全 文 ：苯酚－硫酸法测定维吾尔药核桃分心木多糖的含量
王　艳１，茹仙古丽·哈斯木２，韩艳春１，阿孜古丽·伊明１，阿依吐伦·斯马义１＊
（１．新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐８３００１１；２．乌鲁木齐市中医院，新疆 乌鲁木齐８３００００）
摘　要：目的：建立维吾尔药核桃分心木多糖的含量测定方法。方法：以精制后的核桃分心木多糖为研
究对象，通过单因素实验，对苯酚－硫酸法测定核桃分心木精制多糖含量的显色条件进行优选，并对该
方法进行方法学考察；在最佳显色条件和测定方法下测定分心木中多糖的含量。结果：在５．０～１７．５
μｇ／ｍＬ范围内，葡萄糖质量浓度与吸光度具有良好的线性关系。其平均回收率为１０６．５５％，相对标准
偏差（ＲＳＤ）值为５．１８％。用苯酚－硫酸法在最佳显色条件下测得的核桃分心木多糖含量为５．４％。结
论：该测定方法简便灵敏、准确性高、稳定性好、测定结果可靠，可用于核桃分心木的质量控制。
关键词：核桃分心木；苯酚－硫酸法；多糖；含量测定
中图分类号：Ｒ２８４．２　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３－２１９７（２０１２）０２－００３５－０３
收稿日期：２０１１－１１－１６
作者简介：王艳（１９８０－），女，硕士，新疆医科大学药学院讲师，研究方向为新疆地方药用植物。
通讯作者：阿依吐伦·斯马义（１９５８－），女，新疆医科大学药学院教授，硕士生导师，研究方向为药物分析和天然药物化学。
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｕｙｇｕｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　Ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　Ｆｒｕｃｔｕｓ
ｂｙ　Ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｍｅｔｈｏｄ
Ｗａｎｇ　Ｙａｎ１，Ｒｏｘａｎｇｕｌ　Ｋａｓｉｍ２，Ｈａｎ　Ｙａｎｃｈｕｎ１　Ａｚｉｇｕｌｉ　１，Ａｙｔｕｌｕｎ　Ｓｉｍａｙｉｌ　１﹡
（Ｐｈａｒｍａｃｙ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００１１，Ｃｈｉｎａ；
Ｕｒｕｍｑｉ　ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｕｙｇｕｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　ｆｒｕｃｔｕｓ　ｂｙ　ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ａｃｉｄ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：１．Ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔ　ｔｈｅ　ｒｅｆｉｎｅｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｏｆ　ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　ｆｒｕｃｔｕｓ　ａｓ　ａ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｂｊｅｃｔ，ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏ－
ｍｅｒｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｂｙ　ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．２．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ａｃｉｄ
ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍｄｉａｐｈｒａｇｍａ　ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　ｆｒｕｃｔｕｓ　ｗａｓ　ａｓｓａｙｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｐｏｌｙ－
