全 文 ：临床皮肤科杂志 年 卷第 期 , , , 一。
论著裂褶菌致病性的动物实验研究
任强 强 , 万 力 , 巨英超 ,
河北医科大学第四医院皮肤科 , 河北
林元珠 `
石家庄 河北医科大学第四医院动物实验中心 , 河北 石家庄
时商 要 目的 构建小鼠裂褶菌系统性感染的动物模型并探讨裂褶菌的致病性 。 方法 将裂褶菌接种于不同免疫状态的清洁
级昆明小鼠皮下 、腹腔及静脉。 观察不同免疫状态 、不同接种途径小鼠 内的死亡率 , 对分期处死的小鼠进行解剖 、组织逆
培养 、组织病理学等检查 , 通过组织菌载量测定方法比较不同免疫状态下小鼠心 、 肝 、脾 、 肺和肾等主要脏器的感染程度 。 结果
免疫抑制静脉组与免疫抑制腹腔组小鼠的平均存活天数比较 , 有统计学差异 , 其余各组均无 自然死亡 。 无论免疫正常还是免疫
抑制状态下 , 腹腔注射组肝脏感染程度较其他脏器重 静脉注射组肝脏 、脾脏感染程度较重 。 苏木精一伊红染色显示急性炎性细
胞浸润 , 可见组织细胞变性坏死 过碘酸一雪夫 染色可见炎症组织中有紫红色分枝菌丝 。 结论 免疫抑制状态小鼠更易引
起裂褶菌感染 , 感染的程度也更重 。 当进人体内的菌量较多时也可引起免疫正常的小鼠系统性感染 , 说明裂褶菌的致病力与机
体免疫状态密切相关 。
关键词 裂褶菌 致病性 动物实验 免疫状态
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
一 , , 一 , 一
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叩划
, , 一
裂褶菌 讼 柳 。 。 属担子菌纲 , 伞
菌目 , 裂褶菌科 , 裂褶菌属 ` , 寄生于阔叶树及针叶树
的腐木上 , 广泛分布于世界各地 , 是林木常见的致病
性真菌 。 在致人类疾病方面 , 临床多见吸人其抱子引
起的过敏反应 , 但由该菌引起人类深部组织感染的疾
病较为罕见 。 随着放疗 、化疗 、糖皮质激素及免疫抑制
剂等在临床上的广泛应用 , 许多新的机会致病菌或变
种感染人体的病例不断增多 。 年 报告裂
褶菌引起人类甲癣以来 , 国外有关该菌引起人类深部
组织感染的报道不断出现 。 本实验研究采用动物实验
的方法 , 分别经皮下 、 腹腔及静脉 种途径将裂褶菌
悬液接种于不同免疫状态的小鼠 , 通过组织真菌逆培
养 、脏器菌载量 、组织病理学等检测方法了解该菌引
起系统性感染的可能性及组织病理学改变 。
收稿 日期 一 一 修回日期 一 一
材料和方法
材料
菌种 我科真菌室保存菌株 , 分离自 例冠状动脉搭桥
术后患者的痰液 , 并经中国医学科学院微生物研究所鉴定为裂
褶菌 编号 一 , 于一 ℃冰箱冻存 。
动物 昆明种远交系雄性小白鼠 购自河北医科大学实
验动物中心 , 清洁级 , 一 周龄 , 体重 , 只 , 屏障环
境下饲养 。
实验材料 沙堡葡萄糖琼脂培养基 ` 蛋白陈 、
5 8 8 临床皮肤科杂志 年 卷第 期 , , ,
葡萄糖 、琼脂 、蒸馏水 、氯霉素 , ℃
灭菌备用 。
药物 注射用环磷酞胺 梦支 , 江苏恒瑞医
药股份有限公司 。
方法
菌悬液制备 经预试验激活的菌株转种于 培养基
上 , ℃培养 , 挑取生长良好的菌落置于含生理盐水的研
磨器中均匀研磨 , 用血细胞计数板调整滤液菌丝及抱子浓度至
