全 文 ：· 2356· China Pharmacy 2008 Vol.19 No.30 中国药房 2008年第 19卷第 30期
Δ广东省自然科学基金资助项目(5002841)
*硕士研究生。研究方向:中药质量控制。电话:020-39352136。
E-mail:panyzhu@hotmail.com
#通讯作者:教授。研究方向:中药质量控制。E-mail:fuhaiwu@
163.com
(致谢:感谢南京工业大学分析测试中心代测 GC-MS 。)
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(收稿日期:2007-09-10 修回日期:2008-01-06)
水线草 ,又名伞房花耳草 ,是茜草科植物伞房花耳草 Hed_
yotis corymbosa(L.)Lam.的干燥全草 ,在我国主要分布于南
方各省 , 产量较大 。其药材性状与同科同属植物白花蛇舌草
Oldenlandia d if f usa(Willd.)Roxb.相似 , 经调查及文献记
毛细管电泳高频电导法测定水线草中齐墩果酸和熊果酸的含量 Δ
朱培仪 1* , 宋粉云 1 # , 刘春霞 2(1.广东药学院 , 广州市 510224;2.中山大学附属第二医院药学部 , 广州市
510120)
中图分类号 R284.1;R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2008)30-2356-03
摘 要 目的:建立水线草中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法 。方法:采用毛细管区带电泳 、高频电导检测:未涂层弹性融硅石英
毛细管柱(55 cm ×75μm ID),有效长度 50 cm ;以 1.2 mmol ·L -1三乙胺-HCl(pH 10.0)、0.24 mmol ·L -1β -环糊精为运行缓
冲液 ,分离电压 12.5 kV ,重力进样 10 s(高度 20 cm)。布洛芬为内标 。结果:齐墩果酸 、熊果酸的检测浓度分别在 3.9 ～ 39.0μg ·
mL -1(r =0.999 1)、 20.0 ～ 140.0 μg ·mL -1(r =0.999 0)范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系;平均回收率分别为
96.5%、96.0%, RSD 分别为 1.98%、1.09%(n =6)。结论:本方法简便 、准确 、快速 、重现性好 ,可用于水线草的质量控制 。
关键词 毛细管电泳;高频电导检测;水线草;齐墩果酸;熊果酸;含量测定
Determination of Oleanol ic Acid and Ursolic Acid in Hedyotis corymbosa by Capillary Zone Electrophoresis
with High Frequency Conductivi ty Detection
ZHU Pei-yi ,SONG Fen-yun(Guangdong Pharmaceutical University ,Guangzhou 510224 ,China)
LIU Chun-xia(Dept.of Pharmacy , The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University , Guang zhou
510120 ,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To est ablish a method fo r the dete rmination o f Oleanolic acid and U rso lic acid isomers in Hedy-
otis corymbosa.M ETHODS:C apillary zone electrophoresis w ith high f requency conductivity detection was adopted.The sep-
ara tion of sam ple w as perfo rmed on an uncoa ted fused silica capillary(55 cm×75μm ID)at an effective leng th o f 50 cm.1.2
mmol·L -1 T rie thylamine(TEA)-HCl(pH 10.0)buf fer containing 0.24 mmol ·L -1 β -cyclodex t rin was selec ted for the run-
ning buffer solution.T he vo ltage applied w as 12.5 kV and the sample w as injec ted by grav ity fo r 10 s at a height o f 20 cm.
Brufen w as used as internal standard.RESU LTS:The linear ranges for Oleano lic acid and Urso lic acid were 3.9 ～ 39.0 μg ·
mL -1 (r =0.999 1)and 20.0 ～ 140.0μg ·mL -1(r =0.999 0), respective ly , and their ave rage recovery ra tes w ere 96.5%and
96.0% respectively and RSD w ere 1.98%and 1.09%, respectively(n =6).CONCLUSION :I t w as proved that the method w as
simple , accura te , rapid and reproducible , and applicable f or the quality control o f Hedyotis corymbosa.
