全 文 ：基因组学与应用生物学，2010年，第 29卷，第 1期，第 174-178页
Genomics and Applied Biology, 2010, Vol.29, No.1, 174-178
技术改进
Upgraded Technology
毛薯 ISSR-PCR反应体系的建立
罗欣 周鑫 程文杰 黄小龙 黄东益 *
海南大学农学院,海南儋州, 571737
*通讯作者, hdongyi@126.com
摘 要 本研究主要建立毛薯 ISSR-PCR的最佳反应体系。研究采用改良 CTAB法提取毛薯总基因组 DNA，
应用单因子实验法设定模板 DNA，Mg2+浓度，dNTP浓度，Tap酶浓度以及退火温度的 5个不同梯度，探讨单
因素变化对毛薯 ISSR-PCR扩增的影响。实验结果表明，毛薯 ISSR-PCR最佳反应体系为：总体积 20 μL，模板
DNA为 50 ng、Taq酶为 0.8 U、Mg2+浓度为 2.0 mmol/L、引物浓度为 0.5 μmol/L、dNTPs浓度为 0.5 mmol/L。
关键词 毛薯, ISSR-PCR,反应体系
Establishment of ISSR-PCR System in Dioscorea esculenta (lour) Brukill
Luo Xin Zhou Xin Cheng Wenjie Huang Xiaolong Huang Dongyi *
Agricultural College of Hainan University, Danzhou, 571737
* Corresponding author, hdongyi@126.com
DOI: 10.3969/gab.029.000174
Abstract In this study, we have established and optimized ISSR-PCR system of D. esculenta, and we used modi-
fied CTAB method to extract its genomic DNA, then setting 5 different gradient by single factor experiment with
template DNA, Mg2+ concentration, dNTP concentration, template concentration and annealing temperature, in or-
der to investigate the effect of single-factor change on ISSR-PCR amplification of D. esculenta. The experimental
result showed that the optimized ISSR reaction system of D. esculenta was as below, 50 ng template DNA, 0.8 U Taq
DNA polymerse, 2.0 mmol/LMg2+, 0.5 μmol/L primer and 0.5 mmol/L dNTPs with a total 20 μL reaction solution.
Keywords Dioscorea esculenta, ISSR-PCR, Reaction system
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.029.000174
基金项目：本研究由海南省重点学科建设专项(xkxm0811-03)和高等学校博士学科点专项科研基金(200805650004)共同资助
毛薯 (Dioscorea esculenta (Lour) brukill)又名甜
薯、蒂薯、蔓薯，为薯蓣科 (Dioscoreaceae)薯蓣属
(Dioscorea)藤本植物。毛薯淀粉含量高、肉质细嫩、食
味佳而深受群众喜爱，同时毛薯抗旱耐肥、少病虫害
且长势强，是很好的耐旱作物(王茀能等, 1991,作物
品种资源, 2(3): 8)，适合在我国南方缺水缺肥的地区
种植。目前国内外还未见外关于毛薯的专门研究报
道，仅在一些薯蓣植物的有关报道中有零星的介绍，
研究水平非常低。但是，随着热带地区国家及区域经
济的发展，毛薯已经逐渐被人们赏识，在我国南方的
宾馆酒店，毛薯已然成了上等佳肴。由于毛薯生产还
未实现产业化，只有农民零星种植，没有优质纯正的
品种、没有合理栽培措施、没有产后深加工等，因此，
系统的开展毛薯种质资源多样性的研究是实现毛薯
产业化的前提。
ISSR (inter-simple sequences repeats)简单序列重
复区间标记，由 Zietkiewicz等 (1994) 提出的一种
DNA分子标记技术，其原理是利用包含一条简单重
复序列的 3 或 5 端锚定寡聚核苷酸对两个相近
SSR之间的一段 DNA序列进行 PCR扩增来检测其
多态性。由于 ISSR为显性标记，显孟德尔式遗传，重
复性好，技术难度小，成本较低(Gibert et al., 1999;
Gupta and Varshney, 2000; Reddy et al., 2002)，因此，
ISSR标记技术被广泛用于水稻(Blair et al., 1999)，小
麦(Davila et al., 1999)，玉米(Kantety et al., 1995)，马
铃薯(Prevost et al., 1998)等植物品种的鉴定及遗传图
谱的构建。目前，ISSR标记技术用于毛薯的研究在国
内外还未有报道。本研究通过研究影响 ISSR反应的
主要因素，建立毛薯的 ISSR-PCR体系，为该分子标
记技术在毛薯的品种资源鉴定中的应用奠定基础。
1结果与分析
