全 文 ：抓基酸杂志 碑 , 邻一铃成 l够 9
利用固定在角叉菜凝胶中的中间
氏菌细胞合成 L 一多巴
G
.
P a r a a n d 丁 . B a r a t t i
::!!燕 ,沐双筑衬界i{}
中 , 20 小时得到 7 . 8 克 /升 以 上 的 L 一 多包 (产率是 0 . 3。克 /升小时 )o 在初速度 条件
和分批 反应 器中 ,
凝 胶 中的细胞要高
固杯 角义 菜凝 胶中的 ’ ” 胞今柳仕 一 多 巴 ’ 匕固定在 泵丙 捧 酞 胺
佘_ - - 一仗·
前 ~ ` 山仁二. 按下式反应进行
:
丰物催化作用是由廉价的前体物不对称
合成有价值的光学活性物质的有效方法 。 _蕉
氨基酸生产 中 , 化学合成法往往导 致 D和升
对映体消旋混合物 。 但是 , 生物转化方法在再
业规模上未使用 , 因此大多数熏要的氨基酵
直接用发酵法生产 。 这方法不能用米生产禅
常 用来治疗巴金森病的 L 一多 巴 郁 . 4 二 经基
苯 一 L 一丙氨酸 ) 。 ` 拍
日本工作 者 ( Y a 卿 `d砰日K u垃 ag 幼 ) 证
实酪氨酸酚裂合酶能在适当条件下 用来合成
L
一多 巴 。 该酶广泛地分布在 各 种 微 生 物
中 , 它能催化 L 一酪氨酸 (或 L 一多 巴 1 .降.解
为氨 、 丙酮酸和酚 (或邻苯 二 、 酚 ) 。 这 紫底物中的一种过剩 (通常 是氨 ) , 反 应于衡
转向合成 L 酪氨酸或 L 多巴 。 禾用 提 纯的
酪氨酸酚裂合酶或产生该酶的微生物细胞通
过 此反应用来生产 l , 酪氛酸或 L 一多巴 。
我们 的实验证 明了中间埃希氏菌和 草生
欧文氏菌 ( E r W `“ , a ”叮 l,i c O I“ ) 细 胞可卿
、米合成 L 胳氨酸或 L 多 巴 。 L一多巴 ;的台 感
/ \ 。 。瞬厂谈且十 C H O C。 一 C。 。 H + “ H:
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尺H 2 C O O H
名一` -一尹
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O于J
邻一笨二酚 + 丙 酮 酸 + 氛七= 二 L 一 多巴
( 1 )
固定在聚丙烯酸胺凝胶 中的中间埃希氏
菌细胞保留原酶活性的 40 一即% 。 它对由丙
酮酸和邻苯二酚引起 的底物抑制作用和失活
敏感 。 初步报导了使 用不同的有机体的固定
化细月包生产七丫多巴 。
本文叙述了固定在 角叉菜凝胶 中的中间
埃希氏菌固定化细胞 的制备 夕 并期望比固定
在聚丙烯酞胺凝咬中的固定化细胞得到较高
的酶保留活性。 总之 , 为得到高活 性 催 化
DOI : 10. 14188 /j . ajsh. 1989. 04. 017
剂 , 大多数固定化细胞是能在凝胶中生长的
活细胞 。 本文还报道了在分批反应器和连续反应器中底物娜礴对厚草初速度 和 L多 巴
合成的影响。
材料和方法
培养条件
中间埃希氏菌 A T C C 2 1 o 7 3在下述 组 成
的培养基中培养 (克 /升 ) : 蛋 白 陈 5 , 牛
肉膏 5 , 酵母膏 5 , N a C 1 2 , 酪 氨 酸 2 ,
p H调到 7 . 。 , 发酵温度为 30 ℃。 A Z一 1发 酵
装置装 1。。 o毫升培养基 , 接种 50 毫升在相同
组 成 (除省去 L 酪氨酸外 ) 培养基培 养 18小
时的培养物 。 发酵装置内装两个涡轮式推进
器 ( 6 5 O r e o /分 )和一个空气分布器 l( V V M ) ,
培养 1 6一 1 8小时后 , 细胞 用离心机分离 , 直
接用来 固定化或分析酪氨酸酚裂合酶 。
固定化细胞的制备
中间埃希氏菌细胞 ( 1 . 5克 干细 胞 ) 悬
浮在 6 . 4毫 升 3 . 5% N : ` C l溶液中 , 在 5 ℃同
1 3
.
