全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测
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2014年 第39卷 第8期
收稿日期：2014-02-27 *通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目(31260368)；江西省人才项目；江西省科技支撑计划项目(2010BNB00503)。
作者简介：付晓(1989—)，男，江西新余人，硕士研究生，研究方向为天然产物与功能食品。
付 晓1,2，尹忠平1,2，上官新晨1,2*，陈继光1,2，郭春梅1,2，彭大勇2
(1.江西农业大学食品科学与工程学院，南昌 330045；
2.江西省天然产物与功能食品重点实验室，南昌 330045)
摘要：建立了同时测定甜叶菊中绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸3种化合物
的HPLC分析方法，并测定了3种化合物在根、茎、叶中的含量。色谱柱为Waters C18(4.6 mm×250
mm，5 μm)，流动相为0.2%醋酸(A)和甲醇(B)，流速：1 mL/min，检测波长：327 nm，柱温：40
℃，洗脱条件为0~10 min 70% A；10~15 min 70% A-45% A；15~25 min 45% A，25~26 min 45%
A-70% A；26~30 min 70% A。在此条件下，绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁
酸的线性范围分别为9.50~285.00、9.25~277.50、9.75~292。50 μg/mL且在此范围内线性关系良
好(R2>0.999)，加标回收率介于96.42%~101.18%。从乙醇体积分数、料液比和超声提取时间3因
素优化绿原酸提取条件，最佳条件为70%乙醇在料液比1:25的条件下超声提取60 min。对甜叶菊
根、茎、叶中上述3种化合物含量进行分析，结果显示，甜叶菊根、茎、叶中绿原酸、3,5-二咖
啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量范围分别为0.59~7.56、2.43~23.92、1.12~21.21 mg/g。
该方法准确度高，重复性好，可用于甜叶菊中3种绿原酸类化合物的同时测定。
关键词：高效液相色谱法；甜叶菊；绿原酸
中图分类号：R 284.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2014)08-0276-05
HPLC法同时测定甜叶菊中3种
绿原酸类化合物
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HPLC simultaneous determination of three caffeoylquinic acids in
leaves of Stevia rebaudianum Bertoni
FU Xiao1,2, YIN Zhong-ping1,2, SHANGGUANG Xin-chen1,2*, CHEN Ji-guang1,2,
GUO Chun-mei1,2, PENG Da-yong2
(1.College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agriculture University, Nanchang
330045; 2.Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food, Nanchang
330045)
Abstract: A HPLC method was developed for simultaneous determination of three caffeoylquinic acids
namely chorogenic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid and 4,5-dicaffeoylquinic acid in Stevia rebaudianum
Bertoni. The content of the three compounds in root, stem and leave were determined by this method.
A Waters C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was adopted. The mobile phase consisted of 2% acetic
acid(A) and methanol (B) with gradient program of 70% (A) in 0~10 min, 70%~45% (A) in 10~15 min,
45% (A) in 15~25 min, 45%~70% (A) in 25~26 min, 70% (A) in 26~30 min. The fl ow rate is 1.0 mL/min.
The Column temperature was set at 40 ℃, and the detection wavelength was 327 nm. The calibration
curves were linear in the ranges of 9.50~285.00, 9.25~277.50, 9.75~292.50 μg/mL for chorogenic acid,
3,5-dicaffeoylquinic acid and 4,5-dicaffeoylquinic acid (R2>0.999). The recovery ranged from 96.42% to
101.18%. Three critical extraction parameters namely ethanol concentration, liquid ratio and ultrasonic
time were optimized, the best conditions were 1:25 liquid ratio with 70% ethanol ultrasonic extraction
for 60 min. Root, stem and leave of Stevia rebaudianum Bertoni were determined by this method. The
content of chorogenic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid and 4,5-dicaffeoylquinic acid in root, stem and leave
of Stevia rebaudianum Bertoni was 0.59~7.56 mg/g, 2.43~23.92 mg/g and 1.12~21.21 mg/g respectively.
The determination method was accurate and repeatable, and therefore can be used for simultaneous
determination of three caffeoylquinic acid in leaves of Stevia rebaudianum Bertoni.