KEY WORDS Capillary zone e lect rophoresis;High frequency conduc tiv ity detection;Hedyotis corym bosa ;Oleanolic acid;
Urso lic acid;Content dete rmination
中国药房 2008年第 19卷第 30期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.30 · 2357·
载 , 全国几乎多数地区使用的白花蛇舌草实为伞房花耳草 , 或
者二者混在一起使用 [1 ,2 ]。齐墩果酸(OA)和熊果酸(UA)是水
线草中已知的主要有效成分 ,其中 OA 具有较强的抑菌 、强心 、
利尿和保肝作用 , 是得到肯定的免疫增强剂 [3 ] ;UA 除具有广
泛的生物学效应 、体外抗菌活性及对中枢神经有明显的安定与
降温作用外 ,对多种致癌 、促癌物亦有抵抗作用 ,对多种恶性肿
瘤细胞有抑制生长作用 [4 ] 。笔者采用毛细管区带电泳 、高频电
导检测的方法 , 成功地分离了 OA 和 UA , 并对不同产地水线
草药材中 OA 和 UA 的含量进行测定 ,旨在为药材的质量控制
提供简便 、准确 、快速的方法 。
1 仪器与试药
CES2003型毛细管电泳仪 , 包括高压电源、高频电导检测
器及毛细管电泳数据工作站(中山大学化学与化学工程学院研
制);Model 828型 pH 计(美国 Orion公司);DL-360型超声
波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂)。水线草样品分别购自广
东增城 、广西桂林 、海南海口 ,均经广东药学院刘基柱讲师鉴定
为真品 , 将其粉碎 , 于 60 ℃下干燥 4 h , 置于干燥器内备用;
OA 、UA 、布洛芬对照品(中国药品生物制品检定所 , 批号分别
为 110709-200505 、 110742-200506 、100179-200303);β -
环糊精(中国医药集团上海化学试剂公司);水为去离子水 , 其
余试剂均为分析纯 。
2 方法与结果
2.1 电泳条件
毛细管柱:未涂层弹性融硅石英毛细管(55 cm ×75μm),
有效长度为 50 cm;缓冲液:1.2 mmol ·L -1三乙胺 -HCl
(pH10.0), 添加剂为 0.24 mmol ·L -1β -环糊精;分离电压:
12.5 kV ;重力进样:10 s(高度:20 cm);温度:25 ℃;湿度:<
45%。毛细管柱在使用前依次用去离子水、0.1mol·L -1 NaOH
溶液、去离子水 、缓冲液各冲洗 5 min;检测电极和缓冲液容器
用超声波清洗 10 min 。进样 5次之后还需按照上述步骤清洗毛
细管柱 。毛细管电泳色谱见图 1。
2.2 溶液的制备
2.2.1 内标溶液的制备:精密称取布洛芬对照品 22.0 mg ,置
于 50 mL 量瓶中 , 加甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 作为内标
贮备液(浓度为 440μg ·mL -1)。
2.2.2 对照品溶液的制备:精密称取 OA 对照品 19.5 mg 、
UA 对照品 20.0 mg , 分别置于 50 mL 量瓶中 , 加甲醇溶解并
稀释至刻度 , 摇匀 , 作为对照品贮备液 (浓度分别为 390μg ·
mL -1和 400μg ·mL -1)。
2.2.3 供试品溶液的制备:取本品粉末约 1 g , 精密称定 , 置
于索氏提取器中 ,加甲醇 80 mL ,加热回流 3 h ,放冷 ,提取液置
于 100 mL量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,经 0.45μm 微孔滤膜
过滤 ,即得 。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的绘制:分别吸取一定量的对照品贮备液 、
内标贮备液 ,加甲醇稀释成含 OA 浓度为 3.9 、7.8 、15.6 、19.5 、
23.4 、 31.2 、 39.0μg ·mL -1 , UA 浓度为 20.0 、 40.0 、 60.0 、