1.1引物的退火温度对 ISSR-PCR扩增产物的影响
根据引物的 Tm值，设计 5个退火温度进行扩
增，如图 1所示，引物 844在 47~57℃度范围内都能
扩增出条带，但是在 47~52℃范围内弱带较多，说明
非特异性条带多，当温度达到 57℃条带明显变暗，模
糊不清，说明温度过高，扩增反应受抑制，产物减少。
所以选择 54℃作为引物 844的最佳退火温度。
1.3不同 Taq酶剂量的 ISSR-PCR扩增
Taq酶的剂量直接影响到 PCR扩增的质量，Taq
酶浓度过高会产生非特异性条带，浓度过低会使扩
增产物减少，甚至没有扩增产物。本实验在 20 μL的
反应体系中对 Taq酶设定了 0.4 U、0.6 U、0.8 U、1.2 U、
2.0 U共 5个梯度进行扩增反应。根据图 3的扩增结
果，当酶的用量低于 0.8 U时，条带很淡，模糊不清，
说明酶用量过低，合成产物量少；当酶的用量大于
1.2 U的时候，出现很多非特异性条带，说明酶的用
量过高，引起非特异性扩增产物出现，因此，该实验
的 Taq用量为 0.8~1.2 U时效果最好，考虑到实验成
本问题，用量为 0.8 U时最佳。
图 1不同退火温度的 PCR扩增(引物 844)
注: M: DNA marker DL100; 1: 47℃; 2: 50℃; 3: 52℃; 4: 54℃;
5: 57℃
Figure 1 Effect of different annealing temperature on PCR ampli-
fication with primer 844
Note: M: DNA marker DL100; 1: 47℃; 2: 50℃; 3: 52℃; 4: 54℃;
5: 57℃
1.2不同浓度模板 DNA的 ISSR-PCR扩增
从图 2看出，反应体系中 DNA含量在 25~150 ng
范围内均有扩增产物，但 DNA浓度较低时，扩增产物
较少，带型暗淡，较高的 DNA浓度会出现拖尾和非特
异产物。因此，实验中模板DNA最适浓度设为 50 ng。
图 2不同 DNA剂量的 PCR扩增(引物 844)
注: M: DNA marker DL100；1: 47℃; 2: 50℃; 3: 52℃; 4: 54℃;
5: 57℃
Figure 2 Effect of different DNA dosage on PCR amplification
with primer 844
Note: M: DNA marker DL100; 1: 25 ng; 2: 50 ng; 3: 75 ng; 4:
100 ng; 5: 150 ng
图 3不同 Taq酶剂量的 PCR扩增(引物 844)
注: M: DNAmarker DL100; 1~5: 0.4 U; 0.6 U; 0.8 U; 1.2 U; 2.0 U
Figure 3 Effect of different Taq DNA polymerse dosage on PCR
amplification with primer 844
Note: M: DNAmarker DL100; 1: 0.4 U; 2: 0.6 U; 3: 0.8 U; 4: 1.2 U;
5: 2.0 U
1.4 不同Mg2+剂量的 ISSR-PCR扩增
Mg2+是 Taq酶的激活剂，通过影响 Taq酶的活
性来影响 PCR扩增的效果。如图 4所示，当Mg2+浓
度为 1.0 mmol/L时，无扩增产物，而当浓度达到
1.5 mmol/L时开始有清晰的条带，当Mg2+浓度达到
图 4不同Mg2+浓度的 PCR扩增(引物 844)
注: M: DNA marker DL100; 1~5: 1.0 mmol/L; 1.5 mmol/L; 2.0
mmol/L; 2.5 mmol/L; 3.0 mmol/L
Figure 4 Effect of different Mg2+ concentration on PCR amplifica-
tion with primer 844
Note: M: DNA marker DL100; 1: 1.0 mmol/L; 2: 1.5 mmol/L; 3:
2.0 mmol/L; 4: 2.5 mmol/L; 5: 3.0 mmol/L
毛薯 ISSR-PCR反应体系的建立
Establishment of ISSR-PCR System in Dioscorea esculenta (lour) Brukill 175
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
2.5~3.0 mol/L时开始出现大量的特异性条带，因此，
适宜的Mg2+剂量为 2.0 mmol/L。
1.5不同引物浓度的 ISSR-PCR扩增
引物是 PCR特异性反应的关键，当引物浓度过
低，扩增产物少或无，引物浓度过高，引物内部出现
二级结构，会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条
带。图 5说明引物浓度在 0.2~1.6 μmol/L范围内都
能扩增出条带，引物浓度为 0.2 μmol/L时，条带较
淡，随着引物浓度的增加，扩增产物量增大，条带更
清晰，当引物浓度达到 0.8 μmol/L时产生非特异性
性条带，说明引物浓度过高，所以该实验引物剂量的
最适浓度为 0.5 μmol/L。
表明当 dNTPs浓度为 0.1 mmol/L时无扩增产物，浓
度达到 0.3 mmol/L时有扩增产物，但条带暗淡并且有
拖尾，说明 dNTPs浓度过低影响扩增效果，浓度达到
0.5 mmol/L和 0.8 mmol/L时有清晰的扩增条带，当浓
度达到 1.0 mmol/L时，产物明显减少，并且产生非特
异性条带，说明 dNTPs浓度过高。所以本实验 dNTPs
的最适浓度是 0.5~0.8 mmol/L范围内。
