全 文 ：［收稿日期］ 20110906(006)
［基金项目］ 中国博士后科学基金特别项目(200902550) ;辽
宁省教育厅基金资助项目(2009T066) ;大连科技
局青年基金项目(2009J22DW040)
［第一作者］ 倪冲，硕士研究生，从事中药质量评价及创新药物
开 发， Tel: 15998619397， E-mail: faanmoiloyo
@ 163. com。
［通讯作者］ * 康廷国，教授，E-mail:kangtg@ lnutcm． edu． cn
* 张慧，副教授，E-mail:syyycs@ 163. com
乌骨藤中白桦酯酸的提取分离及抗肿瘤活性
倪冲，裴志东，张镓小，李春雪，张慧 * ，康廷国 *
(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)
［摘要］ 目的:对乌骨藤中白桦酯酸进行提取分离，并探讨其抗肿瘤活性。方法:采用硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20 凝
胶柱色谱法及半制备高效液相色谱法，对白桦酯酸进行提取分离，并采用结晶紫法，以细胞死亡率为检测指标，观察白桦酯酸
在不同质量浓度 1 ～ 500 mg·L － 1情况下，对细胞密度为 1 × 104 /孔的 4 种肿瘤细胞分别作用 12，24，36，48 h 的生长抑制作用。
结果:白桦酯酸对人宫颈癌细胞 HeLa、人胃癌细胞 MGC、人乳腺癌细胞 MCF-7 具有很好的增殖抑制作用，并呈剂量依赖效应，
在质量浓度为 500 mg·L － 1作用 48 h 时，对 Hela 细胞及 MGC 细胞的死亡率分别为 77. 9%，81. 7%，质量浓度为 100 mg·L － 1作
用 48 h 时，对 MCF-7 的细胞死亡率为 74. 1%，但对人乳腺导管癌细胞(ZR 株)作用不显著。结论:白桦酯酸对 HeLa，MGC，
MCF-7 肿瘤细胞具有抗肿瘤活性，对 ZR 株肿瘤细胞作用不明显。
［关键词］ 白桦酯酸;乌骨藤;提取分离;抗肿瘤
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)09-0172-04
Study on Extraction，Isolation and Antitumor Activity of Betulinic
Acid from Caulis Marsdeniae tenocissimae
NI Chong，PEI Zhi-dong，ZHANG Jia-xiao，LI Chun-xue，ZHANG Hui* ，KANG Ting-guo*
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)
［Abstract］ Objective: Extraction and isolation of betulinic acid from Marsdenia tenacissima and
investigate the anti-tumor activity were investigated． Method: By using silica gel column chromatography，
Sephadex LH-20 chromatography and semi-preparative reversed phase liquid chromatograph， extraction and
isolation of betulinic acid，and MTT assay was applied in demonstrating effect on antitumor effect in four tumor cells
with different concentrations and at different action time． Result:The growth of cervical cancer cells HeLa，gastric
cancer cells MGC，breast cancer MCF-7 was significantly inhibited by betulinic acid with a manner of dose-
dependence． After 48 h，the cell death rate of HeLa and MGC was 77. 9%，81. 7%，respectively． When the
