全 文 ：MBP在真核细胞中的表达情况和作用机制奠定了基础。
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( 编校: 徐萌)
乌骨藤制剂诱导人肝癌细胞 Bel － 7402 凋亡的实验研究
张 锐1，刘 静1，刘阳晨1，周绍兵1，叶宏勋1，崔永安2
Experimental study on effect of Glaucescent Fissistigma Root preparation on Bel
－ 7402 cells apoptosis
Zhang Rui1，Liu Jing1，Liu Yangchen1，Zhou Shaobing1，Ye Hongxun1，Cui Yong＇an2
1Taixing People＇s Hospital，Yangzhou University，Jiangsu Taixing 225400，China; 2Taizhou People ＇s Hospital，Jiangsu Taizhou 225300，
China．
【Abstract】 Objective: To study the effect of Glaucescent Fissistigma Root preparation on Bel － 7402 cells and its
mechanisms．Methods: After being treated by Glaucescent Fissistigma Root injection of different concentrations，untre-
aed cells as control，viability of Bel － 7402 cells was determined by MTT method，apoptosis and p53 protein assessed
by FACS． Results: The inhibition( 11． 57%，21． 09% and 31． 27% in 24h，27． 55%，35． 95% and 45． 13% in 48h)
was observed while the cells were treated by different concentrations of Glaucescent Fissistigma Root injection． Also，
the apoptosis［( 12． 2 ± 0． 67) %，( 17． 4 ± 0． 69) %，( 22． 9 ± 1． 38) %］and the increasing of p53 protein was detec-
ted after treated by the injection( 20mg /ml，40mg /ml，80mg /ml) ． Conclusion: Glaucescent Fissistigma Root injection
could inhibit the proliferation of Bel － 7402 cells and induce apoptosis，the mechanisms may be related with p53 gene
being activated．
【Key words】Glaucescent Fissistigma Root; hepatoma cells; apoptosis; p53
Modern Oncology 2013，21( 03) : 0488 － 0491
【收稿日期】 2012 － 02 － 23 【修回日期】 2012 － 03 － 09
【作者单位】 1扬州大学附属泰兴人民医院肿瘤放疗科，江苏 泰兴 225400
2泰州市人民医院肿瘤科，江苏 泰州 225300
【作者简介】 张锐(1984 －) ，男，安徽巢湖人，医师，主要从事恶性肿瘤的临床与基础研究。E － mail:94482467@ qq． com
【通讯作者】 刘阳晨(1969 －) ，男，江苏泰兴人，主任医师，主要从事恶性肿瘤的临床与基础研究。E － mail:liuyctx@ 163． com