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ’ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　５．０～１７．５μｇ／ｍＬ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒ　ｗａｓ１０６．５５％，ＲＳＤ　ｗａｓ　５．１８％．Ｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｉｎ　ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　ｆｒｕｃｔｕｓ　ｗａｓ　５．４％，ａｓｓａｙｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏｎ－
ｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｈｉｃｈ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｓｉｍｐｌｅ，ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ；ａｎｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ
ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｕｙｇｕｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　ｆｒｕｃｔｕｓ．
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；Ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｍｅｔｈｏｄ；Ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　Ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　Ｆｒｕｃｔｕｓ
　　核桃分心木（ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　ｆｒｕｃｔｕｓ，简称分心
木），别名胡桃衣、胡桃夹、胡桃隔，是胡桃科核桃属植物核
桃的果核内木质隔膜，呈薄片状，多弯曲，体轻质脆，易折
断［１］。分心木味苦、涩，性平；归脾、肾经。维吾尔医常用分
心木来治疗肾虚遗精等疾病［２－４］。多糖为分心木主要有效成
分之一。本研究采用苯酚－硫酸法对分心木提取液中的总
多糖进行含量测定，为其质量标准的研究与指标的制定提
供实验依据，并为核桃分心木多糖的进一步研究奠定基础。
１　材料、试剂和仪器
１．１　材料和试剂
核桃分心木（ｄｉａｐｈｒａｇｍａ　ｊｕｇｌａｎｄｉｓ　ｆｒｕｃｔｕｓ）采自新疆
和田地区，经新疆医科大学药学院天然药物化学教研室帕
丽达·阿布利孜教授鉴定为胡桃科核桃属植物核桃的果核
内木质隔膜。无水乙醇、正丁醇、氯仿、石油醚、９５％乙醇、
丙酮、乙醚（天津市富宇精细化工有限公司，均为分析纯），
浓硫酸、重蒸苯酚（北京北细精细化学品有限责任公司，分
析纯），葡萄糖（天津市化学试剂三厂，分析纯）；透析袋
（ＭＷＣＯ：５００）（上海绿岛科技发展有限公司）等。
１．２　仪器与设备
ＵＶ－２５５０紫外光谱仪（岛津）、ＥＹＥＬＡ　ＳＢ－１０００型旋转
蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、ＡＢ１０４－Ｎ型多功能电子
天平（Ｔｏｌｅｄｏ　Ｉｎｓｔｒ．Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｌｔｄ．）、ＳＫ２５１０ＨＰ超声清洗
仪（上海科导超声清洗仪有限公司）、Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｐｉｒａｎｉ　１００１
冷冻干燥器（Ｕ．Ｋ．）、ＤＨＧ－９０５３Ａ型电热恒温鼓风干燥箱
（上海精宏实验设备有限公司）等。
—５３—
２　方法与结果
２．１　核桃分心木粗多糖的制备
核桃分心木粉碎后，过１００目筛，得核桃分心木粉末。
称取该粉末２０．０ｇ，用蒸馏水煎煮３次，分别为２ｈ、２ｈ、１．５ｈ，
合并煎煮液并适当浓缩，先后用石油醚、９５％乙醇萃取脱
脂，余液浓缩至一定体积。采用Ｓｅｖａｇｅ法除蛋白，透析袋透
析２４ｈ，然后将透析液按体积比１∶４加入体积分数为９５％
的乙醇（使醇终浓度在７５％～８０％），置于冰箱中醇沉过夜，
离心分离，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤１次，
置于Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｐｉｒａｎｉ　１００１冷冻干燥器中干燥，即得核桃分