concentration of the sample was 500 mg·L － 1，the cell death rate of MCF-7 was 74. 1%，when the concentration of
the sample was 100 mg·L － 1，the effect on ducal carcinoma cells was not significant． Conclusion:Betulinic acid
has an anti-tumor activity on HeLa，MGC，MCF-7．
［Key words］ betulinic acid;Marsdeniae tenocissimae;extraction and isolation;anti-tumor
乌 骨 藤 为 萝 藦 科 牛 奶 菜 属 植 物 通 关 藤 Marsdenia tenocissima(Roxb)Wight et Arn 的干燥藤
茎，具有消炎、清热解毒、散结止痛等功效。现代药
理临床证实本品具有调节免疫功能，抗肿瘤等作
用［1］。目前其单味药材制成的注射液作为治疗消
化道癌的一线药物广泛应用于临床［2］，是临床必用
的抗肿瘤药物之一。为探明其抗肿瘤的活性成分，
本试验从乌骨藤中提取分离了白桦酯酸，进行了结
构确证和纯度分析，并采用结晶紫法［3］进行了体外
抗肿瘤活性研究，为 乌骨藤的新药 研 发 奠 定
基础。
·271·
第 18 卷第 9 期
2012 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 9
May，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.09.034
1 材料
1. 1 药材 乌骨藤购于安国市杏林药材有限公司，
经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定
为 Marsdenia tenacissima(Roxb．)Wight et Arn． 的干
燥藤茎。
1. 2 细胞系 人宫颈癌细胞 HeLa;人胃癌细胞
MGC;人乳腺癌细胞 MCF-7 等购自中国科学院上海
细胞生物所;人乳腺导管癌细胞 ZR 购自北京百星
高科技术开发有限公司。
1. 3 仪器 Waters 半制备高效液相色谱仪(美国
Waters 公司) ，SephadexLH-20 凝胶(Pharma-cia 公
司) ，96 孔无菌培养板(美国 Costar 公司) ，血球计数
板(上海求精生化仪器厂) ，DMEM 培养基(美国
GIBCO 公司) ，SUNRISE 酶标仪(瑞士 TECAN 公司)。
1. 4 试剂 小牛血清(NBCS) (杭州四季青生物工
程材料有限公司) ，胰蛋白酶、四氮唑盐(MTT) (美
国 GIBCO 公司) ，甲醇为色谱纯(天津科密欧) ，其
他试剂为分析纯。
2 方法
2. 1 白桦酯酸的提取分离
2. 1. 1 提取 取乌骨藤干燥藤茎粗粉(过 60 目
筛)50 kg，以 8 倍量 70%乙醇提取 2 h，70%乙醇 6
倍量提取 2 h，合并提取液，减压浓缩至浸膏，加水溶
解，分别以石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次萃
取 3 次，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇并浓缩
得浸膏 392 g。
2. 1. 2 分离 取正丁醇部分(114 g) ，经硅胶
(200 ～ 300 目)柱层析分离，以三氯甲烷-甲醇梯度
洗脱，分段接收，共得到 26 个流分。其中流分 2 再
经硅胶柱层析色谱分离，分别以石油醚-乙酸乙酯溶
剂系统梯度洗脱，收集体积比为 100 ∶ 6和 100 ∶ 18 洗
脱部分;流分 4 再经硅胶柱层析色谱分离，分别以氯
仿-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，收集体积比为 100∶
15 洗脱部分，再经 Sephadex LH-20 凝胶柱色谱分
离，收集氯仿-甲醇混合溶剂(1 ∶ 2)洗脱部分。取上
述 3 个洗脱部分，经 TLC 检识，成分有所交叉，故将
三者合并，甲醇超声溶解，备用。