·884· 张 锐，等 乌骨藤制剂诱导人肝癌细胞 Bel － 7402 凋亡的实验研究
【摘要】 目的:探讨乌骨藤制剂对人肝癌细胞 Bel － 7402 株的影响并初步探讨其机制。方法:分别用不同浓
度的乌骨藤制剂处理人肝癌细胞 Bel － 7402，未经药物处理的细胞为阴性对照组，采用 MTT法检测肝癌 Bel －
7402 细胞增殖、流式细胞术检测人肝癌细胞 Bel － 7402 的凋亡情况以及 p53 蛋白的表达。结果:不同浓度的
乌骨藤制剂(10mg /ml，20mg /ml，40mg /ml)处理肝癌 Bel － 7402 细胞后，其增殖受到抑制，作用 24h 的抑制率
分别为 11． 57%、21． 09%、31． 27%，48h 的抑制率为 27． 55%、35． 95%、45． 13%，随着药物浓度的增加
(20mg /ml，40mg /ml，80mg /ml)细胞凋亡显著增加，凋亡率分别为(12． 2 ± 0． 67)%、(17． 4 ± 0． 69)%、
(22． 9 ± 1． 38)%，而 p53 蛋白的表达也随着药物浓度的增加而增加。结论:乌骨藤制剂能够抑制人肝癌细胞
的增殖，诱导其凋亡，作用机制可能与激活 p53 基因有关。
【关键词】乌骨藤;肝癌细胞;凋亡;p53
【中图分类号】R73 － 34;R735． 7 【文献标识码】A DOI:10． 3969 / j． issn． 1672 － 4992． 2013． 03． 11
【文章编号】1672 － 4992 －(2013)03 － 0488 － 04
乌骨藤，系萝藦科牛奶菜属植物通光藤的藤茎，始载于
《滇南本草》，其化学成分主要有甾体酯苷、多糖、树脂、色素、
有机酸以及生物碱等一些其他成分;其药理作用非常广泛，
主要有抗癌、平喘、降压、免疫调节、止痛、戒毒以及保肝利
尿、恢复肿瘤患者因放化疗导致的血细胞下降等。但是对于
乌骨藤抗肿瘤药理的作用机理、作用方式等方面的报道极
少，因此我们以诱导细胞凋亡为切入点，深入研究和探讨乌
骨藤抗肿瘤方面的作用及机制，为临床更好的运用乌骨藤抗
肿瘤提供理论基础。
1 材料与方法
1． 1 主要材料
人肝癌细胞 Bel － 7402 株(扬州大学医学院中医系实验
室提供) ;乌骨藤制剂(20ml /支，批号:200607141，南京圣和
药业，商品名:消癌平) ;细胞培养液 RPMI － 1640 培养基(美
国 GIBCO /BRL产品) ;小牛血清(杭州四季青生物工程材料
有限公司产品) ;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，噻唑蓝，
AMRESCO公司) ;二甲基亚砜(DMSO，AMRESCO 公司) ;台
盼兰(Trypan Blue，美国 Sigma产品) ;胰蛋白酶(1∶ 250，美国
Sigma产品) ;p53 单抗(博士德生物工程有限公司) ;FITC －
IgG(博士德生物工程有限公司) ;CO2 培养箱(法国 DEN-
MARK公司) ;XDS － 1B 倒置生物显微镜(重庆光学仪器
厂) ;超净工作台(上海博讯公司医疗设备厂) ;MULTISKAN
MK3 型酶联免疫检测仪(LABSYSTEM 公司) ;CENTRI-
FUGE5415R、MINISPIN微型低温高速离心机(德国 EPPEN-
DORF公司) ;流式细胞仪(FACSAria，美国 BD 公司产品) ;
细胞培养液为 1640 培养液，含 10%的小牛血清。
1． 2 MTT法检测乌骨藤制剂对 Bel －7402 细胞增殖的抑制
将对数生长期的 Bel － 7402 细胞，细胞计数板计数后稀
释，接种于平底 96 孔板，每孔 180μl，细胞浓度为 4 × 104 /ml;
置 37℃、5%CO2 培养箱培养 24h使细胞贴壁;加入不同浓度
的药物(用 10%小牛血清的 1640 培养液稀释的乌骨藤制
剂) ，每孔 20μl，使得终浓度分别为 10、20、40mg /ml，另设阴
性对照组(孔内加细胞及等量的 1640 培养基，不加药) ，每组
复 6 孔，继续分别培养 24、48h;每孔加入 20μl MTT 溶液