Key words: HPLC; Stevia rebaudianum Bertoni; caffeoylquinic acid
甜叶菊(Stevia rebaudianum Bertoni)属菊科多年
生草本植物，生长于巴西和巴拉圭地区，数百年
来，当地人一直将其叶子作为天然甜味剂[1]。近
些年来，在南美洲、亚洲和欧盟，甜叶菊也作为
低热量的甜味剂使用，目前，日本和韩国是甜叶
菊最大的消费市场，中国是甜叶菊最大的种植基
地，大约80%的产品出口[2]。甜叶菊作为一种新型
的农业作物，具有极大商业价值。
国内外学者研究主要集中在甜叶菊中的甜
味成分甜菊糖苷的分离纯化及其功能性方面[3-5]。
最近研究发现，除甜菊糖苷外，甜叶菊中也含有
多酚类化合物，其提取物有很强的抗氧化活性[6]。
Karakose[7]等人用串联质谱的方法在甜叶菊叶片中
检测到了24种绿原酸类物质，包括咖啡酰奎宁酸、
二咖啡酰奎宁酸和三咖啡酰奎宁酸。李军[8]等人
也从甜叶菊的有效部位检测到了木犀草素-7-O-
β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、4,5-双咖啡酰奎宁酸和
槲皮素-3-O-[4-O-反式-咖啡酰基-α-L-鼠李糖
-(1→6)-β-D-半乳糖苷]3种酚类化合物。
绿原酸类化合物具有抗氧化、抗炎、抗病
毒、抗菌、降脂降糖、免疫调节等多种功效，在
食品、保健、医疗和日用化工等领域有广泛的应
用[9]。XIONG Jian-hua[10]等人从金银花叶中分离得
到5种抗菌的化合物，其中绿原酸、3,5-二咖啡先
奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸表现出了很强的抗
菌活性。目前，绿原酸的检测方法有分光光度检
测法、薄层层析-紫外分光光度法、高效液相色谱
法、气相色谱法和毛细管电泳法等，高效液相色
谱法是绿原酸检测中最常用的分析方法[11]。本文
采用高效液相色谱法，同时测定甜叶菊根、茎、
叶中绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰
奎宁酸的含量，为甜叶菊的质量评价和有效地开
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助提取30 min，4500 r/min离心5 min，上清液于10
mL容量瓶中定容制得提取液，吸取1 mL提取液，
加入4 mL蒸馏水稀释，0.22 μm滤膜过滤后进行
液相分析。
2.3.3 超声提取时间优化 准确称取甜叶菊叶片
粉末0.2 g，分别加入70%乙醇5 mL，超声辅助提
取30、60、90、120、150 min，4500 r/min离心5
min，上清液于10 mL容量瓶中定容制得提取液，
吸取1 mL提取液，加入4 mL蒸馏水稀释，0.22 μm
滤膜过滤后进行液相分析。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察 进样不同浓度的标准溶液10
μL，HPLC分析，得到各峰保留时间和峰面积，
采用二元线性回归法得到浓度(X)对峰面积(Y)的回
归方程。
2.4.2 精密性考察 将混合标准溶液连续进样6
次，进样量10 μL，得到峰面积并计算RSD。
2.4.3 稳定性考察 将供试品溶液在0、3、6、9、
12 h进样10 μL，得到峰面积并计算RSD。
2.4.4 加样回收率考察 准确称取0.2 g甜叶菊叶片
粉末6份，依次精密加入绿原酸、3,5-二咖啡酰奎
宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品0.950、0.925、
0.975 mg，按2.1.3优化的最佳提取条件制备，得到
提取液HPLC分析。
2.5 测试样品溶液制备
准确称取根、茎、叶样品粉末0.2 g，加70%
乙醇5 mL，超声辅助提取60 min，4500 r/min离
心，转移至10 mL容量瓶中定容，制得提取液，稀
释一定倍数后，0.22 μm滤膜过滤，得到测试样品
溶液。
2.6 数据统计
数据统计软件为Excel 2003，作图软件为
origin 8.0。每个样品平行测定3次，结果表示为平
均值±标准偏差。
3 结果与讨论
3.1 检测波长的选择及分离条件的优化
采用二极管阵列检测器在200~400 nm范围内