6毫升 4 %角叉菜溶液混合 , 混合物加热
到 7 0一洲 ℃溶解 , 纯混合物用注射器通过针
头挤到零度 2 % K C I溶液中 , 在 K C I溶液 中
保留 30 分钟后 , 凝 胶 珠 ( 3一 s m m直径 )
用蒸馏水洗 , 在 4 ℃保存至到使用 。
酶的分析
固定化细胞 酪氨酸酚裂合酶活性在 含有
。 . 4毫升混合物里 用 L 多 巴合成的 速 度来
测定 , 邻苯二酚。 . I M , 丙酮酸钠 0 . 1了SM ,
醋酸钱 。 . 4M , p H调到 3 . 5。 当分析 游 离细
胞酪氨酸酚裂合酶时 , 下述浓度被使用 , 邻
苯二酚 。 . o 6 5M , 丙酮酸钠 .G 2巧 M , 醋酸按
o
.
5 5M
。 加入 2 0 0一 4 0 0毫克固定化细胞 ( 2 0
一 2 5毫克游离细胞 ) 后反应开始 , 在 37 ℃培
养 15 分钟后 , 加入 0 . 05 毫升 I M H C I 中 止 反
应 , 形成的 L一多巴用高压液相色谱来 测定 ,
圆柱体用 o . ol M醋酸铰缓冲户液 ( P H 3 . 6 ) 洗
脱 。 洗脱液在 2 8 0n , n处紫外分光 光 度 计 检
出。 一个酶活力单位规定为在该条件下每分
钟合成 印 M ol L一多巴的细胞数量 。 比活性
用每克 (干细胞重量 ) 细胞表示 。
L
一多巴生产
分批反应器在含有 1G 毫升 混 合物的 10
毫升长颈并中运转 , 混合物组成 : 不同浓度
的邻苯三酚 、 丙酮酸钠 、 醋酸 钱 , N a : 5 0 :
2克 /升 , E D T A I克 /升 , 以及同邻 苯 二酚
相同克分子浓度的硼酸钠 。 加入游离的或固
定化的细胞 , 混合物在 37 ℃振荡培养 。 定时
取样 , 过滤 , 分析 L 多 巴 含量 。 对于连 续
反应器 , 圆柱体 (l ’ x Z o c m ) 用固定化细胞
(总体积 20 m l) 充满 , 反应混合物泵 入 圆
柱体内 , 流速 ” 毫升 /小 时 , 温 度 控 制 在
3 7℃ 。
结 果
固定化细胞的制备
中间埃希氏菌细胞按 “材料与方法 ” 所
描述方法包埋在角叉菜凝胶 中 。 游离细胞和
固定化细胞的 L 一多 巴合成按酶分析采用 的
条件进行试 验 。 由上述两个制剂来看 , 固定
化细胞中L 多 巴合成数量在 60 分钟 内同时
间呈直线关系 , 如 图 1所示 。 由曲线的坡度
计算出制剂的活性 , 以每克制万d单位活性表
示 (每分钟 L 多 巴 合成的微摩 尔数 ) 。 当
固定化细胞数量按分析要求变 化 时 , L 一 多
巴合成呈直线增加 (即从 50 到 4韵毫克凝胶 /
升反应混合物 ) , 然后缓慢下降和减少 。 对
活性分析来说 , 最大负荷是 45 % ( M / V ) 。
在凝胶里 固定化细胞的浓度从 25 毫克 /
克到 1 50 毫克 /克间变化 , 此范围内的烟泡浓
度对 L 一多 巴 合成的影响用来检查凝胶中底
物扩散限制因素 。 L 一多 巴合 戍速度同固 定
化细胞的数量 (直到 7 5毫克 /克 细 胞 ) 成直
线增加 , 然后继续缓慢增加 。 这个值已被所
有的固定化试 验选用 。
当上述条件用来作为细胞 固定化 时 , 固
定化细胞 制剂活性是 10 . 5单位 /克 细 胞 。 固
定化细胞活性是游离细胞 的 63 % 。 特别要指
一卫一 - +从s a p p
S
Vm
. p,
( 4 )
在 S高浓度 J清况下 , 方程式 4 的第二 项可忽
略不计 , l/ U 对与作 蔺是 直 线 。 对 邻 苯二
酚来说 , 游高细胞雨」回定化细胞的实验结果
如 图 6 B所 示 。 表劝。 扣:称}J帘数K sa p。用这种方
法测定 。
口。场伊ǎ二日。炭冷à
比活性
图 1 固定化细的合成 L 多 巴 的动力学
按 . 材料和方法 口 所描述的醉分析条件培养
出的是它比在聚丙烯酸胺凝胶中固定化细胞
所得酶活性 ( 4 9% ) 要高 。
