全 文 ：148
黑胡椒提取物
对枯草芽孢杆菌生理代谢的影响
邹 兰1，胡月英2，陈文学1，*
(1.海南大学食品学院，海南海口 570228;
2.海南大学材化学院，海南海口 570228)
收稿日期:2015－03－27
作者简介:邹兰(1992-) ，女，硕士研究生，研究方向:食品科学，E－mail:18289765565@ 163.com。
* 通讯作者:陈文学(1968－) ，男，硕士，副教授，研究方向:热带农产品贮藏与加工研究，E－mail:hnchwx@ 163.com。
基金项目:海南大学博士启动基金(kyqd1224)。
摘 要:本文以枯草芽孢杆菌作为供试菌，分别研究了经 4 个不同有机相的胡椒提取物处理后的枯草芽孢杆菌细胞内
的丙酮酸含量以及转氨酶活性的变化，探讨了胡椒提取物的抑菌机理。结果表明，处理后的枯草芽孢杆菌菌体内的丙
酮酸出现积累，其中以乙酸乙酯相的丙酮酸浓度最高，为 0.527 g /L;此外，胞外谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)
活力增强，最高酶活力分别为 28.62 Kar U 和 49.29 Kar U。这说明了胡椒提取物能破坏枯草芽孢杆菌的正常生理代
谢，从而有效地抑制枯草芽孢杆菌的生长。
关键词:胡椒提取物，抑菌机理，枯草芽孢杆菌
Effect of pepper extract on the
physiological metabolism of Bacillus subtilis
ZOU Lan1，HU Yue－ying2，CHEN Wen－xue1，*
(1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China;
2.Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570228，China)
Abstract:Considering that black pepper extracts inhibit food spoilage and food pathogenic bacteria，the
antimicrobial mechanism of four different organic phases of pepper extract against Bacillus subtilis were explored.
The antibacterial mechanism of pepper extract was elucidated by analyzing pyruvic acid content and
transaminases activities of the target bacteria. The extract significantly increased pyruvic acid concentration in
bacterial solutions，especially with the treatment of ethyl phase，the concentration of pyruvic acid were up to
0.527 g /L. And the activity levels of ALT and AST in the cultures of bacterial cell were increased severely with
adding pepper extracts，and the highest enzyme activity was 28.62 and 49.29 Kar U，respectively. The results
indicated that pepper extracts inhibited the metabolic and energy synthesis of Bacillus subtilis，which consequently
affected the growth and metabolic of Bacillus subtilis.
Key words:pepper extract;antibacterial mechanism;Bacillus subtilis
中图分类号:TS201.1 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2015)23－0148－04
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 23． 022
长久以来，延长食品的货架期，保证食品的安全
以及品质一直都是食品企业以及政府部门关心的问