(5mg /ml，即 0． 5%MTT) ，37℃继续培养 4h;每孔加入 150μl
DMSO，微量振荡器上轻微振荡 10min，使结晶物充分溶解，在
酶联免疫检测仪 490nm处测量各孔的吸光值(OD)。每组实
验均重复 3 次。用以下公式计算细胞存活率与抑制率:
细胞存活率(%)=(用药组 OD值 /对照组 OD值)× 100%
细胞抑制率(%)= 1 －细胞存活率［1］
1． 3 流式细胞术检测乌骨藤制剂作用后 Bel － 7402 细胞的
凋亡率变化
取对数生长期的人肝癌 Bel － 7402 细胞，以 5 × 104 个 /
孔的细胞浓度接种于 24 孔培养板中;24h后加入不同浓度的
乌骨藤制剂，使其最终浓度分别为 20、40、80mg /ml，每个浓
度设置 6 个复孔，阴性对照组用等体积的 1640 培养基替代;
分别孵育 48h 后，消化细胞。放入离心机 1500r /min 离心
5min，弃上清液，加入 PBS液洗涤 2 次。1500r /min离心 5min
收集细胞;转移到 1． 5ml 的 EP 管中，加入 10μl 碘化丙锭
(propidine iodide，PI) ，混匀后于室温下避光 10min，流式细胞
仪上样检测凋亡细胞。实验重复 3 次。
1． 4 流式细胞术检测乌骨藤制剂对 Bel － 7402 细胞内抑癌
基因 p53 表达的影响
将对数生长期的肝癌 Bel － 7402 细胞以 4 × 105 个 /ml
接种于 6 孔板中，置于 37℃、5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱
中培养 24h;加入不同浓度的乌骨藤制剂，使其终浓度为
10mg /ml、20mg /ml和 40mg /ml，对照组用等体积 RPMI － 1640
替代;孵育 24h后，收集细胞，调节其浓度为 1 × 107 个 /ml;取
100μl的细胞悬液放入 1． 5ml EP 管中，然后加入含有 1%多
聚甲醛的 PBS 固定 10min;离心后去上清，再加入含有 0． 1%
Triton X － 100 的 PBS ，室温放置 15min;PBS 洗 3 遍;加
入 1∶ 200 稀释的鼠抗人 p53 单抗 100μl，室温下放置 30min;
PBS洗 3 遍;弃上清后加入 1 ∶ 32 稀释的羊抗鼠 FITC － IgG
100μl，室温下避光静置 30min;PBS 洗 3 遍，最后加入 1ml
PBS，上流式细胞仪检测。结果判定:p53 蛋白荧光指数(flur-
esence index，FI)表示定量的 p53 蛋白。绿荧光 LOG 收集的
荧光强度峰值数转化成线性刻度，对照管作为阴性表达 FI =
1。FI 计算公式如下:FI =检测管细胞平均荧光强度 /对照管
细胞平均荧光强度。如 FI ＞ 1． 0 为阳性表达，FI≤1． 0 为阴
性表达［2］。
1． 5 统计学方法
采用 SPSS 10． 0 软件分析，数据用 珋x ± s 表示，组间比较
用 t检验。
2 结果
2． 1 乌骨藤制剂抑制 Bel －7402 细胞的增殖
实验结果表明乌骨藤制剂显示不同组的药物直接作用
于 Bel － 7402 肿瘤细胞后，细胞均出现一定的变化:体积变
小、变形，某些细胞甚至出现发泡、皱缩、变圆、脱落现象。
10、20、40mg /ml 剂量组的乌骨藤制剂作用于 Bel － 7402
细胞 24 h 后，其 OD 值分别为0． 7137 ± 0． 0187、0． 6368 ±
0． 0806、0． 5547 ± 0． 0396，抑制率分别为 11． 57%、21． 09%、
31． 27%，而阴性对照组的OD 值为 0． 8070 ± 0． 0404;作用
·984·现代肿瘤医学 2013 年 3 月 第 21 卷第 3 期 MODERN ONCOLOGY，Mar. 2013，VOL. 21，NO. 03
48h后，其 OD 值分别为 0． 6727 ± 0． 0334、0． 5947 ± 0． 0138、