一 , 菌丝与抱子的比例为 备用 。
动物分组 将 只清洁级昆明小 鼠根据免疫状态及
给菌途径的不同随机分为 组 免疫正常状态下分为皮下组 、
腹腔组和静脉组各 只 。 免疫抑制状态下分为皮下组 只 、
腹腔组 只和静脉组 只 其中免疫抑制腹腔组和免疫抑制
静脉组再各 自随机分为 个亚组 自然死亡率观察组和分期处
死解剖组各 只 。
小鼠免疫抑制模型的建立 各免疫抑制组小鼠接种菌
悬液前给予腹腔注射环磷酞胺 昨 , 每天 次 , 连续 。
第 天白细胞计数最低 , 诱导其产生免疫抑制状态 。
菌悬液的接种 于注射 后第 天注射菌悬液 , 共
种接种途径 皮下注射菌悬液 只 腹腔注射菌悬液
只 静脉注射 , 沿尾静脉注射菌悬液 只 。
小鼠接种后生存情况及生存率的观察 记录并观察各
组小鼠感染该菌后的一般情况及 周内的自然死亡情况 , 记录
死亡 日期和死亡只数 。
观察内脏组织形态变化 定期处死 、解剖小鼠观察内脏
组织形态变化 , 接种菌悬液后第 、 、 、 周 、 周 、 周时 ,
随机提取分期处死解剖各组分别行颈椎脱位处死几只小鼠 , 为
保证标本具有可比胜 , 每一配对标本均取自同一病程的小鼠 。 自
然死亡小鼠随时取出 , 未死亡的小鼠 周时全部处死。 无菌条件
下解剖观察各脏器大体改变 , 分离出心 、肝 、脾 、 肺 、 肾。 将各脏器
分成 份 , 分别用于组织真菌逆培养 、组织病理学检查和脏器菌
载量测定 。 组织真菌逆培养 无菌条件下各脏器研碎 , 接种至
培养基试管斜面上 , 点接种 , 每个脏器移种 管置于 ℃
恒温箱中培养 , 周后观察结果 。 组织病理学检查 脏器用
福尔马林溶液固定 , 分别进行苏木精一伊红染色和过碘酸一雪夫
染色。 脏器菌载量 ①无菌条件下取小鼠心 、肝 、脾 、肺和
肾 , 分别用微量电子天平称出小鼠脏器的重量 。 ②脏器放入无菌
研磨器中研磨成组织匀浆 , 按 的量加人无菌生理盐
水混匀 。 ③用移液器吸取 协 组织匀浆 , 接种于 平皿培
养基上 , ℃孵育 。 ④计数培养基平面上生长的菌落数 , 计
算出单位重量小鼠脏器组织所含的菌量 个 。
统计学方法
使用 统计软件处理实验数据 , 尸 为有统计
学意义 。
结 果
小鼠接种菌悬液后一般状况
免疫正常和免疫抑制皮下组小鼠活动及进食量
无明显改变 , 皮下接种部位出现局部结节性损害 。 免
疫正常腹腔组和静脉组小鼠接种 周内活动量有所
减少 , 毛发散乱 , 周后均逐渐恢复 。 免疫抑制腹腔组
和静脉组小鼠活动量明显减少 , 毛发倒逆无光 , 进食
量也明显减少逐渐消瘦 , 不断有 自然死亡小鼠出现 。
免疫抑制静脉组在接种后第 天开始出现死亡 , 死亡
率高达 免疫抑制腹腔组在接种后 开始出现
死亡 , 至 止死亡率为 。 组生存天数用
两样本检验 , 一 , 尸 , 差异有统
计学意义 , 可认为免疫抑制腹腔组较静脉组的生存天
数长 。 其余各组均无自然死亡 。
解剖后各脏器大体改变
免疫抑制腹腔组及静脉组小鼠心肺充血水肿 , 不
同程度呈紫红色的肝脾肿大 中晚期心脏淤血肿大 、
肺脏萎缩呈粉色或暗紫色 、肝脾不同程度肿大呈紫红
色 , 部分小鼠肝 、脾和肺表面可见粟粒至绿豆大白色
化脓感染灶 图 一 。 免疫正常腹腔组及静脉组部
分小鼠脏器呈轻度充血水肿改变 ,脏器表面未见坏死
及化脓性病灶 。 皮下组小鼠各脏器表面未见明显病理