如图 I 所示 , 游离的和固定化的中间埃
希氏菌细胞在 4 ℃以上贮藏时酪氨酸酚裂合
酶活性急剧下 降。 可是固定化细胞稳定性增
加 , 游离细胞 2 天初活性损失 5。% , 而固定
化细胞需 5 . 5天才损失 50 % 。 在 同 样 条 件
下 , 固定表康丙烯酞胺凝胶 中细胞 初活性在
.4 5天捡失 5。% 。
底物 :次度的影响
对、不 .刁定物浓度时的工, 多巴 合成初 速
度进行了研究 , 结果 见 图 l 一 v 。 对三种雇
物来说 , 游离细胞 和固定化细胞的曲线坡度
相 似。 即经钧一的米凯利斯一 门顿动 力 学 分
析 成线第一汀分 , 如 图 ,l\7所示 (以邻苯二酚
为底物时 ) 夕 和公式是一致的。
三
图耳
「 . 时间 (分 )
在 4 ℃ 以 上贮藏吵游 _离细胞 .(
和 固定化细胞
稳定性
( O ) 酪氛酸盼裂合酶活性的
游离细胞 ( 10 肠 ) 枯性是 3 1单位 /克 , 固定 化 细
胞 ( 1 0 帕) 泛性勘 9 . 5单位 /克 .
V =
U n 、 p p叹
。 p p 一卜 b (
2 )
对游 l笃细胞孔I团定化细胞来说 , l/ U对
1/ 5 的菜因威弗 泊克图是直线 , 由此可判 断
表双未氏常数 K 。 , 。 图 l 一 V 的 曲 线 第
二邵分用同公式一致的底物抑制动力学米分
书子:
U 。
` 。 。 。士)
卜. , 1 、 a 。 , + 凡 + 5丫 ` : 。 p ;
和 一而 1一
U 、 11 1。 p p
_
1一 一 +
V
Jn 压一
( 3 )
K m
。 , ,
错酸按浓度 ( M )
图 l 醋酸接 浓度付游离李 : 胞 ( · ) 和
固定化 细胞 ( O ) 活性的影响
游离细胞胆 ( 10 0肠;
’ 。 。帕 ) 活性是 3 1单位 /充 ,活性是 19 . 5单位 /克 ,
固 定化细
100
前 一 1万万一L 而尔 -
丙 酮酸 浓度 ( M )图 万 丙酮 酸浓度衬游 离细 胞 ( · )和
固定化 细胞 ( O )的影响
使用酶分析条件 . 游离细胞 ( 10 肠 )活性是 31单
位 /克 , 固定化细胞 ( 10 0肠 )活性是 1 9 . 5单位 /克 `
结果如表 I 所 示 , 以邻苯二酚为底物时
固定在角叉菜凝胶中细胞同固定在聚丙烯酸
胺凝胶 中细胞进行 比 较 , K m 、 ,常 数 几 乎
相同 。 在 以丙酮酸和醋酸铁为底物时 , 固定
在 角叉菜凝胶中细胞 的 K m 叩 p比 游娜细 胞和 固定在聚丙烯酞胺凝胶 中 细 胞 K吸。 p p 值
低 。 较好的表面亲合力可 以用来解释在角叉
菜凝胶 中固定化细咆获得较高的酶 保 留 L 活
性。 每一个底物最适浓度见表 I 。 该浓度用
于酶分析 (见材料和方法 ) 。 三种底物在高
拔度下是抑制剂 , 其中邻苯二酚是 强 抑 制
剂 。 因此 , 在大多数情况下 , 分批反应藉在
限制邻苯二酚浓度到底物抑制的最小程度时
运转 。
固定化细胞的稳定性
固定化细胞酪氨酸酚裂合酶不可逆的失
活通过不同培养条件控制 : ( a )含有 N a Z S O 3
2 克 /升和 E D T A I 克 /升的 0 . 4 0 M醋酸钠 ;
(b ) o
· ` 7 5M丙叩酸钠 ; ` ( e ) 0 . ` 。 OM 邻苯二
酚和 0 . 1 0 M硼酸钠 。 在 37 ℃培养 6,I 、 时 后 ,
保留估性分别为 3 6 % 、 4 1% 和 60 % 。 因此 ,
反应中的两种底物对酪氨酸酚裂合酶活性显
示出严重 的失活 。 在长期分批试验或连续试
验情况下 , 将大大地影响催化剂的稳定性 。
表 I 底物 浓度甘游 离细胞和 固定化 细
胞奋成 L `多巴如影响 的比较
卯
l活比性ǎ%à
细 胞 固 定 在
游离细胞 { 聚丙烯酸胺
邻苯二酚
丙酮酸
醋酸钱
K
“ l a p p
K
s a p p
C
o P t
K ln a P P
C a Pt
K甩 a p p
C a P t
。 . O 4 M
0
.
