成，
其扩增程序也较多，所以 SSＲ-PCＲ的结果不但受其
2 期 胡小利等:食用向日葵 SSＲ-PCＲ反应体系的优化 165
组成因素的影响，也受试验操作的影响。在诸多因
素中，Mg2 +是 PCＲ 反应的重要因子之一，其浓度的
高低直接影响扩增的效率、特异性和忠实性，Mg2 +
在 PCＲ 中的主要作用是与 dNTPs 结合再与模板
DNA形成复合体进而被聚合酶识别，可以说 Mg2 +
是 Polymerase 的激活剂，影响 Taq DNA 聚合酶活
性，但其又与 dNTPs结合降低了 Mg2 +对聚合酶的浓
度，其高浓度可以增加扩增率但浓度过高会导致非
特异性谱带的增加也就是假阳性，对试验结果造成
误差。低浓度的 Mg2 +会降低非特异性产物的产生，
但浓度过低会导致正常的谱带无法扩增出来亦对试
验及结果影响很大，所以适当的 Mg2 +浓度对 PCＲ
反应相当重要。在 PCＲ程序中，退火温度也是扩增
结果的重要因素，但其程序之间也有一定的相互作
用，循环次数、延伸时间等都对扩增结果有着一定的
影响。在研究万寿菊 SSＲ-PCＲ的体系中得出结论:
当模板浓度过低时，分子碰撞的机率低，扩增产物
少，条带不清晰，浓度过高时，又会相应增加非特异
性产物的扩增，使背景加强，出现弥散状并认为万寿
菊 SSＲ-PCＲ体系中 DNA模板 40 ng 最好［17］。本试
验的模板浓度最佳为 50 ng，向日葵是菊科所以可以
借鉴其反应体系但又不是完全相同，而且提取的方
法及操作有可能使模板原液浓度有所差别，所以与
万寿菊得出的模板 DNA 在体系的比例相差不大。
低浓度 Taq DNA聚合酶扩增率低，若其浓度过低则
容易出现假阴性，浓度过高则会出现假阳性同时增
加试验成本。
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