改变 。
组织逆培养
试管培养 不论免疫正常或免疫抑制的皮下
组 , 各脏器的真菌逆培养均为阴性 。 免疫抑制腹腔组
处死亚组 只小鼠 , 心 、肝 、脾 、肺及肾真菌培养阳性
结果依次为 、 、 、 、 免疫抑制静脉组处死亚组 只
依次为 、 、 、 、 。 免疫抑制静脉组和腹腔组两组真
菌逆培养阳性例数分别为 、 , 尸 ,有统计
学差异 。 免疫正常腹腔组和静脉组 周以内部分肝脏 、
肝脏表面白色化脓灶 脾脏表面多发性化脓灶 肺脏表面白色化脓感染灶
图 免疫抑制小鼠肝 、脾 、肺脏器所见
临床皮肤科杂志 年 卷第 期 , , ,
肺脏培养阳性 , 但 周以后培养全部转为阴性 。
平皿培养 菌落生长较快 , 为蓬松白色羊毛状
图 , 培养基背面呈淡黄色 光镜下可见有丰富分
支的枝隔菌丝 , 结构差别较大 , 在菌丝表面上可见短
且弯曲的侧生钉状突起 图 , 但未见子实体及担
袍子结构 。
脏器菌载量统计分析
腹腔接种途径 无论是免疫正常还是免疫抑制状
态下 , 肝 、脾真菌菌载量明显高于心 、肺 , 差异有统计
学意义 肝与脾 、 心与肺两两比较 , 差异均无
统计学意义 尸 。 静脉接种途径 免疫正常状态
下 , 肝真菌载菌量最高 , 与其他脏器比较差异均有统
计学意义 尸 , 心脏 、肺脏和脾脏两两比较均无
统计学差异 尸 。 免疫抑制状态下 , 肝真菌载菌量
最高 , 与其他脏器比较差异均有统计学意义 尸
其次为脾脏 , 与心脏 、肺脏和肾比较 , 差异亦有统计学
意义 尸 心脏 、肺脏和肾真菌载菌量差异无统
计学意义 尸 表 。 免疫抑制静脉组肝脏感染
程度最为严重 , 与免疫抑制腹腔组 、 免疫正常静脉组
和腹腔组相 比较 , 差异有统计学意义 免疫
抑制腹腔组 、免疫正常静脉组和腹腔组相比较 , 肝脏
感染程度差异无统计学意义 尸 表 。
组织病理学检查
表 两种免疫状态下腹腔组及静脉组小鼠肝脏
真菌载菌量比较 。 , 个
组 别 菌落数 个 值 值
免疫抑制静脉组 刀 肚 名 ,
免疫抑制腹腔组 士 刀
免疫正常静脉组 土
免疫正常腹腔组 幻
免疫抑制静脉组肝脏感染程度最为严重 , 与其他各组 比较 , 尸
仪 免疫抑制腹腔组 、免疫正常静脉组和腹腔组相比较 , 尸
皮下注射组内脏均无明显组织病理学变化 。 所有
感染内脏的主要组织病理变化如下 。
心脏 血管扩张充血 , 心肌纤维之间可见散在红
细胞 , 心肌细胞横纹模糊不清 , 心肌间质细胞水肿 , 散
在淋巴细胞浸润 。 染色可见心腔内大量紫红色的
菌丝 图 。 肝脏 早期肝细胞肿胀 、高度空泡样变性 ,
肝窦狭窄 , 肝组织内散在淋巴细胞浸润 , 肝细胞变性
坏死 严重者肝细胞广泛空泡样变性 、坏死 ,肝小叶结
构破坏 图 晚期巨噬细胞增生及新生肝细胞核分
裂象 。 肝组织内多灶性真菌感染 , 染色可见病灶
内大量紫红色的分枝菌丝 图 。 脾脏 早期可见多
灶性真菌感染 , 充血性改变 , 有急性炎性细胞浸润 , 并
且纤维组织增生 。 晚期可见巨核及多核巨细胞反应性
增生 , 髓外造血样改变 , 纤维组织增生 。 染色可见
大量紫红色菌丝 。 肺脏 主要为间质性肺炎的改变 , 表
现为毛细血管扩张充血 、 出血 肺泡表 免疫正常及免疫抑制状态下腹腔组和静脉组小鼠心 、肝 、 脾 、肺和肾脏
真菌载菌量比较 。 , 个
脏 器 免疫正常腹腔组载菌量