2. 1. 3 纯化 取上述溶液，用 0. 45 μm 微孔滤膜
滤过，注入半制备液相色谱仪。色谱条件为色谱柱
Phenomenex Kromasil C18(250 mm × 10 mm，5 μm) ;
流动相甲醇-水(98∶ 2) ;进样质量浓度 5 g·L － 1;进样
量 600 μL，流速 4 mL·min － 1;柱温 25 ℃;检测波长
210 nm。根据色谱峰出峰时间接受流分，分离得到
化合物Ⅰ23. 6 mg，化合物Ⅱ30. 1 mg 和化合物Ⅲ
27. 1 mg。取化合物Ⅱ，经氯仿-甲醇重结晶，得白桦
酯酸，经 HPLC 测定，纯度为 96. 87%［4］。
2. 1. 4 结构测试 取化合物Ⅱ进行 HRMS，IR，
NMR 的结构测试。
2. 2 白桦酯酸抗肿瘤活性的研究
2. 2. 1 试剂的配制 结晶紫溶液:称取适量结晶紫
固体，溶解于生理盐水中，使结晶紫质量浓度为
0. 1%。用 0. 22 μm 微孔滤膜过滤除菌，－ 20 ℃避
光保存。
磷酸盐缓冲溶液(PBS) :取 8. 0 g NaCl，0. 2 g
KCl，0. 2 g KH2PO4，3. 49 g Na2HPO4·12H2O，加三
蒸水1 000 mL 溶解，调 pH 7. 2 ～ 7. 4，250 mL 分装，
用装有 0. 22 μm 和 0. 45 μm 的不锈钢无菌微孔滤
膜滤器过滤除菌，－ 4 ℃冰箱保存。
培养液:取 RPMI1640 培养基干粉 1 袋(1 L) ，
搅拌溶解于 900 mL 三蒸水中，用磁力搅拌器搅拌至
全部溶解后，加入 NaHCO3 2. 0 g，100 U·mL
－ 1的青
霉素，100 μg·mL － 1链霉素及 56 ℃水浴灭活的胎牛
血清 10 mL，补加三蒸水至最终体积，再用磁力搅拌
器搅拌搅匀。调整培养液的 pH 至 7. 2 ～ 7. 4。用装
有 0. 22 μm 和 0. 45 μm 的不锈钢无菌微孔滤膜滤
器过滤除菌，250 mL 分装于无菌玻璃瓶，－ 20 ℃冰
箱中保存。
0. 25%胰蛋白酶:取 2. 5 g 胰蛋白酶，加 PBS 缓
冲盐 500 mL 溶解，调 pH 7. 2 ～ 7. 4，装有 0. 22 μm
和 0. 45 μm 的不锈钢无菌微孔滤膜滤器过滤除菌，
20 mL 分装，－ 20 ℃保存。
2. 2. 2 药液的配制 受试药物:取白桦酯酸 50
mg，加乙醇定容至 10 mL。使其质量浓度为 5 g·
L － 1，精密量取适量，加入含 10%小牛血清的 RPMI
1640 培养液稀释制成 1，10，50，100，500 mg·L － 1溶
液，用 0. 22 μm 微孔滤膜过滤除菌，备用。阳性对
照药:取 5-FU 注射液，加入含 10% 小牛血清的
RPMI 1640 培养液稀释制成 1，10，50，100，500 mg·
L － 1的溶液，用 0. 22 μm 微孔滤膜过滤除菌，备用。
2. 2. 3 细胞培养 取用胰酶消化后收集的细胞，
用 PBS 洗涤 1 ～ 2 次后，制备成单细胞悬液，细胞
计数后接种于培养瓶中。细胞单层接种在含有
10%新生小牛血清的培养液中。培养液为 RPMI-
1640(GIBCO)、谷氨酰胺(GIBCO)质量浓度为
3%，培养温度为 37 ℃ 5% CO2，一般为 2 ～ 3 d 传
代 1 次。
2. 2. 4 肿瘤细胞的体外生长抑制实验 取肿瘤细
胞以 1 × 104 /孔的密度接于 96 孔板(NUNCTM，
·371·
倪冲，等:乌骨藤中白桦酯酸的提取分离及抗肿瘤活性
Denmark)中，培养 24 h 后待细胞贴壁后，换成含有
上述不同浓度受试药物以及含有阳性对照药物 5-
FU 的 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液，每孔 100
μL，同时设空白对照，分别培养 12，24，36，48 h。采
用结晶紫染色法［9］，即结晶紫染液 50 μL 在常温下
染色 10 min 后，在酶标仪(ELX 800)在 595 nm 处测
定存活细胞 A) ，每个实验平行 3 次，通过测定 A 来
确定活细胞的数量［10］，计算细胞死亡率。
细胞生长抑制率 =(1 － A加药组 /A对照组)× 100%
2. 3 统计学方法 结果以 珋x ± s 表示，采用 t 检验，
以 SPSS 16. 0 软件处理，P ＜ 0. 05 有统计学意义。
3 结果
3. 1 白桦酯酸的结构确证 白色针状结晶(氯仿-