0． 5095 ± 0． 0158，抑制率分别为 27． 55%、35． 95%、45． 13%，
而阴性对照组的 OD 值为 0． 9285 ± 0． 0263。提示不同剂量
组的药物作用于 Bel － 7402 细胞 24h和 48h与同时间段阴性
对照组比较，均有统计学意义(P ＜ 0． 01) ，各组同一浓度体
系，24h与 48h相比较均有差异(P ＜ 0． 05) ，表明乌骨藤制剂
在三个浓度梯度均可以显著抑制 Bel － 7402 细胞的增殖，且
随着药物浓度的升高，抑制率升高。
2． 2 乌骨藤制剂诱导 Bel －7402 细胞的凋亡
Bel － 7402 肝癌细胞经不同浓度的乌骨藤制剂作用 48h
后，细胞凋亡率与对照组比较均有所增加，随着药物浓
度的升高(20、40、80mg /ml) ，凋亡峰总体向右移动(图
1) ，凋亡率升高，凋亡率分别为(12． 2 ± 0． 67)%、(17． 4 ±
0． 69)%、(22． 9 ± 1． 38)%，且呈现剂量依赖性，各浓度组与
阴性组比较有统计学意义(P ＜ 0． 01)。
图 1 乌骨藤制剂诱导肝癌细胞 Bel － 7402 的凋亡图
Fig． 1 The apoptosis maps of the Bel － 7402 cells effected by Glaucescent Fissistigma Root
2． 3 乌骨藤制剂对 Bel － 7402 细胞内抑癌基因 p53 表达的
影响
各个浓度的乌骨藤制剂(10、20、40mg /ml)作用于 Bel －
7402 细胞后，利用流式细胞免疫荧光技术检测细胞中 p53 基
因产物。随着药物浓度的增加，p53 峰总体向右偏移，见图
2。经乌骨藤制剂作用 24h 后，流式检测的各个用药组细胞
表达的 p53 荧光强度均增加，与阴性对照组相比，均有显著
差异(P ＜ 0． 01)。根据 FI 计算公式计算出 FI 值，经乌骨藤
制剂作用 24h 后，p53 均呈阳性表达，且 FI 值随剂量的增加
而增高。其具体数值见表 1。
图 2 乌骨藤制剂作用后肝癌细胞 Bel － 7402 p53 表达的变化
Fig． 2 The changes of p53 protine in the Bel － 7402 cells effected
by Glaucescent Fissistigma Root
表 1 乌骨藤制剂对 Bel － 7402 细胞内抑癌基因 p53 表达的影
响
Tab． 1 p53 expression in the Bel － 7402 cells effected by Glauces-
cent Fissistigma Root
Group n Mean fluorescence intensity FI
Control 6 230． 00 ± 13． 06 1． 00
10mg /ml 6 279． 00 ± 8． 19* 1． 21
20mg /ml 6 331． 67 ± 12． 34* 1． 44
40mg /ml 6 381． 33 ± 7． 23* 1． 66
* P ＜ 0． 01 与阴性对照组比较
* P ＜ 0． 01 compared with the negative control group
3 讨论
乌骨藤，又名通关藤，为萝藦科牛奶菜属植物，分布于贵
州、云南、福建等地，据文献［3］记载:“通关藤味苦微寒，入肝
肺胃经，抗癌散结、止咳平喘”。云南、贵州民间用其治疗癌
症取得良效，现代药理研究表明，乌骨藤含有的独特化学成
分具有免疫调节、保肝利尿、败毒抗癌等作用。
近年来有文献报道应用乌骨藤制剂联合放化疗取得良
好疗效，多个体外实验表明，乌骨藤对胃癌细胞、白血病细
胞、食管癌细胞、人肠癌细胞等多种肿瘤细胞有抑制作
用［4 － 9］。本实验组观察了乌骨藤制剂体外抗人肝癌细胞 Bel
－ 7402 的活性，并应用细胞及分子生物学技术初步探讨了乌
·094· 张 锐，等 乌骨藤制剂诱导人肝癌细胞 Bel － 7402 凋亡的实验研究
骨藤制剂体外抗肿瘤作用的可能机制，为其临床应用提供实
验依据。
本实验中，乌骨藤制剂作用于人肝癌细胞 Bel － 7402，