心木精制多糖。
２．２　核桃分心木多糖样品溶液及葡萄糖标准品溶液的
配制
　　精密称取干燥至恒重的核桃分心木１５．８ｍｇ，以适量蒸
馏水溶解，并定容至１００ｍＬ，配制成浓度为０．１５８ｍｇ／ｍＬ的
分心木多糖样品溶液备用。
精密称取干燥至恒重的葡萄糖１００ｍｇ（１０５℃），置于
１００ｍＬ的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，配制成浓
度为１ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖标准品溶液。
２．３　不同浓度苯酚溶液的配制
称取苯酚１００ｇ，加铝粉０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸
馏，收集１８２℃馏分。分别称取该馏分３、４、５、６、７、８ｇ，置于
１００ｍＬ的容量瓶中，并加新鲜蒸馏水稀释至刻度，摇匀，滤
过至棕色瓶中，置冰箱中备用。
２．４　核桃分心木多糖的含量测定
２．４．１　显色及测定条件的选择
（１）最大吸收波长：分别吸取分心木多糖样品溶液
２．０ｍＬ、葡萄糖标准品溶液０．０５ｍＬ，置于２５ｍＬ的比色管
中，葡萄糖标准品溶液以蒸馏水补充体积至２．０ｍＬ，然后分
别加入５％的苯酚溶液１．０ｍＬ，摇匀，再滴加浓硫酸５．０ｍＬ，
迅速振荡摇匀，室温下显色３０ｍｉｎ，冰水混合物迅速冷却。
以２．０ｍＬ蒸馏水同上操作作为空白，采用ＵＶ－２５５０型可见
－紫外分光光度计进行扫描，扫描波长为４００～７００ｎｍ，扫
描结果如图１所示。根据图１，核桃分心木多糖溶液、葡萄
糖标准品溶液均在（４８６±２）ｎｍ处有最大吸收峰，且吸收峰
峰形相似，因此本实验确定４８６ｎｍ为最大吸收波长。
图１　核桃分心木多糖溶液、葡萄糖标准品溶液的扫描
（２）显色温度的选择：吸取分心木多糖样品溶液２．０
ｍＬ，分别置于不同编号的２５ｍＬ具塞试管中，加入５％的苯
酚溶液１．０ｍＬ，摇匀，再依次加入浓硫酸５．０ｍＬ，迅速振荡
摇匀，分别于室温、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃下显
色３０ｍｉｎ，冰水混合物迅速冷却。以２．０ｍＬ蒸馏水同上操
作为空白，在最大波长４８６ｎｍ处，测定各分心木多糖样品溶
液的吸光值，结果见图２。由图２可知，分心木多糖溶液在
不同温度条件下放置显色，其吸光度值在１００℃时最大。故
本实验采用１００℃作为显色温度。
图２　显色温度对吸光度的影响
（３）显色时间的选择：其他条件不变，按照“２．４．１（１）”
和“２．４．２（２）”确定的最大吸收波长及最佳显色温度，只改
变显色时间（１０、２０、３０、４０、５０、６０ｍｉｎ），分别测定其吸光值，
结果见图３。由图３可知，其吸光度值在３０ｍｉｎ后趋于稳
定。因此，显色时间采用３０ｍｉｎ为宜，各样品溶液应在
６０ｍｉｎ内测定完成。
图３　显色时间对吸光度的影响
（４）浓硫酸用量的选择：其他条件不变，按照“２．４．１
（１）”、“２．４．２（２）”及“２．４．３（３）”确定的最佳显色及测定条
件，只改变浓硫酸的用量（４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．
０ｍＬ），分别测定其吸光值，结果见图４。由图４可知，浓硫
酸加入量在５．０ｍＬ时水解最完全。
图４　不同硫酸用量对吸光度的影响
（５）苯酚浓度的选择：其他条件不变，按照“２．４．１（１）”、
“２．４．２（２）”、“２．４．３（３）”及“２．４．３（４）”确定的最佳显色及测
定条件，只改变苯酚溶液的质量分数（３％、４％、５％、６％、
７％、８％），分别测定其吸光值，结果见图５。由图５可知，使
用３％苯酚时，测得多糖溶液的吸光度值最大，故本实验中
采用质量分数为３％的苯酚溶液。
图５　不同苯酚浓度对吸光度的影响
综上所述，确定苯酚－硫酸法测定核桃分心木多糖的
—６３—
最佳条件为：取分心木多糖溶液２．０ｍＬ，加入３％的苯酚１．
０ｍＬ，浓硫酸 ５．０ｍＬ，迅速振荡摇匀，于 １００℃ 下显色
３０ｍｉｎ，在波长４８６ｎｍ处测定其吸光值。
２．４．２　标准曲线的制作
分别吸取该葡萄糖标准溶液０．４、０．６、０．８、１．０、１．２和
１．４ｍＬ，均用蒸馏水补充至２．０ｍＬ。按照“２．４．１”确定的最
佳显色及测定条件测定各吸光度值，以２．０ｍＬ蒸馏水按同
样显色操作为空白。以葡萄糖的浓度为横坐标，吸光值为
纵坐标，绘制葡萄糖的标准曲线，回归方程为Ａ＝－０．０００１
＋０．０３８９Ｃ，ｒ＝０．９９９８，样品检测量在５．０～１７．５μｇ／ｍＬ范
围内与吸光度线性关系良好。
２．４．３　换算因子的确定
精密称取干燥至恒重的分心木多糖１．５ｍｇ，置于１０ｍＬ
容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。分别取该样品液６