题。食品货架期是指在标签上规定的条件下，保持
食品质量(品质)的期限。影响食品货架期的因素
有:食物本身、环境因素、食品的包装质量［1］。为防止
食品的腐败、变质，延长食品货架期，保持食品新鲜
度，需要在食品中添加防腐剂。常见防腐剂有三种
类型:化学防腐剂、天然防腐剂和益生菌［2］。
近几年，人们对中草药和植物精油的抗菌、抗病
毒和抗氧化特性的研究越来越感兴趣。有些植物精
油还被用做食品防腐剂［3］。随着人们对天然成分和
无化学防腐剂食物的需求增大，天然的防腐剂将会
越来越受到人们的青睐。如今，对药用植物和香辛
料的抗微生物活性的研究也已经成为一种趋势［4］。
胡椒是一种药食同源的香辛料，在我国的广西、云
南、台湾、海南等地有广泛的种植。目前，其在海南
的种植面积约 13.3 万 hm2，产量高达 1.2 万 t［5］。胡
椒可加入药材中使用，具有镇静、止痛、消炎等功能;
此外，胡椒还有抗癌、抗惊厥、杀虫、消炎解热等活
性［6－8］。有研究表明［9－11］，胡椒的醇提取物以及胡椒
149
挥发油对常见的食品腐败菌有较强的抑制作用。杨
敏［12］等人研究了黑胡椒 5 种不同有机相提取物及两
种常用防腐剂对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡
萄球菌、酵母菌、黑曲霉的最小抑菌浓度(MIC)，胡
椒提取物对这 5 个菌都有较强的抑菌活性，但并未
对某一特定菌的生理代谢进行研究。本文通过对枯
草芽孢杆菌丙酮酸含量及转氨酶活性的测定，研究
了胡椒提取物对菌体生长代谢的影响，为进一步揭
示胡椒提取物的抑菌机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑胡椒购自南国超市;枯草芽孢杆菌菌种 来
自于海南大学食品学院微生物实验室;乙醇、石油
醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等试剂 均购自天津市
富宇精细化工有限公司，均为分析纯;牛肉膏、琼脂
均购自北京索莱宝科技有限公司;蛋白胨 购自
广东环凯微生物科技有限公司;丙酮酸标准样品和
2，4－二硝基苯肼(DNP) 购自阿拉丁公司;α－酮戊
二酸、L－天冬氨酸、L－丙氨酸 均购自于上海源叶生
物科技有限公司。
FW177 型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有
限公司;WF－300EH 型超声清洗机 宁波海曙五方
超声设备有限公司;ＲE52CS型旋转蒸发仪 上海亚
荣生化仪器厂;ZHWY－211B型恒温培养振荡箱 上
海智诚分析仪器制造有限公司;SW－CJ－1FD 型洁净
工作台 苏州佳宝净化工程有限公司;722 型可见分
光光度计 上海欣茂仪器有限公司;冷冻离心
机 美国 Thermo Fisher Scientific公司。
1.2 实验方法
1.2.1 胡椒抑菌物质的提取 根据胡椒抑菌活性物
质提取的最佳条件［13］，利用体积分数为 80%的乙醇
溶液浸泡胡椒粉末 480 min，经抽滤及真空减压浓缩
得到膏状胡椒提取物(胡椒油树脂) ，置于 4 ℃冰箱
保存备用。采用液－液萃取法对胡椒粗提物进行分
离纯化，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇作
为萃取剂，收集萃取液并经真空浓缩蒸发依次得到
石油醚相提取物、氯仿相提取物、乙酸乙酯相提取
物、正丁醇相提取物。
1.2.2 菌种的活化及培养 将枯草芽孢杆菌在牛肉
膏蛋白胨培养基中活化后保存备用。用 0.9% 的
NaCl来制备含菌量在 106～107 cfu /mL范围内的菌体
悬浮液。将 1 mL 的菌悬液加入到 49 mL 的牛肉膏
蛋白胨液体培养基中。实验组中加入终浓度为 MIC
的用 80%的酒精溶解后的胡椒各个有机相提取物，
对照组中加入相同体积的乙醇。各组均在转速为
130 r /min的 37 ℃的摇床培养箱中培养 24 h。
1.2.3 丙酮酸含量的测定
1.2.3.1 丙酮酸标准曲线的绘制 丙酮酸含量的测
定可采用苯肼［14］，首先准确称取 0.4 g 丙酮酸，充分
溶解于去离子水中，定容至 200 mL，配制成 2 g /L 的
标准丙酮酸溶液，再分别稀释成不同浓度的丙酮酸
溶液。试管中依次加入 1 mL 2，4 －二硝基苯肼
(DNP)和 0.1 mL不同浓度的丙酮酸标准溶液，37 ℃
水浴 20 min，再加入 10 mL NaOH(0.4 mol /L)，摇匀，
测其在 520 nm下的吸光度值。
1.2.3.2 处理菌液丙酮酸含量的测定 参考文献
［15］，实验组和对照组均在 1、4、7、10、13、24 h 分别