免疫正常静脉组
载菌量
免疫抑制腹腔组
载菌量
免疫抑制静脉组
载菌量
肝 土 石 土 名 士 刀 士
脾 土 石 士 士 士
肺 土 土 士
』心 士 , 士 , 士 一
肾 刃 乃 乃 士 名
值 值 , 值 石 值
值 值 值 乃 值
种免疫状态下 , 肝 、脾真菌载菌量最高 , 与其他脏器比较均 在静脉组小鼠中 , 肝
脏真菌载菌量最高 , 与其他脏器比较均 尸 住。
壁宽 , 间质扩张水肿 , 弥漫性炎性细
胞浸润 晚期可见肺泡腔内浆液性渗
出 , 巨噬细胞增多 , 肺泡间隔断裂 、 融
合 。 肺泡间质内可见弥漫分布的大量
染色阳性的菌丝 。 肾脏 肾皮质及
髓质充血水肿 , 肾小管内可见管型形
成 , 未见菌丝及抱子 。
讨 论
裂 褶 菌 讼叩 州
为一种食 、 药兼用真菌 , 国内外
蓬松 、白色羊毛状菌落 光镜下可见有丰富分支的枝隔菌
丝 ,结构差别较大 , 在菌丝表面上可见短且弯曲的侧生钉状突起
图 免疫抑制小鼠肝脏组织平皿逆培养及镜下图像
心内膜上大量紫红色的菌丝 染色
图 免疫抑制小鼠心脏组织病理像
59 0 临床皮肤科杂志 年 卷第 期 , , ,
肝细胞广泛空泡样变性 、 坏死 , 肝组织内散在淋巴细胞浸润
染色 肝组织病灶内可见大量紫红色的分枝菌丝 染色
图 免疫抑制小鼠肝脏组织病理像
裂褶菌的研究主要集中在该菌的生物学特性 、食用和
药用价值 、 人工栽培驯化和多糖结构分析等领域 。
但 目前越来越多的证据表明裂褶菌和人类感染有
关 。 年 从甲癣患者中分离出该菌 , 此后
世界各地陆续有该菌致病的报道 。 年
等从 例 口腔硬愕溃疡和穿孔患者的病灶 中分离
出该菌 。 年 和 及 年
等分别报告 例 , 在上领窦炎患者窦内容物中均
发现该菌 。 但关于裂褶菌引起机体深部感染仅国外
有报道 , 国内尚未见报道 。 本研究中所用菌株是我科
分离 自 例接受冠状动脉搭桥术后患者的痰液 , 该
患者术后因病情需要应用气管插管并多次使用糖皮
质激素 , 周后 出现肺部感染症状 , 不同时间 次自
痰液中均分离出该菌株 。
目前普遍认为 , 免疫抑制状态是系统性真菌感染
发病率上升的重要原因之一 。 环磷酞胺可使小鼠外周
血和脾内活化的天然杀伤 细胞和 淋巴细胞比
例下降 、 淋巴细胞转化增殖能力和脾 细胞活性
降低 。 因此 , 本实验应用环磷酞胺腹腔注射造成免疫
抑制组小鼠的免疫抑制状态 , 经皮下 、 腹腔及静脉
种途径将裂褶菌悬液分别接种于不同免疫状态 的小
鼠 , 观察各组小鼠自然死亡率 , 并通过组织真菌逆培
养判断内脏组织有无真菌感染 。
免疫抑制腹腔组在接种后 开始出现死亡 , 死
亡率为 免疫抑制静脉组在接种后第 天即出现
死亡 , 死亡率为 组小鼠生存天数比较 , 差异有
统计学意义 。 免疫正常组和皮下组小鼠均无 自然死
亡 。 结果表明在免疫抑制状态下腹腔和静脉接种途径
均可成功地建立裂褶菌系统性感染的小鼠模型 。
真菌培养法与组织病理学检查是深部真菌病诊
断的 “ 金标准 ” 。 我国 《血液病 恶性肿瘤患者侵袭性真
菌感染的诊断标准与治疗原则 修订版 》 指出 , 确诊
深部组织感染的重要标准 在通常无菌而临床表现或
放射学检查支持存在感染的部位 , 无菌术下取得的标
本 , 其培养结果呈 阳性 。 本实验通过组织真菌逆培养
发现 , 无论是免疫正常还是免疫抑制状态下 , 皮下接