1.7 ISSR-PCR体系稳定性检测
随机选取 5 条 ISSR 引物 (UBC812、UBC824、
UBC827、UBC836、UBC849)进行 ISSR-PCR扩增，对
建立的 ISSR-PCR体系(总体积 20 μL，模板 DNA为
50 ng、Taq酶为 0.8 U、Mg2+浓度为 2.0 mmol/L、引物
浓度为 0.5 μmol/L、dNTPs浓度为 0.5 mmol/L)的稳定
性进行检测，如图 7中表明 5条引物均能扩增出清
晰的条带，说明该 ISSR-PCR体系稳定可靠。
图 5不同引物浓度的 PCR扩增(引物 844)
注 : M: DNA marker DL100; 1: 0.2 μmol/L; 2: 0.5 μmol/L; 3:
0.8 μmol/L; 4: 1.2 μmol/L; 5: 1.6 μmol/L
Figure 5 Effect of different primer concentration on PCR amplifi-
cation with primer 844
Note: M: DNA marker DL100; 1: 0.2 μmol/L; 2: 0.5 μmol/L; 3:
0.8 μmol/L; 4: 1.2 μmol/L; 5: 1.6 μmol/L
1.6不同 dNTPs浓度的 ISSR-PCR扩增
dNTPs的浓度直接影响到 PCR 扩增产物的多
少，dNTPs浓度过低时，扩增产物量少，浓度过高又会
抑制 Taq的活性，产生非特异性扩增产物，如图 6中
图 6不同 dNTPs浓度的 PCR扩增(引物 844)
注 : M: DNA marker DL100; 1: 0.1 mmol/L; 2: 0.3 mmol/L; 3:
0.5 mmol/L; 4: 0.8 mmol/L; 5: 1.0 mmol/L
Figure 6 Effect of different dNTPs concentration on PCR amplifi-
cation with primer 844
Note: M: DNA marker DL100; 1: 0.1 mmol/L; 2: 0.3 mmol/L; 3:
0.5 mmol/L; 4: 0.8 mmol/L; 5: 1.0 mmol/L
图 7不同 ISSR引物的扩增
注 : M: DNA marker DL100; 1: UBC812; 2: UBC824; 3:
UBC827; 4: UBC836; 5: UBC849
Figure 7 The amplified results of different ISSR primers
Note: M: DNA marker DL100; 1: UBC812; 2: UBC824; 3:
UBC827; 4: UBC836; 5: UBC849
2讨论
ISSR分子标记技术已广泛运用于研究构建 IS-
SR指纹图谱和遗传相似性图谱，确定遗传多样性和
遗传进化关系等研究领域，由于不同植物其反应体
系差异较大(郑道君等, 2009;李鹏等, 2008;席嘉宾等,
2004; 洪明伟等 , 2008; 张冬梅等 , 2008; 曲超等 ,
2009)。因此对各个影响因子进行筛选优化，选出最
佳的反应体系是 ISSR-PCR结果可靠性的保证。
从本实验结果表明，DNA 浓度、Taq 酶的量、
Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、对扩增都有明显
的影响，其浓度过高都会产生非特异性条带，浓度过
低，扩增产物条带或无扩增条带；此外，引物的退火
温度对 PCR扩增至关重要，不同的退火温度得到的
结果差异较大，温度过低导致不完全配对的位点得
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毛薯 ISSR-PCR反应体系的建立
Establishment of ISSR-PCR System in Dioscorea esculenta (lour) Brukill
到扩增，产生大量非特异性片段，相反温度过高，引
物与模板结合难结合，扩增反应受抑制，扩增片段减
少。考虑到提高退火温度可增强反应的特异性(胡建
斌等, 2008)，所以在适宜的范围内，尽量选取较高的
退火温度，以保证 PCR的稳定性。
ISSR只有在各种参数条件最佳的情况下，才能
保证较高的稳定性。本实验最终确定毛薯 ISSR最佳
反应体系为：总体积 20 μL，模板 DNA为 50 ng、Taq
酶 0.8 U、Mg2+浓度为 2.0 mmol/L、引物浓度则为
0.5 μmol/L、dNTPs浓度为 0.5 mmol/L。此体系经过
两次重复实验，得到重复性好、多态性高、扩增产物清
晰的带谱，因此该体系适用于毛薯的 ISSR相关研究。
3材料和方法
3.1供试材料
本实验所用毛薯样品取自海南大学农学院实验
基地薯蓣种质资源圃。
3.2基因组 DNA的提取
采用 CTAB (李月仙等, 2009)法提取毛薯基因组
DNA，略有改进。通过 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其
质量，采用紫外分光光度计检测其浓度，最后将提取
的 DNA原液放置冰箱-20℃保存。
3.3 ISSR-PCR反应
本实验选用的 ISSR引物序列由哥伦比亚大学
UBC公司公布，并由南京金思特科技有限公司合成，
UBC812序列为：5-GAGAGAGAGAGAGAGAA-3，
UBC824 序列为：5-TCTCTCTCTCTCTCTCG-3 ，
UBC827 序列为：5-ACACACACACACACACG-3，
UBC836序列为：5-AGAGAGAGAGAGAGAGYA-3，
UBC844 序列为：5-CTCTCTCTCTCTCTCTRC-3，