分别扫描绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二
咖啡酰奎宁酸，结果显示3个化合物在327 nm波
长处有最大吸收值，故确定检测波长为327 nm。
采用梯度洗脱，经过多次试验，确定洗脱程序为
0~10 min70% A；10~15 min70% A-45% A；15~25
min45% A，25~26 min 45% A-70% A；26~30 min
发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
1.1.1 主要试剂 绿原酸(HPLC，>98%)、3,5-二咖
啡酰奎宁酸(HPLC，>97%)、4,5-二咖啡酰奎宁酸
(HPLC，>97%)标准品：上海同田生物科技有限公
司；色谱纯甲醇(Tieda)；其他试剂为分析纯；水
为超纯水。
1.1.2 主要仪器 HPLC为安捷伦1260系统：配
自动进样器和二极管阵列检测器，美国安捷伦
科技公司；超纯水制备器：美国Milli-Q公司；
SB-3200超声波清洗机：宁波新芝生物科技有
限公司。
1.2 主要材料
甜叶菊根、茎、叶：江西省赣州市菊隆高科
技有限公司，甜叶菊品种为甜菊3号，10月采收，
60 ℃烘干后磨粉，过40目筛。
2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱为Waters C18(4.6 mm×250 mm，5
μm)，流动相为0.2%醋酸(A)和甲醇(B)，流速：
1 mL/min，检测波长：327 nm，柱温：40 ℃，洗
脱条件为0~10 min 70% A；10~15 min 70% A-45%
A；15~25 min 45% A；25~26 min 45% A-70% A；
26~30 min 70% A。
2.2 标准品溶液制备
准确称取绿原酸标准品3.8 mg、3,5-二咖啡
酰奎宁酸3.7 mg、4,5-二咖啡酰奎宁酸3.9 mg，
1 mL甲醇超声溶解，制得3.8 mg/mL绿原酸、3.7
mg/mL 3,5-二咖啡酰奎宁酸、3.9 mg/mL 4,5-二咖
啡酰奎宁酸标准溶液，吸取一定量标准溶液，在
9.25~292.50 μg/mL范围内配成8个浓度的标准品
溶液。
2.3 甜叶菊样品制备提取条件的优化
2.3.1 乙醇体积分数优化 准确称取甜叶菊叶片粉
末0.2 g，分别加入10%、30%、50%、70%、90%
乙醇4 mL，超声辅助提取30 min，4500 r/min离心
5 min，上清液于10 mL容量瓶中定容制得提取液，
吸取1 mL提取液，加入4 mL蒸馏水稀释，0.22 μm
滤膜过滤后进行液相分析。
2.3.2 料液比优化 准确称取甜叶菊叶片粉末0.2
g，分别加入70%乙醇2、3、4、5、6 mL，超声辅
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注：1为绿原酸；2为3,5-二咖啡酰奎宁酸；3为4,5-二咖啡酰奎宁酸。
图1 标准品(A)和甜叶菊样品(B)
图2 不同乙醇体积分数提取效果
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70% A。在此洗脱条件下，标准品和甜叶菊样品
的分离结果见图1，在30 min内，色谱峰可以完全
分开，标准品色谱图中1、2、3与甜叶菊样品中的
保留时间一致，添加单一标品至供试品溶液中，
判断1、2、3分别为绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸
和4,5-二咖啡酰奎宁酸。
3.2 甜叶菊样品制备提取条件优化
3.2.1 乙醇体积分数优化 比较了10%、30%、
50%、70%及90%乙醇对甜叶菊中绿原酸、3,5-
二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的提取效
果，由图2可知，低浓度和高浓度的乙醇均不利
于甜叶菊叶片中绿原酸的提取，70%乙醇对3种成
分均有最佳的提取效果，此条件下甜叶菊叶片中
绿原酸的含量为7.09 mg/g，3,5-二咖啡酰奎宁酸
和4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量分别为23.83、18.61