1 39 M
日 . 0弘 M
。 . 2 l o M
。 . 2灯 M
。 . 2 50 M
0
.
5 5o M
0
.
o 4 3 M
0
.
1了 S M
0
.
I O. M
0
. 叨。 M
0
.
34 〔) M
0
.
2了S M
O
_
5 5 0 M
角叉菜
0
. 口4 6 M
0
.
1之。 M
0
.
I OO M
0
.
o 5 6 M
()
.
1 7 5 M
0
.
0 8 () M
0
_
4 0 JM
邻茉二 酚 浓度 ( M )图 V 邻 苯二酚浓度甘游 离细胞 ( · )和固定化 细胞 ( O )的影响
图 VI 邻 苯二酚
动 力学常数刚 定
(人 ) 反 应速度倒数
( 1 / V ) 对邻苯 二酚 浓度
倒数 ( 1 / S ) 作图
( B )反应速度倒数 ( 1
/ v )对邻苯二酚浓度 (S )
作图 。
游离细胞 ( · ) 和固定
化细胞 ( O ) 反应速度用
撮高位的 百 分数表示 如 l/
v 1 0 2绘 {月
比活性
ǎ%)
使 用酶 分析 条件 . 游离 细胞单位 /克 , 固定化细胞 ( 10 帕〕 活 (
1 0 。肠 ) 活性是 3 1性是内 . 5单位 /克
邻苯二酚 一硼酸复 合 物的使用是企图使
酶失活减小到最 低程度。 在 分批反应器中 ,
溶液里 自然形成的这种复合物用来合 成 L -
多巴 。 在另一报道中报道了硫酸钠和 E D T A
的加入起到抗氧 化作用 , 有 利 L 一多 巴稳 定
性。
反应混合物的两个限制因素 , 在分批反
应器和连续反应器中采用 , 它 们对 L 一多 巴
合成初速度的影响进行了试验。 结果 (见表
亚 ) 明确指出 , 邻苯二酚一硼酸复合物较强
的降低 L 多 巴 合成的初速度 , 所以在这 种
情况下仅得到 6一 7 . 5%的初活 性 。 E D T A和
硫酸盐的加入表现很低的抑制作用 (在这种
条件下恢复 7 5%活性 ) 。 当同 日本人研究的
结果 比较 时 , 这意外的结果可 由不同试验条
件所致来解释 。 E n e i等在分批反应 器 中 用
长时间培养观察 L 多 巴 合成初 速度。 在分
批反应器中 尽 管 邻 苯二酚 一 硼酸盐复 合物
较强的降低反应速度 , 但是邻苯二酚一翩酸
盐复合物对酶活性稳定性仍是有效的 , 用抗
坏血酸作保护剂具有相同作用也已报道 。
在 我们试验中 , 分批反应器除 硼 酸 盐
外 , E D T A 和硫酸盐加入 , 如同 酪 氨 酸 酚
裂 合酶失活一样 夕 导致 L 一多 巴 合成降 低。
反应混合物的褐色决定于邻 苯二酚 和 L 一多
巴的氧化 。 而全部反应器在三种稳定的制剂
存在时运转 。
表 l 稳 定剂时固定化细 胞 L 一多 巴 合
成初速度的影响
} 比 活 性
条 件 }一 , 万万工万一一万一一二厂一 ,