UBC849序列为：5-GTGTGTGTGTGTGTGTYA-3。
5 U/Taq酶，10 mmol/L dNTPs，Mg2+ (25 mmol/L)主要
由 BIOMIGA 公司提供；Goldview 核酸染料为 BBI
公司产品；DNA Marker DL100 为博迈德公司产品。
ISSR-PCR扩增反应在 Biometra公司生产的 Tgradi-
ent型 PCR仪上进行。
扩增反应条件：94℃预变性 5 min；每个循环
94℃变性 45 s，特定温度下退火 45 s，72℃延伸
1.3 min，35个循环；72℃延伸 10 min。扩增后 PCR
产物在 4℃保存。ISSR反应体系为 20μL，其中 10×Taq
Buffer (Mg2+ 25 mmol/L) 1.6 μL，10 mmol/L dNTPs
1μL，5 U/μL Taq DNA polymerase 0.16 μL，50 ng/μL
DNA 1 μL，10 μmol/L 引物 1 μL，15.24 μL 灭菌双
蒸水。采用单因子实验法分别将模板 DNA、Mg2+浓
度、dNTP浓度、Tap 酶浓度以及退火温度设定 5 个
梯度(表 1)。
参考文献
Blair M.W., Panaud O., and McCouch S. R., 1999, Inter-simple se-
quence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatel-
lite motif frequency and fingerprint in rice (Oryza sativa L.),
Theor. Appl. Genet., 98(5): 780-792
D觃vila J.A., Loarce Y., and Ferrer E., 1999, Molecular character-
ization and genetic mapping of random amplified mi-
crosatellite polymorphism in barley, Theor. Appl. Genet., 98
(2): 265-273
Gibert J.E., Levis R.V., Wiknson M.J., and Caligari P.D.S., 1999,
Developing an appropriate strategy to assess genetic vari-
ability in plant germplasm collections, Theor. Appl. Genet.,
98(6-7): 1125-1131
Gupta P.K., and Varshney R.K., 2000 ,The development and use
of microsatelite markers for genetic analysis and plant
breeding with emphasis on bread wheat, Euphytica,113(3):
163-185
Hong M.W., Yang R.P., and Li W.X., 2008, Optimizations of the
inter-simple sequence repeat reaction system in pomegranate,
Yunnan Daxue Xuebao (Journal of Yunnan Agricultural Uni-
versity), 23(1): 15-18 (洪明伟,杨荣评,李文祥, 2008,石榴
ISSR-PCR 反应体系的优化研究 , 云南大学学报 , 23(1):
15-18)
Hu J.B., Li J., Li Q., and Sun Z.Q., 2008, Establishment and opti-
mization of ISSR-PCR amplification in Dioscorea zingiberen－
表 1毛薯 ISSR-PCR体系各因素的梯度水平
Table 1 Different concentration of each factor in ISSR-PCR sys-
tem of D. esculenta
水平
Levels
1
2
3
4
5
因素
Factors
Ⅰ
(μmol/L)
0.2
0.5
0.8
1.2
1.6
Ⅱ
(ng)
25
50
75
100
150
Ⅲ
(U/μL)
0.4
0.6
0.8
1.2
2.0
Ⅳ
(mmol/L)
0.1
0.3
0.5
0.8
1.0
Ⅴ
(mmol/L)
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Ⅵ
(℃)
47
50
52
54
57
注:Ⅰ: 引物; Ⅱ: DNA; Ⅲ: Taq; Ⅳ: dNTPs; Ⅴ: Mg2+; Ⅵ: 退火
温度
Note:Ⅰ: Primer; Ⅱ: DNA; Ⅲ: Taq; Ⅳ: dNTPs; Ⅴ: Mg2+; Ⅵ:
Annealing temperature
177
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
sis C.H. Wright, Huazhong Nongye Daxue Xuebao (Journal
of Huazhong Agricultural University), 27(1): 105-109 (胡建
斌,李静,李琼, 孙治强, 2008, 盾叶薯蓣 ISSR-PCR扩增
条件研究,华中农业大学学报, 27(1): 105-109)
Kantety R.V., Zeng X.P., Bennetzen J.L., and Zehr B.E., 1995,