MTT结果显示，乌骨藤制剂能够有效抑制 Bel － 7402 细胞增
殖，且呈明显的时间依赖性和浓度依赖性，形态上表现为肝
癌细胞伪足回缩，细胞变小、变圆，核分裂象减少，出现悬浮
现象，失去传代能力，且药物浓度越高，以上变化越明显。赵
和平等［10］将不同浓度的乌骨藤制剂作用于小鼠 Hepal － 6 肝
癌细胞，结果显示乌骨藤对 Hepal － 6 肝癌细胞的生长具有
明显的浓度依赖性抑制作用，且细胞形态学表现与本实验组
相似。
细胞凋亡是一种主动的由基因决定的细胞自我破坏过
程，在维持机体正常发育、稳定内环境和抵御刺激的过程中
具有重要意义，它在肿瘤的形成、生长速度和预后方面也起
着十分重要的作用。因此，能够诱导肿瘤细胞凋亡的药物，
将在肿瘤的治疗过程中发挥重要的作用，诱导肿瘤细胞凋
亡，也成为筛选抗肿瘤药物的一个重要指标。乌骨藤制剂是
乌骨藤根部提取的灭菌水溶液，体外研究证实，乌骨藤对
U937、HL － 60 白血病细胞有显著的抑制和诱导凋亡作用，其
机制为乌骨藤通过降低线粒体跨膜电位，活化 caspase － 3，剪
切 PARP，诱导白血病细胞凋亡［6］。张开通等［11］的实验研究
发现乌骨藤制剂能够减少 H22 肝癌腹腔积液瘤模型小鼠的
腹腔积液形成，抑制 H22 肝癌细胞生长，促进肝癌细胞晚期
凋亡的发生。本实验结果显示，乌骨藤制剂可以诱导 Bel －
7402 肝癌细胞株发生凋亡，而且凋亡率随着药物浓度的增高
而升高。
p53 是至今为止我们发现与人类肿瘤相关性最为密切的
基因之一［12］。p53 基因位于人类染色体 17p13． 1，全长
20kb，含有 11 个外显子，第 1 个外显子不编码，外显子 2、4、
5、7、8 分别编码 5 个进化上高度保守的结构域，分别为 13 －
19，117 － 142，171 － 192，236 － 258，270 － 286 编码区。p53 基
因包括野生型和突变型两种。野生型 p53 是人体内重要抑
癌基因，参与细胞周期、细胞凋亡、DNA 损伤修复等表达调
控［13 － 15］，在细胞周期中起着“分子警察”的作用［16］。肝癌细
胞中常出现 p53 基因突变或等位性缺失［17］。Bressac 等［18］
研究了 7 个肝癌来源细胞株中的 p53 基因，在 DNA、RAN 及
蛋白水平有 6 个细胞株 p53 异常，表明 p53 改变在肝细胞向
恶性表型转化过程中起着重要作用。激活 p53 基因能引起
野生型 p53 表达，可以抑制肝癌细胞的生长以及肝细胞表型
的转化。
研究发现，经典的细胞凋亡途径为线粒体途径和死亡受
体途径，而且这 2 条途径经 Bcl － 2 家族成员(如 Bax)的活化
而交织在一起，最终引起 caspase － 3 的激活而发生细胞凋
亡［19］。p53 蛋白首先是在 SV40 转化的细胞中被发现的，它
是由一个持家基因编码的 53kD 的蛋白质。现已经明确 p53
是细胞生长周期中负调节因子，与细胞周期的调控、DNA 修
复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关，在抑制癌
细胞生长过程中起到了重要的作用。该蛋白质也因此引起
了研究者的广泛重视。p53 主要是通过在转录水平上调控一
些编码细胞生长和凋亡过程的基因从而抑制肿瘤的发生。
经过二十多年的研究，非转录依赖的 p53 蛋白调控机制得到
了一些新的进展，这些新的研究表明 p53 蛋白通过与线粒体
中 Bcl 家族抗细胞凋亡成员的相互作用从而参与了线粒体
中的细胞凋亡途径。
本实验发现，乌骨藤制剂可以促进 p53 蛋白的表达，提
示乌骨藤制剂诱导 Bel － 7402 肝癌细胞株凋亡可能与其调控
p53 活性有关，为其在临床上抗肿瘤的应用提供理论依据。
此外，其抗肿瘤作用以及诱导肿瘤凋亡的途径有待进一步研究。
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·194·现代肿瘤医学 2013 年 3 月 第 21 卷第 3 期 MODERN ONCOLOGY，Mar. 2013，VOL. 21，NO. 03