mg/g，选择此条件进行后续试验。
3.2.3 超声时间优化 按照“2.3.3”的方法得到3
种成分的提取含量与超声时间的关系如图4所示，
在60 min内，3种成分随超声时间的延长，提取含
量提高，在60~120 min内，超声时间对提取效果影
响甚微，到150 min时，提取含量有略微下降的趋
势，综合考虑选择60 min为最佳提取时间。这一结
果与汪启炉[12]等人通过正交试验优化超声提取抱
石莲中绿原酸的提取条件结果相似，文中在70%
乙醇，总提取时间1 h，总溶剂为原料的24倍条件
下绿原酸的提取率为1.60%。
图3 不同料液比提取效果
图4 不同超声时间提取效果
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3.2.2 料液比优化 料液比优化结果如图 3所示，
在1:10~1:25(m:U)的范围内，随着料液比的增大，
3种成分的提取含量逐步提高，以3,5-二咖啡酰
奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸提高最显著，含量
分别为22.98、19.05 mg/g，继续提高料液比对3
种成分的提取率无显著影响，选择最佳料液比为
1:25。
3.3 方法学考察
3.3.1 线性关系考察 按“2.4.1”项下的方法得到
进样浓度(X)对峰面积(Y)的回归方程，结果显示在
相应的进样量范围内，3种成分的线性关系良好，
结果见表1。
表1 3种成分回归方程
成分 回归方程 R2 线性范围/(μg/mL)
绿原酸 Y=28.052X－121.540 0.9997 9.50~285.00
3,5-二咖啡酰
奎宁酸 Y=24.989X－82.588 0.9995 9.25~277.50
4,5-二咖啡酰
奎宁酸 Y=27.167X－162.680 0.9992 9.75~292.50
注：Y为峰面积，X为进样量。
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3.3.2 精密性、稳定性和加样回收率考察 精密
性、稳定性和加样回收率考察结果见表2。
表2 精密性、稳定性和加样回收率试验结果 %
成分
精密度
RSD/%
稳定性
RSD/%
加样回收率
RSD/% 回收率
tR 峰面积 tR 峰面积 tR 回收率
绿原酸 0.23 1.15 0.27 2.73 0.99 2.02 99.16
3,5-二咖啡
酰奎宁酸 0.11 1.50 0.11 2.41 0.17 1.96 101.18
4,5-二咖啡
酰奎宁酸 0.10 1.26 0.08 2.26 0.14 1.89 96.42
注：tR为保留时间。
3.4 样品含量分析
将建立的分析方法运用于甜叶菊根、茎、
叶中3种主要绿原酸类化合物分析，结果如表3
所示，甜叶菊根、茎、叶中绿原酸、3,5-二咖啡
酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸含量差异较大，
含量最高的是甜叶菊叶片，分别是7.56、23.92和
21.21 mg/g，根和茎中3种成分的含量较低，这可
能是催化合成绿原酸类化合物的关键基因在不同
部位的差异表达所致，也可能是由于甜叶菊的根
和茎在生长过程中木质化所致。
表3 根、茎、叶中3种绿原酸类化合物含量(n=3)
样品 绿原酸/(mg/g) 3,5-二咖啡酰奎宁酸/(mg/g)
4,5-二咖啡酰奎宁酸
/(mg/g)
根 2.96±0.09 5.41±0.08 4.99±0.07
茎 0.59±0.03 2.43±0.14 1.12±0.06
叶 7.56±0.17 23.92±0.44 21.21±0.42
4 结论
本文建立了甜叶菊中3种绿原酸类化合物同
时测定的HPLC定量分析方法，该方法具有很好的
准确性和重复性。甜叶菊在70%乙醇，料液比1:25
的条件下超声提取60 min，绿原酸、3,5-二咖啡酰
奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸3种化合物提取率最
高。在此基础上分析了甜叶菊根、茎、叶中3种化
合物的含量，结果表明3种化合物在甜叶菊不同部
位的含量差异大。
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