份，每份０．５ｍＬ 于２５ｍＬ 比色管中，以蒸馏水补充至
２．０ｍＬ，按照“２．４．１”确定的最佳显色条件测定各吸光值，并
根据标准曲线计算出供试液中的葡萄糖含量，按下式计算
出换算因子：ｆ＝ｍ／ＣＤ。其中，ｍ为称取的分心木多糖质量
（ｍｇ）；Ｃ为多糖液中葡萄糖的质量浓度（ｍｇ／ｍＬ）；Ｄ为多糖
的稀释倍数。测得ｆ＝１．７１，ＲＳＤ＝１．０７％（ｎ＝６）。
２．４．４　多糖含量的测定
取多糖样品溶液２．０ｍＬ，按照“２．４．１”确定的最佳显色
条件测定其吸光值，平行测定３次。根据标准曲线计算出
多糖液中葡萄糖的质量分数，并按下式计算样品中多糖的
质量分数：多糖含量（％ ）＝ （Ｃ×Ｄ×ｆ／Ｗ）×１００％。式中
Ｃ为葡萄糖的浓度，Ｄ为供试液的稀释因素，ｆ为换算因子，
Ｗ为核桃分心木的质量。测得核桃分心木中多糖的含量为
５．４０％（ｎ＝３）。
２．４．５　多糖含量测定方法验证
（１）精密度实验：取分心木多糖样品液各２．０ｍＬ，按照
“２．４．１”确定的最佳显色条件测定其吸光值，１天内测定６
次。考精密度，其ＲＳＤ（ｎ＝６）为０．１１４７％。
（２）稳定性实验：取分心木多糖样品液２．０ｍＬ，按照
“２．４．１”确定的最佳显色条件显色后，测定其吸光值在时间
１０、２０、３０、４０、５０、６０ｍｉｎ后的变化。其 ＲＳＤ（ｎ＝６）为
０．２８１３％。
（３）重现性实验：平行取分心木多糖样品溶液２．０ｍＬ　６
份，按照“２．４．１”确定的最佳显色条件显色，测定其吸光值，
其ＲＳＤ（ｎ＝６）为．００８５％。
（４）加样回收率实验：分别取分心木多糖样品溶液
（１５．８ｍｇ／ｍＬ）１．０ｍＬ，以蒸馏水分别稀释至２．０、３．０、４．０、
５．０、６．０、７．０ｍＬ，吸取稀释后的多糖溶液各１．０ｍＬ，再分别
加入０．０５ｍＬ的标准葡萄糖溶液，然后以蒸馏水补充至
２．０ｍＬ，按照“２．４．１”确定的最佳显色条件进行显色并测定
其吸光值，结果见表２。
表１　加样回收率实验
编号
与多糖量
相当的葡
萄糖量（μｇ）
加入葡萄
糖量（μｇ）
实验测得
量（μｇ）
回收率
（％）
平均回收
率（％）
ＲＳＤ
（％）
１　 ９．９０１　０　 ５０．０００　０　６３．５８２　０　１０９．２８８　０
２　 ６．６００　７　 ５０．０００　０　６３．２１６　０　１１３．２３０　６
３　 ４．９５０　５　 ５０．０００　０　６０．３７９　２　１１０．８５７　４
１０６．５５　 ５．１８
４　 ３．９６０　４　 ５０．０００　０　５５．８５７　６　１０３．７９４　４
５　 ３．３００　３　 ５０．０００　０　５５．１５８　４　１０３．７１６　２
６　 ２．８２８　７　 ５０．０００　０　５２．０３３　６　９８．４０９　８
　　从“２．４．５”项下各实验结果可以看出，多糖样品溶液在
显色后１ｈ内测定结果稳定，测定结果的重现性好（ＲＳＤ＝
１．０％，＜３％），精密度高（ＲＳＤ＝０．１％，＜５％），回收率较高
（平均回收率为１０６．５５％，ＲＳＤ为５．１８％）。
３　结论
实验表明，苯酚－浓硫酸法测定分心木中多糖的含量
时，显色反应过程中需加热。因为向分心木多糖溶液中加入
浓硫酸的过程虽是放热反应，但不能满足显色反应的需要。
采用苯酚－浓硫酸法进行多糖含量测定时，常使用葡萄
糖［５，６］、阿拉伯糖［７］、葡聚糖［８，９］等作为标准品。其中，葡萄糖最
为常用。但是天然药物多糖的单糖组成较为复杂，且不同单糖
的标准曲线各有差异［６］。因此，本实验采用核桃分心木精制多
糖进行各项实验，尤其是以精制多糖计算换算因子，一定程度
上避免了用葡萄糖作标准品而引起的系统误差。
多糖含量的测定方法主要有苯酚－浓硫酸法［１０，１１］、蒽
酮－浓硫酸法［１２］、咔唑－硫酸法、３，５－二硝基水杨酸（简称
ＤＮＳ）法［１３］、Ｆｅｈｌｉｎｇ还原滴定法、高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）、
气相色谱法（ＧＣ）、薄层扫描法（ＴＬＣＳ）、高效毛细管电泳法
（ＨＰＣＥ）［１４］等。本研究采用苯酚－浓硫酸比色法测定核桃
分心木中多糖的含量，多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，并
迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在
波长４８６ｎｍ处有特征吸收。该方法的结果具有准确可靠、
重现性好、简便快速等优点，可作为维吾尔药核桃分心木中
多糖含量测定的参考依据。
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（责任编辑：陈涌涛）
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