1 单位 /克 ! 肠森落丽 -一— 一茄石 -— 压丽一标 样分 析十 E D T A一硫酸盐 ’ 1 4 . 9 } 75标样分析 + 硼酸 盐 } 1 . 2 } 6
标 样分析 十 E D T入一 硫酸盐 1 . 5 } 8
十 侧酸盐 「 }
酸钠 ( o . o 4 5M 、 o . x 6 8 M和 o . 3 4 o M )的 l。毫
升混合物 (邻苯二酚一硼酸盐浓度是色. D 2 7 3
M
, 而不是 0 . 10 产 M ) 的分批反应器 研 究了
L
一多 巴的合 成 。 L 一多 巴 合成 的 初 速 _度 `
随 丙 酮 酸 浓 度 增 加 而增加 (见图砚) 、 `
在 17小 时得到了 2 . 5 , 3 . 0和 4 . 0 克 /升 L `多
巴 , 这表明对邻苯二酚转化率分别为 47 鲜下
5了%和了5% 。 由 L 一多 巴 合成初速 度 的 分
析 , 观察到这批结果轻微差异 (见图班 ) 。
在分批反应器中 , L 一多 巴 的合成随丙酮酸
钠浓度增加而增加 夕 丙酮酸的最适 浓 度 是
0
.
1 75 M
。 同 时要注意到在分批试 验 中 长时
间培养情况下 , 在 37 ℃ 、 P H S . 5时丙酮酸钠
不很稳定 。 因此 , 高初始浓度是最适合成速
度所必需 的 。 总之 , 邻苯二酚一硼酸复合物浓
度在分批试验中比较低 , 并且可能影响丙酮
酸钠最适值 .
一 J - 上一 司` 一 J ` 一司` 一 J _
邻二苯酚转化率ǎ%à
按材料与方法所描述的分析条件 . E D T A 、 硫酸盐和
硼酸款浓度 分别为 1 克 /升 、 2 克 /升和 。 . I M .
在分批反应器中丙酮酸浓度的影响
使用含 4 . 5克凝胶 , 具有不同浓 度 丙酮
时间 (分 )
图砚 在分李七反应 器中丙酮酸浓度 衬 L
一 多巴合成的影 响
温度 37 ℃. 4 . 5克 固定化细胞在 1。毫升拢合滚中婚赛 ,
混合液组成如下 : 醋酸钱 o . 4 M 、 N a : 5 0 5 2 克 /升 ,
E D T A I 克 /升 , 邻苯二姗硼酸复 合 街。 . 。玄7 3粼和三
种不同浓度丙酮限钠 t 4 5 . snr M ( 口 ) , 1右她M ( O )
和 3 4 om M ( · )
在分批反应器中邻笨二姗解度的诱角
试 验第一阶段 , 4 . 5克凝胶在 37 ℃ 、 4 0毫
升混合液的长颈瓶中培养 , 混合物 组 成 如 ;
下 : 醋 酸 钱 0 . 4叨 M 、 N丘2 5 0 , 念 克 /卉、
E D T A I克 /升 、 丙酮酸钠。 . 1劝和不同 浓度
的邻苯二酚硼酸盐复合物 (。 , 。2弓M 、 o . OSM 、
0 . 时 SM 、 .0 I M ) ` 结果明显证明丙酮 酸 浓
度是反应限制因素 。 L 一多 巴合成 在 2一 3
小时后中止 , L 二多巴浓度 分 别 达 到 2 。 4 ,
.