Assessment of genetic diversity in popcorn (Zea mays L.) in-
bred linesusing inter-simple sequence repeat (ISSR)amplifica-
tion, Mol. Breed., 1(4): 365-373
Li P., Wang Y.D., Chen Y.C., and Zhang X.P., 2008, Establish-
ment of optimum ISSR-PCR reaction system in tung oil tree
(Vernicia fordii), Linye Kexue Yanjiu (Forest Research), 21
(2): 194-199 (李鹏,汪阳东,陈益存,张小平, 2008,油桐
ISSR-PCR 最佳反应体系的建立, 林业科学研究 , 21(2):
194-199)
Ling Y.X., Huang D.Y., Huang X.L., Zhou X., Cheng W.J., and
Luo X., 2009, Extraction of high quality DNA from Leaves
of Dioscorea oposetap Thunb. with modified CTAB method,
Anhu i Nongye Kexue (Journal of Anhui Agricultural Sci-
ences), 37(22): 10413-10414, 10419 (李月仙,黄东益,黄小
龙, 周鑫, 程文杰, 罗欣, 2009, 利用改良 CTAB 法提取
淮山叶片高质量 DNA, 安徽农业科学 , 37(22): 10413-
10414,10419)
Prevost A., and Wilkinson M.J, 1998, A new system of compar-
ing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato
cultivars, Theor. Appl. Genet., 98(1): 107-112
Qu C., Sun Q., Ding Z.M., Wang J.H., and Sun B.Q., 2009, Opti-
mization of ISSR-PCR system in Trichosanthes kirilowii
maxim, JiyinzuxueYuYingyong Shengwuxue (Genomics and
Applied Biology), 28(1): 127-131 (曲超,孙群,丁自勉,王
建华, 孙宝启, 2009, 栝楼 ISSR-PCR反应体系的建立和
优化,基因组学与应用生物学, 28(1): 127-131)
Reddy M.P., Sarla N., Siddiq E.A., 2002, Inter simple sequence
repeat (ISSR) polymorphixm and its application in plant
breeding, Euphytica, 128(1): 9-17
Xi J.B., Zheng Y.Z., and Yang Z.Y., 2004, Establishment and
Optimization of ISSR reaction system for carpetgrass,
Zhongshan Daxue Xuebao (Acta Scienttiarum Naturalium
Universitatis Sunyatseni), 43(3): 80-84 (席嘉宾,郑玉忠,杨
中艺, 2004,地毯草 ISSR反应体系的建立与优化,中山大
学学报(自然科学版), 43(3): 80-84)
Zhang D.M., Wei H.L., Sun J.L., and Qian Y.Y., 2008, The es-
tablishment of ISSR-PCR system of acer trees, Shanghai
Nongye Xuebao (Acta Agricul turae Shanghai), 24(1): 51-54
(张冬梅 , 魏华丽 , 苏金乐 , 钱又宇 , 2008, 槭属树种 IS-
SR-PCR反应体系的确立,上海农业学报, 24(1): 51-54)
Zheng D.J., Liu G.M., Liang Y.F., Yan D.H., Linghu C.D., and
Tian Y.H., 2009, Studies on optimization of ISSR amplified
conditions in Kudingcha species in Oleaceae of China, Zhi-
wu Yanjiu (Bulletin of Botanical Research), 29(2): 234-241
(郑道君 , 刘国民 , 梁远发 , 鄢东海 , 令狐昌弟 , 田永辉 ,
2009,中国木犀科苦丁茶 ISSR实验条件优化的研究,植
物研究, 29(2): 234-241)
Zietkiewicz E., Rafalski A., and Labuda D., 1994, Genome fin-
gerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored poly-
merase chain reaction amplification, Genomics, 20: 176-183
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000174178