甲醇) ，mp 285 ～ 287 ℃，Libermann-Burchard 反应阳
性，10% 硫酸乙醇溶液 105 ℃ 加热后显紫色。
HRMS［M-H］－ m / z:455. 351 3。 IR(KBr)cm － 1:
3 465，3 451(－ OH) ，3 078(－ C = CH2) ，2 939 ～
2 872(－ CH2 － CH3) ，1 690 (－ CO － OH) ，1 643
(C = C) ，1 049，879(C = CH2)。
1H-NMR(C5D5N，300
MHz)δ:1. 77(3H，S，H-30) ，0. 81，1. 00，1. 04，1. 06，
1. 22(各 3H，s，Me-23，24，25，26，27) ，3. 46(1H，m，
H-3) ，4. 76(1H，s，H-29b) ，4. 94(1H，s，H-29a) ;13 C-
NMR(C5D5N，300MHz)δ:39. 5(C-1) ，28. 3(C-2) ，
78. 1(C-3) ，39. 3(C-4) ，55. 9(C-5) ，18. 8(C-6) ，34. 8
(C-7) ，41. 1(C-8) ，51. 0(C-9) ，37. 5(C-10) ，21. 2(C-
11) ，26. 1(C-12) ，38. 6(C-13) ，42. 9(C-14) ，31. 2(C-
15) ，32. 9(C-16) ，56. 6(C-17) ，47. 8(C-18) ，49. 8(C-
19) ，151. 4(C-20) ，30. 3(C-21) ，37. 5(C-22) ，28. 7(C-
23) ，16. 3(C-24) ，16. 4(C-25) ，16. 4(C-26) ，14. 9(C-
27) ，178. 9(C-28) ，110. 0(C-29) ，19. 5(C-30)。以上
数据与文献［5］报道一致，为此确定该化合物为白桦酯
酸(betulinic acid)。结构式如图 1。
图 1 白桦酯酸的化学结构
3. 2 对人宫颈癌细胞 HeLa 的生长抑制作用 实
验结果表明，细胞死亡率随给药剂量的增加而增加。
在受试样品培养 48 h，质量浓度为 500 mg·L － 1时，
抑瘤率为 77. 9%，与阳性对照 5-FU 抑瘤作用基本
相当;细胞死亡率与浓度关系见表 1。
表 1 样品浓度和作用时间与细胞死亡率关系(珋x ± s，n = 3)
受试细胞 样品名称
质量浓度
/mg·L － 1
细胞死亡率 /%
12 h 24 h 36 h 48 h
HeLa 白桦酯酸 1 6. 6 ± 3. 6 4. 2 ± 2. 8 15. 2 ± 2. 9 32. 6 ± 3. 6
10 5. 4 ± 2. 6 5. 4 ± 1. 7 26. 4 ± 4. 4 49. 3 ± 2. 8
50 10. 2 ± 2. 3 15. 8 ± 2. 6 34. 7 ± 3. 7 57. 1 ± 1. 8
100 16. 0 ± 1. 9 23. 2 ± 1. 3 52. 2 ± 2. 9 70. 8 ± 3. 6
500 21. 6 ± 1. 4 47. 0 ± 3. 1 75. 5 ± 3. 5 77. 9 ± 2. 9
5-FU 1 1. 2 ± 5. 1 1. 7 ± 3. 2 2. 2 ± 4. 1 1. 5 ± 3. 6
10 14. 1 ± 2. 3 16. 8 ± 2. 1 29. 5 ± 3. 6 32. 4 ± 3. 9
50 35. 7 ± 2. 9 43. 3 ± 3. 8 59. 2 ± 3. 4 62. 5 ± 2. 5
100 53. 6 ± 2. 4 77. 9 ± 2. 6 80. 2 ± 3. 3 91. 6 ± 3. 7
500 72. 4 ± 3. 7 74. 3 ± 2. 2 85. 8 ± 2. 3 95. 6 ± 2. 8
MGC 白桦酯酸 1 5. 6 ± 2. 3 12. 2 ± 2. 6 17. 4 ± 2. 1 20. 0 ± 1. 8
10 11. 4 ± 2. 0 20. 8 ± 2. 2 29. 7 ± 3. 2 33. 5 ± 3. 5
50 18. 2 ± 2. 5 23. 4 ± 2. 3 37. 1 ± 3. 4 50. 6 ± 2. 8
100 23. 5 ± 3. 3 28. 1 ± 2. 7 47. 6 ± 2. 3 58. 6 ± 2. 2