3 ,
一和 4 ` 3克 /升 , 丙酮酸钠 浓 度 增 加 到
。。召4o M , ’一如图孤所指出结果一 样 。 在 这些
条作 F <见图姐 ) , 高浓度 L 一多 巴被 邻苯
匕粉高 转化率 ( 82 % 、 60 %和 5 4% ) 所 公
认。 邻苯二酚浓度为 0 . 0 2 7 3 M (在 2 。小 时转
化启台% )` 时 , 试验产率达 。 . 3 9克 /升 小时 。
由图破 、 图履可 以引起两个结论 , 第一 , 为
了说明在分批反应器中培养混合物里物质分
解便用了高浓度的丙酮酸钠 。 第二 , 高浓度
L渗 巴 。 . 8克 /升 ) 在 较低的 邻 苯二 酚
翁女% ) 转化条件下得到 , 这意味着在相同时间里两个参数不可熊是最适的 。
同固定在聚丙烯酞胺凝胶 中的细胞比较
邻苯二酚化转率ǎ%à
两种催化剂的 4 . 5克凝胶在 37 ℃ 、 10 毫 升混 `
合物中培养 , 混合物组成 : 醋酸按 o . 4 0 M 、丙酒
酮酸钠 o . 3 40 M , 邻苯二酚硼酸复合物 0 . 02 7 3 、
M , N : : 5 0
。 2克 /升 , 和 E D T A I克 /升 , 、
p H S
.
5
。
L 一多巴 合成动力学如图互所 示。 、
采用聚丙烯酞胺固定化细胞最终得到 5 . 4克
/升 L 一多 巴 (邻笨二酚转 化 10 % ) 需 30 小
时 , 而角叉菜固定化细胞只需 2 0小时 , 它们
的容积转化率分别为。 . 18 克 /升小时 , 0 . 27 克 、
/升小时 , L 一多巴 合 成初速度分别为 0 . 27 0
和 0 .价 5克 /升小时 。 因此 , 固定在角叉菜凝
胶中的中间 埃希氏菌细胞的 L 一多巴合成 比
固定在聚丙烯酞胺凝胶里相同的固定化细胞
高。 这大慨是由于在角叉菜凝胶中有较高的
保留活性 ( 63 %同 46 肠比较 ) 和较快的底物
扩散速度 。
L一多巴连续生产
具有在角叉菜凝胶中固定化的中间埃希
氏菌细胞 的圆柱体反应器在 25 ℃ , p H S . 5条
件下运转 , 下述混合物以每小时。。 5的 间 隔
速度泵入 圆柱体 , 其混合物组 成 : 醋 酸 钱
。 . 4M , 丙酮酸钠 。 . Q0 5 M , 邻苯二酚硼酸复
r ~ 一 -一
I。“ ;
-
~ 一备尸 -一一 -、一 ~` 洲碑 诊 砂尹 -了尸 /
/`
_
L _ _ 几 _
. 主 _一炙O
时间 (小 时 )
图孤 在分批反应器 中邻苯二 酚 一棚 酸
复合物对 L 一 多巴合 成的 影 响
. 祖衰” 七` 通 . 5克固定化细胞在 10 毫升混合物中培养 .
棍合物组成 : · 醋酸钠 。 . 4 M , N 。 : 5 0 5 2 克 /升 , E D T A
1 克 / 升 , 丙酮酸钠 。 . 34 M 和三种不同浓度 的邻苯二酚
一翻酸复合物 : 灯 . 3皿 M ( · ) , 54 . 5 m M ( 。 ) 和 7 2 . 7
m M (口 )
在另一报告中 , 我们描述 了中间埃希氏
菌细胞在 聚丙烯阶胺 凝咬中固定 化细胞的制
舰飞性质 。在分批反应器中使用了两种固定化细胞
制剂 , 比较了它们合成 L 一多 巴的速度。 对
_
_
1 _
多口
时间 (分 )图双 固定在 聚而 烯酸胺凝胶 ( O ) 和
角又菜凝 胶 ( · ) 中的中间埃希
氏菌细胞合成 L 一多巴的比较
温度 37 ℃ , 4 . 5克凝胶在 10 毫升混合物中培养 ,
组成如 下 : 醋酸 铁 0
.