取样后，于转速为 6000 r /min 的条件下离心 15 min，
取上清液 1 mL并稍微稀释，使浓度处在标准曲线的
范围内。将 1 mL DNP 试剂和 0.1 mL 稀释样品(加
入 0.3 mL 8%三氯乙酸)加入到试管中，37 ℃水浴反
应 10 min，再加入 10 mL的 0.4 mol /L NaOH溶液，摇
匀。以不加胡椒提取物的培养物为空白对照，测各
组在 520 nm 处吸光值，根据标准曲线即可计算得样
品中的丙酮酸浓度。
1.2.4 转氨酶活性的测定
1.2.4.1 转氨酶标准曲线的绘制 转氨酶活性的测
定采用赖氏法［16］。首先配制 0.1 mol /L 磷酸盐溶液
(pH7.4)、2 mmol /L的丙酮酸标准溶液、1 mmol /L 的
2，4－二硝基苯肼(DNP)以及 0.5 mol /L 的 NaOH，然
后再配制谷丙转氨酶(ALT)底物液(包含 0.2 mol /L
的 L－丙氨酸，2.0 mmol /L的 α－酮戊二酸和 0.1 mol /L
磷酸盐溶液(pH7.4))和谷草转氨酶(AST)底物液
(包含 0.2 mol /L 的 L－天门冬氨酸，2.0 mmol /L 的
α－酮戊二酸和 0.1 mol /L 磷酸盐溶液(pH7.4) )。
ALT 标准曲线测定时，分别在试管中加入磷酸缓冲
液、丙酮酸标准溶液和 ALT底物液，混匀，在 37 ℃下
水浴加热 30 min;AST 标准曲线测定时，分别在试管
中加入磷酸缓冲液、丙酮酸标准溶液和 AST底物液，
混匀，在 37 ℃下水浴加热 60 min;然后，各管均加入
0.5 mL的 DNP，混匀，37 ℃下水浴加热 20 min;再加
入 5 mL 0.5 mol /L的 NaOH溶液，混匀，37 ℃下水浴
加热 10 min，取出，冷却至室温，在波长为 505 nm 下
测定其吸光光度值，以吸光光度值为横坐标，对应的
卡门氏单位(Kar U)为纵坐标，绘制出 ALT 和 AST
的标准曲线。
1.2.4.2 处理菌液转氨酶活性的测定 参考文献
［17］，加药组与对照组分别在 0、4、8、12、24 h 取样，
于 4 ℃下离心(10000 r /min，10 min)后，取上清液保
存于冰水中。将 0.5 mL 的 ALT 底物液和 AST 底物
液分别转移到试管中并在 37 ℃水浴中加热 5 min。
取 0.1 mL上清液于上述试管中并快速混匀后置于水
浴(37 ℃)中加热(ALT，30 min;AST，60 min)。再取
0.5 mL DNP加入到各个试管中，混匀并于 37 ℃水浴
中反应 20 min，在室温下冷却 10 min。再加入 5 mL
0.5 mol /L 的氢氧化钠，混匀后于 37 ℃水浴中反应
10 min，然后在 505 nm 下测其吸光度。通过与标准
曲线比对计算出 AST和 ALT的活性。
2 结果与分析
2.1 胡椒提取物对菌液丙酮酸含量的影响
丙酮酸是连接糖酵解途径、三羧酸循环和氧化
磷酸途径的重要的关键中间代谢产物，如果丙酮酸
积累，会对细胞的产能和物质代谢产生影响，扰乱细
菌正常的代谢过程［18－19］。图 1 为丙酮酸的标准曲线，
图 2 是由与标准曲线比对得到的不同时间点取样后
相应样品的丙酮酸含量。枯草芽孢杆菌对照组的丙
150
酮酸含量随着时间的延长而降低，氯仿相萃取物组
的菌液丙酮酸含量在前 4 h内含量减少，之后呈逐渐
上升趋势。石油醚、正丁醇和乙酸乙酯萃取物组的
菌液丙酮酸含量随着时间的延长呈现明显的上升趋
势。其中以乙酸乙酯相的丙酮酸含量最高，在 24 h
时达到 0.527 g /L。结果表明:各实验组的丙酮酸含
量都呈现了不同程度的积累。
图 1 丙酮酸标准曲线
Fig.1 The pyruvate acid standard curve
图 2 胡椒提取物对枯草芽孢杆菌的丙酮酸浓度的影响
Fig.2 Effect of pepper extract on
B.subtilis pyruvate acid content
2.2 胡椒提取物对菌液转氨酶活性的影响
转氨酶［20］是一种胞内酶，它不仅能催化机体合
成非必需氨基酸，而且可以通过转氨基作用使大多
数氨基酸脱氨基。氨基酸的氧化分解途径虽然各不
相同，但是它们最后形成产物如丙酮酸、延胡索酸和
草酰乙酸等产物会进入三羧酸循环［21］。因此，如果
转氨酶泄漏，胞内转氨酶活性降低，必将导致转氨基
反应受阻，这将导致多肽及蛋白质的合成受到影响。
图 3 和图 5 分别是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶
(AST)的标准曲线。图 4 和图 6 是根据 ALT 和 AST
标准曲线比对后得到的枯草芽孢杆菌的酶活力。由