种菌悬液仅在注射部位出现局部感染灶 , 内脏真菌逆
培养均为阴性 , 可能是由于皮下注射经血循环进人内
脏的菌量较少 , 不足以导致系统性感染 。
免疫正常状态下 , 腹腔组仅个别小鼠肝脏 、脾脏
组织真菌逆培养阳性 , 腹腔外各组的心脏 、肺脏和后
腹膜的肾脏逆培养均为阴性 静脉组个别小鼠心脏 、
肝脏 、 脾脏和肺脏真菌逆培养阳性 。 组中感染小鼠组
织真菌逆培养 一 周后均转阴性 , 这可能和小鼠获得
性免疫应答建立和增强有关 , 说明该菌虽然是一种条
件致病菌 , 但并非对健康小鼠绝对不致病 , 只是感染
的程度较轻或为一过性感染 。 而在免疫抑制状态下 ,
腹腔组小鼠心脏 、肝脏 、脾脏和肺脏真菌逆培养阳性
静脉组小鼠心脏 、 肝脏 、脾脏 、肺脏和肾脏真菌逆培养
阳性 , 表明在免疫抑制状态下的小鼠更易发生全身播
散性感染 同时在免疫抑制状态下 , 静脉组真菌逆培
养阳性率与腹腔组比较 , 差异有统计学意义 , 表明静
脉接种途径可引起更为严重的系统性感染 。 推测腹腔
接种菌悬液感染小鼠过程中 , 其大网膜及腹膜在防御
真菌的播散中可能起关键作用 。
综合各组小鼠的死亡率及组织真菌逆培养阳性
率分析可以看出 , 机体的免疫状态在裂褶菌所致系统
性感染中的作用是至关重要的 , 这也提示在临床治疗
系统性裂褶菌感染时 ,将抗真菌药物与免疫增强剂联
合应用可能会取得更好的疗效 。
客观定量地反映脏器的真菌感染程度需要测定
组织中菌体的数量 , 一般采用脏器真菌载菌量实验 。
本实验结果表明 , 同一免疫状态和接种途径时 , 肝脏
感染最为严重 , 其次为脾脏和肺脏 , 肾脏最不易感染 。
同时解剖小鼠发现 , 感染早期死亡小鼠心肺充血水
肿 、 肝脾淤血肿大 免疫抑制静脉组和腹腔组感染中
后期部分小鼠肝 、脾 、肺表面出现肉眼可见的白色化
脓性病灶 。
免疫抑制小鼠组组织真菌逆培养 周左右转阴 ,
并且再无小鼠自然死亡 , 同时免疫正常小鼠组 周后
临床皮肤科杂志 年 卷第 期 , , ,
组织真菌逆培养均转阴性 , 推测原因为随着小鼠体内
环磷酞胺代谢清除及小鼠机体免疫应答的恢复和增
强 ,体内的裂褶菌逐步被清除所致 。 进一步说明了裂
褶菌造成机体侵袭性感染的病变程度与机体免疫状
态密切相关 。
组织病理学检查可根据在组织中发现真菌病原
体及局部组织反应来诊断真菌感染 , 是深部真菌病的
重要诊断方法之一 。 传统的苏木精一伊红染色组织反
应清晰 、病理变化良好 , 但大部分真菌不着色或着色
较淡 , 当真菌菌量较少时较易漏诊 , 因此配合 染
色可以克服这一缺点 。 本实验组织病理学检查显示 ,
部分小鼠内脏组织经 染色可见紫红色的菌丝 , 苏
木精一伊红染色表明其病理变化为非特异性的炎症反
应 , 表现为组织细胞变性 、坏死和大量急性 、慢性炎性
细胞浸润等 , 中后期可见组织细胞反应性增生 。
组织载菌量及组织病理表现均表明肝脏受累概
率最高 , 可能与门静脉回流 、肝脏血供丰富有关 其次
为脾脏 , 可能为脾脏血供丰富 , 也是发挥滤除血中微
生物作用的重要过滤器官 , 因此真菌易在此定植增殖 。
心脏组织真菌逆培养阳性 , 组织病理为非特异性炎症
反应 , 染色心内膜可见附壁菌丝 , 可能为血液中菌
丝循环至心腔所致 , 心肌组织细胞中并未发现菌丝 ,
因此裂褶菌对心肌组织 、 心脏结缔组织的侵袭性尚待