80.0 、100.0 、120.0 、140.0 μg ·mL -1 ,内标溶液浓度均为 19.8
μg ·mL -1的溶液 。依次重力进样 10 s , 每个浓度测定 3次以
上 。以对照品溶液浓度(C)为横坐标 ,对照品与内标峰面积的
比值 (Y)为纵坐标进行线性回归 , 分别得回归方程为 Y OA =
0.024 2C —0.046 5(r =0.999 1);Y UA=0.020 9C +0.050 9
(r =0.999 0)。结果表明 , OA 、UA 的检测浓度分别在 3.9 ～
39.0 、 20.0 ～ 140.0μg ·mL -1范围内与各自峰面积积分值呈
良好线性关系 。
2.3.2 精密度试验:取浓度分别为 19.5 、 80.0 μg ·mL -1的
OA 与 UA 对照品溶液 , 重力进样 10 s , 连续测定 5次 , 记录峰
面积并计算 RSD 。结果 ,OA 峰面积积分值的 RSD =1.27%,
UA 峰面积积分值的 R SD =1.01%,表明仪器精密度良好 。
2.3.3 稳定性试验:取供试品溶液(广东增城样品)在 0 、2 、4 、
8 、24 h分别重力进样 10 s ,记录峰面积 。结果 ,OA 峰面积积分
值的 RSD =1.67%, UA 峰面积积分值的 RSD =1.35%, 表
明供试品溶液在 24 h内稳定 。
2.3.4 重现性试验 :取同一批 (广东增城)样品 6份 , 按
“2.2.3” 项下方法提取 、测定 。结果 , OA 的平均含量为 2.36
mg ·g -1 , RSD =1.35%(n =6);UA 的平均含量为 8.57
mg ·g -1 , RSD =1.43%(n =6)。表明方法重现性良好 。
2.3.5 加样回收率试验:精密称取同一批(广东增城)样品 6
份 ,分别加入相应量的OA 和 UA 对照品 ,按“2.2.3”项下方法
处理并测定 ,计算加样回收率 ,结果分别见表 1 、表 2。
表 1 OA的加样回收率试验结果(n=6)
Tab 1 Results of recovery test of Oleanolic acid(n=6)
称样量/g 样品含量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/ % x/ % RSD/ %
0.506 1 1.19 1.17 2.37 100.1
96.5 1.98
0.498 4 1.18 1.17 2.29 94.9
0.508 7 1.20 1.17 2.32 95.7
0.503 4 1.19 1.17 2.30 95.1
0.501 9 1.18 1.17 2.31 96.6
0.539 9 1.27 1.17 2.40 96.7
2.4 样品含量测定
取不同产地的水线草 ,按“2.2.3”项下方法处理后测定 ,记
录峰面积 , 代入回归方程分别计算样品中 OA和 UA 的含量 ,
结果见表 3。
· 2358· China Pharmacy 2008 Vol.19 No.30 中国药房 2008年第 19卷第 30期
表 2 UA的加样回收率试验结果(n=6)
Tab 2 Results of recovery test of Ursolic ac id (n=6)
称样量/g 样品含量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/ % x/ % RSD/ %
0.506 1 4.34 4.40 8.55 95.7
96.0 1.09
0.498 4 4.27 4.40 8.46 95.2
0.508 7 4.36 4.40 8.60 96.4
0.503 4 4.31 4.40 8.48 94.8
0.501 9 4.30 4.40 8.54 96.4
0.539 9 4.63 4.40 8.93 97.7
表 3 样品含量测定结果
Tab 3 Results of contents determination of samples
产地 OA UA含量/mg · g -1 RSD/ % 含量/mg· g -1 RSD/ %广东增城 2.36 1.35 8.57 1.43
广西桂林 2.76 2.43 7.49 2.26