图 4 可知，枯草芽孢杆菌对照组的 ALT 活力显著低
于各实验组的 ALT 活力。在前 8 h，各个实验组的
ALT活力均呈上升趋势，随后下降，在 12～24 h内，除
了乙酸乙酯相菌液的 ALT 活力出现降低外，其余各
实验组的酶活力有都有所增加。氯仿相、石油醚相、
正丁醇相和乙酸乙酯相的最终 ALT酶活力高于对照
组，且经正丁醇相处理后细菌的酶活力最高，达到
28.62 Kar U。而图 6 显示了枯草芽孢杆菌经胡椒提
取物处理后各组在 24 h内 AST活力的变化曲线。由
图 6 知:实验组和对照组在前 4 h内 AST的活力均呈
上升趋势;在 4～8 h内，AST活力稍有降低，但经氯仿
相胡椒提取物处理的菌液在前 8 h一直呈上升趋势。
8 h后，对照组的 AST 酶活力降低，其余实验组的酶
活力上升，尽管氯仿相组的菌液 AST活力出现下降，
但其活性仍然高于对照组，且其最终 AST 酶活力出
现了上升趋势。这可能是因为细胞壁遭到破坏，并
且细胞膜的通透性增大，导致胞内酶外泄［22］。氯仿
相、石油醚相、正丁醇相和乙酸乙酯相的最终 AST 酶
活力分别达到了 41.68、39.20、34.92、49.29 Kar U，均
高于对照组的 22.63 Kar U，且经乙酸乙酯相处理后，
胞外 AST酶活力最强。
图 3 ALT标准曲线
Fig.3 The ALT standard curve
图 4 胡椒提取物对枯草芽孢杆菌 ALT活力的影响
Fig.4 Effect of pepper extract on B.subtilis ALT activity
图 5 AST标准曲线
Fig.5 The AST standard curve
3 结论与讨论
本实验通过考察枯草芽孢杆菌菌体内丙酮酸含
量、ALT和 AST活力的变化，研究了胡椒的不同提取
物对枯草芽孢杆菌生长代谢的影响。结果表明:经
胡椒提取物处理的菌液，其丙酮酸均出现不同程度
的积累，其中以乙酸乙酯相萃取物处理的菌液丙酮
酸含量最高;此外，胞外 ALT 和 AST 的活性增强，表
明胡椒提取物破坏了菌体细胞的细胞膜，增大了细
151
图 6 胡椒提取物对枯草芽孢杆菌 AST活力的影响
Fig.6 Effect of pepper extract on
B.subtilis AST activity
胞膜的通透性，导致酶的泄漏。同时，由于酶的泄
漏，导致胞内酶减少，活性降低，影响了细胞内多肽
和蛋白质正常的合成和分解代谢。由此，可推断其
抑菌机理是胡椒提取物影响了菌体的正常代谢途
径，导致供给细胞生长繁殖所需的能量和关键物质
不能及时合成，导致菌体衰亡。
参考文献
［1］Sadaka F，Nguimjeu C，Brachais C，et al.Withdrawn:Ｒeview
on antimicrobial packaging containing essential oils and their
active biomolecules［J］. Innovative Food Science ＆ Emerging
Technologies，2014，350－374.
［2］Han J H.Antimicrobial packaging systems［J］. Innovations in
food packaging，2005，1:80－107.
［3］Kapoor I，Singh B，Singh G. Essential oil and oleoresins of
Cinnamomum tamala(tejpat)as natural food preservatives for
pineapple fruit juice［J］ . Journal of food processing and
preservation，2008，32(5):719－728.
［4］Mulholland D A.The future of ethnopharmacology:A southern
African perspective［J］. Journal of ethnopharmacology，2005，100
(1) :124－126.
［5］范宇森 .胡椒高产栽培技术［J］.安徽农业科学，2013，41
(2):547－548.
［6］任杰，许园元，胡坤 .胡椒碱对人胃癌 SGC－7901 细胞抗肿
瘤活性的体外实验研究［J］.常州大学学报:自然科学版，
2014，26(4):49－52.
［7］李兴平，赵颖韬，邓薏，等 .胡椒及胡椒碱的解热作用研究
［J］.中药药理与临床，2013(3) :63－66.
［8］崔广智，金树梅 .胡椒碱抗抑郁作用研究［J］.辽宁中医药
大学学报，2010(7):42－43.