500 38. 5 ± 2. 0 45. 9 ± 2. 4 65. 9 ± 3. 1 81. 7 ± 2. 9
5-FU 1 0. 3 ± 1. 8 0. 5 ± 2. 7 1. 9 ± 1. 4 2. 6 ± 2. 5
10 13. 2 ± 2. 8 11. 7 ± 3. 4 22. 5 ± 2. 5 29. 4 ± 1. 6
50 37. 3 ± 2. 2 44. 1 ± 2. 5 57. 3 ± 2. 8 61. 8 ± 2. 4
100 44. 8 ± 2. 6 57. 3 ± 1. 7 71. 4 ± 2. 3 79. 2 ± 1. 9
500 73. 0 ± 1. 1 79. 8 ± 2. 5 86. 1 ± 2. 0 88. 5 ± 1. 8
MCF-7 白桦酯酸 1 － 11. 1 ± 2. 4 26. 1 ± 3. 1 24. 3 ± 2. 4
10 － 29. 3 ± 2. 6 31. 2 ± 2. 5 32. 4 ± 2. 7
100 － 43. 2 ± 2. 0 37. 1 ± 2. 3 74. 1 ± 2. 6
5-FU 1 － 1. 1 ± 3. 2 2. 3 ± 3. 9 6. 1 ± 1. 9
10 － 11. 5 ± 2. 8 29. 4 ± 2. 2 32. 9 ± 2. 3
100 － 62. 4 ± 2. 7 77. 3 ± 1. 7 83. 7 ± 1. 8
ZR 白桦酯酸 1 － 29. 3 ± 2. 6 38. 1 ± 2. 4 35. 1 ± 1. 9
10 － 32. 0 ± 3. 1 40. 2 ± 2. 7 42. 2 ± 2. 0
100 － 36. 1 ± 2. 4 44. 0 ± 2. 6 48. 3 ± 2. 5
5-FU 1 － 1. 4 ± 2. 6 1. 8 ± 3. 3 2. 1 ± 2. 6
10 － 10. 7 ± 2. 5 18. 1 ± 1. 6 26. 3 ± 3. 2
100 － 47. 2 ± 2. 0 58. 0 ± 2. 4 73. 1 ± 2. 9
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2012 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 9
May，2012
3. 3 对人胃癌细胞 MGC 的生长抑制作用 实验发
现，受试样品能够较好的抑制 MGC 细胞的增殖，并
呈较好的量效关系，在受试样品培养 48 h，质量浓度
为 500 mg·L － 1时，抑瘤率为 81. 7%，与阳性对照 5-
FU 抑瘤作用基本相当;细胞死亡率与质量浓度关系
见表 1。
3. 4 对人乳腺癌细胞 MCF-7 和人乳腺导管癌细
ZR 的生长抑制作用 实验结果显示，受试样品对于
人乳腺癌细胞 MCF-7 有很好的杀伤作用，其中 100
μg·mL － 1 在作用 48 h 时，细胞死亡率可以达到
74. 1%，而对人乳腺导管癌细胞 ZR 抑制作用不强。
细胞死亡率与浓度关系见表 1。
4 讨论
本实验采用了硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20
凝胶柱色谱法及半制备高效液相色谱法，从乌骨藤
中分离得到的白桦酯酸，其为五环三萜类化合物，并
通过 IR，1H-NMR，13 C-NMR 等方法进行了结构
确证。
通过对肿瘤细胞的体外活性研究，采用结晶紫
法，证实白桦酯酸对人宫颈癌 HeLa 细胞、人胃癌
MGC 细胞均具有明显的抑制作用，在受试样品培养
48 h 后，质量浓度为 500 μg·mL － 1时，与阳性对照 5-
FU 的生长抑制作用基本相当，且细胞死亡率与浓度
呈明显的量效关系。同时白桦酯酸对人乳腺癌细胞
MCF-7 也显示出明显的细胞生长抑制作用，而对人
乳腺导管癌细胞 ZR 抑制作用不强。
文献报道乌骨藤药材中的活性成分以 C21甾体
皂苷类成分为主，本实验从乌骨藤提取分离得到的
白桦酯酸为五环三萜类成分，通过上述体外抗肿瘤
活性研究证实，乌骨藤的抗肿瘤的活性成分不单纯
为 C21甾体皂苷类成分，其含有的五环三萜类化学成
分也可能是其活性成分之一。
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［责任编辑 聂淑琴］
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倪冲，等:乌骨藤中白桦酯酸的提取分离及抗肿瘤活性