海南海口 2.58 2.71 8.96 1.58
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3 讨论
3.1 缓冲液的选择
试验考察了 NaAc-HAc 、三乙胺-H 3BO 3 、Tris-H 3BO 3 、
NaH2PO 4-H 3PO 4 、T ris-Na 2HPO 4 、NaH 2PO 4-Na 2HPO 4 、三
乙胺-HCl等几种电解质体系不同浓度和不同配比对分离效
果的影响 。结果发现 , 只有在三乙胺-HCl和三乙胺-H3BO 3
这 2种体系中 OA 和 UA 可以出峰 。在三乙胺-HCl体系中 ,
基线较平稳 , 峰形较好 , 检测信号灵敏度高 , 故认为三乙胺-
HCl体系是比较理想的缓冲液 。
3.2 添加剂的选择
由于 OA 和 UA 属于结构异构体 ,空间结构中只有 1个甲
基的位置不同 , 故在未加任何添加剂的情况下 , 无法实现 OA
和 UA 的分离 。保持体系不变 ,试验对十二烷基硫酸钠(SDS)、
熊去氧胆酸 、β-环糊精 、HP -β -环糊精分别进行考察 , 发现
唯独β -环糊精能够对 OA 和 UA 产生较好的分离效果 。然后 ,
进一步对 β -环糊精的浓度 (0.02 ～ 0.6 mmol ·L -1)进行考
察:当其浓度低于 0.24 mmol ·L -1时 , 二者达不到基线分离;
当其浓度在 0.24 ～ 0.4 mmol·L -1范围内 , 分离度逐渐下降 ,
且迁移时间延长 , 这是由于随着环糊精浓度的增加 , 相应增加
了包合物的浓度 ,使体系黏度增大 ,延长了出峰时间 ,且浓度增
加影响缓冲液的电渗流 , 溶液中各组分的电泳淌度也发生了变
化 ,从而影响分离度 。因此 ,本试验最终选择 β-环糊精浓度为
0.24 mmol ·L -1。
3.3 分离电压和进样量的影响
分离电压也是影响分离的重要因素之一 。试验在 7 ～ 22
kV 分离电压下进样分析 。结果表明 ,高分离电场令电渗流速度
加快 ,出峰时间明显缩短 ,有利于加快分析速度;但分离电压过
高 ,焦耳热增大 ,噪声大幅度增加 。当分离电压为 12.5 kV 时 ,
分析速度较快 ,基线噪声较低 ,故选择分离电压为 12.5 kV 。
进样量同时受进样时间和进样高度的影响 。试验在 20 cm
高度下比较了进样时间为 2.0 ～ 20.0 s的分离效果 。结果表明 ,
峰高随着进样时间延长而增加 , 但当进样时间>14.0 s时 , 峰
高增加的幅度下降 ,区带展宽趋于明显 ,峰形受到影响;进样时间
在 4.0 s以下时 ,进样量太少 ,检测到的峰高较小 ,不利于检测 。
另在相同条件下考察了虹吸进样高度为 10.0 ～ 30.0 cm
的分离检测效果 。结果表明 ,进样高度为 20 cm 时分离效果最
佳 ,故最终选择进样高度为 20 cm ,进样时间为 10.0 s。
3.4 样品提取方法的选择
试验比较了甲醇 、95%乙醇、乙醚 、三氯甲烷 4种提取溶剂
对提取的影响 。结果 ,乙醚 、三氯甲烷提取液的杂质较少 ,但提
取率不高;甲醇与 95%乙醇提取率相当 , 但甲醇提取液色谱图
杂质峰少 ,对 OA 与 UA 测定无干扰 ,基线较平稳 ,故选择甲醇
作提取溶剂 。
选择好提取溶剂后 ,比较超声 、索氏 、加热回流 3种提取方
法 。结果发现 , 超声和加热回流提取均不如索氏提取的提取率
高 , 且用索氏提取 2 h的样品基线稳定 , 提取完全 , OA 和 UA
的检测状况良好 ,故选择索氏提取法 。
3.5 小结
在优化的试验条件下 ,水线草药材中的 OA 和 UA 可以在
10 min之内得到很好的分离 。比较薄层色谱 、高效液相色谱等
方法 [ 5 , 6 ] , 毛细管电泳法更具有省时 、低耗等优点 , 高频电导检
测器更是避免了光程短和末端紫外吸收的限制 , 使用方便 , 灵
敏度较高 , 重现性和精密度都比较理想 。由于其自身的特点和
优势 , 随着研究的深入 , 毛细管电泳法在中药质量控制中将得
到更多的应用 。
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(收稿日期:2008-07-14 修回日期:2008-09-24)