［9］徐燕，刘德清 .胡椒中天然防腐剂的提取方法及其抑菌作
用研究［J］.中国调味品，2007(7) :57－60.
［10］Chaudhry N M，Tariq P. Bactericidal activity of black
pepper，bay leaf，aniseed and coriander against oral isolates.［J］.
Pakistan journal of pharmaceutical sciences，2006，19 (3) :
214－218.
［11］Dorman H，Deans S G. Antimicrobial agents from plants:
antibacterial activity of plant volatile oils［J］. Journal of applied
microbiology，2000，88(2) :308－316.
［12］杨敏，袁佳依，陈文学 .胡椒提取物抑菌活性研究［J］.食
品工业科技，2013(4) :125－128.
［13］陈文学，胡月英，葛畅，等 .黑胡椒抑菌活性物质提取工
艺优化［J］.食品工业科技，2010，31(11) :279－282.
［14］范丽霞 .几株放线菌发酵液抑菌活性成分的研究［D］.西
安:西北农林科技大学，2013.
［15］王佶 .大肠杆菌积累丙酮酸的研究［D］.杭州:浙江大
学，2008.
［16］ Crowley L V. The Ｒeitman － Frankel colorimetric
transaminase procedure in suspected myocardial infarction［J］.
Clinical chemistry，1967，13(6):482－487.
［17］Yao X，Zhu X，Pan S，et al.Antimicrobial activity of nobiletin
and tangeretin against Pseudomonas［J］. Food Chemistry，2012，
132(4) :1883－1890.
［18］陈从珍 .枯茗酸对四种病害的药效及其对辣椒疫霉病菌
生长的影响［D］.西安:西北农林科技大学，2009.
［19］Spoel S H，Dong X. Making sense of hormone crosstalk
during plant immune responses［J］.Cell host ＆ microbe，2008，3
(6):348－351.
［20］Barreca D，Bellocco E，Laganà G，et al. Biochemical and
antimicrobial activity of phloretin and its glycosilated derivatives
present in apple and kumquat［J］. Food Chemistry，2014，160:
292－297.
［21］董晓燕 .生物化学［M］.第 1 版 .北京:高等教育出版社，
2010，426－427.
［22］Ma Y，Yang B，Guo T，et al. Antibacterial mechanism of
Cu2 +－ ZnO /cetylpyridinium－montmorillonite in vitro［J］.Applied
Clay Science，2010，50(3):
檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
348－353.
(上接第 147 页)
压力分别为 0.4 MPa 和 1.5 MPa、操作温度分别 30～
35 ℃和 40 ℃，通过实验，经过优化的膜组件相对其
他组产品得率高，并且纯化物中花青素含量也高，可
达 32.7 mg /g干粉重，为生产高纯度的玫瑰茄色素产
品提供了一个较好的方法。
参考文献
［1］郭宏，彭义交 .膜分离技术集成在玫瑰茄色素加工中的应
用［J］.食品科学，2011，32(14) :341－345.
［2］彭慧敏 .HPLC 法测定玫瑰花中原花青素 B2 的含量［J］.
山东中医药大学学报，2011，35(3) :180－181.
［3］张国铭，高虹 .DA－201 吸附树脂纯化分离玫瑰茄红色素
的研究［J］.广东化工，2007，34(2) :23－25.
［4］尹中平，洪艳平，徐明生 .大孔树脂吸附法粗提取玫瑰茄
红色素［J］.江西农业大学学报，2007，29(6) :1026－1030.
［5］许立松，马银海 .大孔树脂吸附法提取玫瑰茄红色素［J］.
食品科学，2009(12):120－122.
［6］Fuleki T，Francis FJ.Quantitative Method for Anthocyanins 2
Determination of Total Antocyanin and Degration Index for
Cranberry Juice［J］.Food Science，1968(33) :78－83.
［7］李升锋，徐玉娟，张友胜，等 .玫瑰茄花青素提取条件优化
研究［J］.广东农业科学，2006(11):83－88.
［8］吴淑梅，张津风，张林 .果胶质的快速测定［J］.食品研究与
开发，1984(3):26－27.
［9］余华 .玫瑰茄红色素的结构定性研究［J］.食品科技，2004
(7):55－57.
［10］李怀江，姜智瑞 .纳滤膜技术研究与应用探讨［J］.发酵科
技通讯，2007(10):36.