进一步研究 。 免疫抑制静脉组小鼠肾脏真菌逆培养阳
性 ,但组织病理学检查结果为阴性 , 可能是真菌病病
程的某一阶段 , 致病菌的菌丝及抱子常局限在组织的
某一局部 , 数量较少 , 切片未能切到病变处所致门 。
本试验组织逆培养镜下观察和各脏器组织病理
学检查中均未见担子菌典型的有性繁殖结构 —担抱子的产生 ,但发现菌丝增长 、分枝分隔增多等变化 ,
推测裂褶菌在组织内增殖方式可能为只进行质配而
不进行核配 , 以锁状联合的方式来增加细胞个体的无
性繁殖方式 。 裂褶菌是植物常见的腐生菌 , 自然界中
生长的最适温度为 ℃ , 子实体形成温度为
℃ ,抱子萌发最适温度为 一 ℃阁 。 大多数真菌不
能在 ℃生长 ,能够使之在这个温度下生存的耐热特
性 , 对于真菌在人体内生长尤为重要 。 而本实验菌种
在 ℃条件下生长最好 ,说明其具备了在人体中生存
繁殖的基本条件 。
总之 , 裂褶菌引起的组织病理学改变以真菌感染
的非特异性急慢性炎症为主 。 宿主的免疫抑制状态可
以增大播散性感染的概率 。 作为临床上罕见的一种条
件致病菌种 , 裂褶菌在其侵袭性的获得 、 逃逸机体防
御反应机制 、 在组织内增殖及其毒力 因子的作用机
制 、 机体对该菌的识别 、 特异性免疫应答建立及作用
机制等方面尚需进一步研究 。
参考文献
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《中华内科杂志 》编辑委员会 血液病 恶性肿瘤患者侵袭性真菌
感染的诊断标准与治疗原则 修订版 中华内科杂志 , ,
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中华皮肤科杂志 , , 一 ·
赵琪 , 袁理春 , 李荣春 裂褶菌研究进展 食用菌学报 , ,
一
全国中西医结合皮肤性病学术年会征文通知
经中国中西医结合学会批准 , 中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会定于 年 月 一 日在南京市钟山宾馆召开
全国中西医结合皮肤性病学术年会 。
此次会议将发扬历次年会的优 良传统 , 注重中西医结合治疗皮肤病的新方法及新的研究进展等方面的学术交流 , 内容密切联系
临床 , 切合皮肤科医师的实际需求 , 会议将邀请知名专家做特邀演讲 , 阐述皮肤科相关领域的最新研究进展 , 创造形式多样 、 内容充
实 、 紧张热烈 、活跃互动的学术交流形式 , 达到全国皮肤科中医 、 西医 、 中西医结合医师共同展现才华 、 获取知识和信息 、增强友谊和
情感的目的 , 共同促经我国皮肤科事业的发展 。 拟参加本次会议者请仔细阅读本通知并按规定的时间和要求投稿 。
投稿要求 ①投稿内容 皮肤科各种基础研究论文 、皮肤科临床诊断和治疗等方面的论文 、典型与疑难病例等 。 ②投稿方式 中
文全文和 字以内的中文摘要 。 鼓励通过电子邮件投稿 , 投稿信箱 撇 。来稿请注明 会议征文 。 ③截稿 日期
年 月 日。 ④会议交流形式 特邀讲演 、大会发言 、分会发言 、 书面交流 。
联系方式 上海市凤阳路 巧 号上海长征医院门诊部皮肤科 , 一 联系人 朱和平 联系电话
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中国中西 医结合学会皮肤性病专业委员会
年 月 日