4 M
’
N a : 5 0 3 2 克 /升 ,
混合物
E D T
A l 克 /升 , 丙酮酸钠 。 ,
o
,
3 7 3M
3 40 M
,邻苯 二酚碱酸盐复合物
合物 o. o o5 M, N 。 : 5 0 。 2克 /升 , 和 E D T A
1 克 /升 。 L 一多巴 合 成达 到 0 . 4克 /升 , 然
后缓慢下降 。 在这种条件下催化剂半衰期是
3叼、 时。 高浓度邻苯二酚 (或丙酮酸 ) 条件
下 , 转 化程度比较低 , 催化剂失活较快。
讨 论
固定在角叉 菜凝胶里的中间埃希氏菌细
胞保留游离细胞 活性的 63 % 。 它比较早报道
的在 聚丙烯酞胺凝胶中固定化的中间埃希氏
菌细胞 , 在相同条件下保留活性 (46 % )高 。
L 一淞巴 合成初速度对参入反应 的三种
底物的浓度很敏感。 这指出底物抑 制 动 力
学 。 最适浓度已确定 , 该浓度已在酪氨酸酚
裂合酶活性分析中使用 。
在分批反应器中 ,底物抑制的发生对 L -
多 巴 合 成的适宜条件的设计是很重要 。 首
先 , 作为 L 多 巴 合成的初速度的最 适浓度
已使 用 。 另外 , 出现新的问题 ; 第一 , 一种
底物 (丙酮酸钠 ) 在反应混合物不很稳定 ,
它们的浓度在反应器中不得不增加 。 第二 ,
在反应混合物中 , L 一多 巴 形 成不稳定 , 为
了避免 L 一多 巴 氧化 , 硫酸钠和 E D T A 不
得不加入 。 第三 , 在反应混 合物中 , 酪氨酸
酚裂合酶活性由于 丙酮酸钠和邻苯二酚存在
而失活 , 尤其是邻苯二酚存在影响较大 。 如
E n ie 等报道的一样 , 这难用邻苯二酚硼酸盐
的使用来解释 。 当硼酸钠加入 时 , 在分批反
应器中在有效浓度里观察到 L 一多巴 合成 。
因此 , 在这种条件下催化剂损失 90 一肠%初
活性 , 分批反应器中 L 一多 巴 合成速度和产
率慢慢降低 。
当使用连续反应器时 , 合 成 L 一多巴浓
度很低 , 并且活性急剧损失 。 这是由于它们
对丙酮酸钠和邻苯二酚一硼酸复合物浓度的
变化很敏感 , 该底物能引起催化 剂 失 活 。
具有邻苯二酚完全转 化的最适反应器在
邻苯二酚浓度为 o . o 2 7 3M时观察到 , 最终得
到 5 . 4克 /升 L 多 巴。 固定在角叉菜凝胶 中
的细胞 比固定在聚丙烯酸胺凝胶中细胞 的初
速度和总产率要高 。 如 E n e i等描述的一样 ,
副产物的形成在我们的试 验中从刹没有观察
到 。 副产物缺乏可以被下述两点解释 ; ( a )
通过加入硫酸钠和 E D T A , L 一多巴对 氧 化
作用的稳定性 ; (b) 在使 用 时 , L 多巴一
硼酸复合物同丙酮酸的反应缺乏 。
结果清楚证明固定在角叉菜凝胶中细胞
进行 L 一多巴 合成是有效的。 所以 , 必需进
一步促进生化过程 , 使 L 一多 巴 生 产 工业
化。 为了提高连续反应器中催化剂稳定性 ,
我们必须进 一步探讨。
往 : U反 应速度 . 每分钟 L一多巴 合成 的微摩尔数
S底物浓度
K m
. p P表现米氏常数 , M ol s /升
K
s a p p表 现抑制常数 , M ol s /升
U坦 aP p表现最高速度 , 每分钟微克 摩尔
余敦寿译 自 : 《E n g e m e 扭 ic or b .
t e e h n o l
.
29 5 8 , V o l l O
, 地 12 -
7 2 9~ 7 3 5》
(上接 4 2页 )
素抗性基因的转录 , 因为已知四环素抗性基
因 的表达能使这类 载体不稳定 。
我们 的实验结果证实 , E . C ol 宜B菌株的
芳 香族氨基酸转氨酶活性至少能 够提 高 10
倍 。 多拷贝 的柯斯质粒 P IM S 4 o 0 6在非选 择
性培养基 中经过近 50 个世代 , 其遗传特性仍
然是稳定的 。
关于重组菌株在转化苯丙酮酸盐为笨丙
氨酸方面的特 性将在另一文章中讨论。
刘序章译 自 《 B i o t e e h n o l o g y
l e t t e r s V o l 取 . 10 6 7 3~ 6 7 9 , 1。昌了汾