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无患子总皂苷提取工艺条件优化及天然洗涤剂研制



全 文 :北方园艺2013(16):143~148 ·贮藏保鲜加工·
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Study on Control Effect of Trichodermaspp-spent Mushroom Substrate Fermentation to
Cucumber FusariumWilt
GAO Wei 1,2,LI Bao-ju2,WANG Wan-li 1,HAO Yong-juan1,LIU Chun-yan1,WANG Yong1
(1.Tianjin Institute of Plant Protection,Tianjin 300381;2.Insititute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081)
Abstract:Taking cotton seed in mushroom cultivation as material,the spent mushroom substrate fermentation product was
used as a new type of soil additives in cucumber cultivation raw,its prevention efect on cucumber Fusariumwilt was
studied in this paper.The results showed that in pot experiment,the control efect to cucumber Fusariumwilt was up to
63.58%in soil adding spent mushroom substrate fermentation,and was significantly better than that of Trichodermaspp
other adding methods.Trichoderma spp adding as spent mushroom substrate fermentation was easier to colonize in the
cucumber rhizospher than other adding methods.Based on the enzyme activity assay,it was found that chitinase andβ?1,
3-glucanase activity significantly increased,and respectively reached the peak value at 6and 9days under the induction of
Fusarium oxysporum.
Key words:mushroom substrate;Trichoderma spp;fermentation;plate dilution method;chitinase;β?1,3-glucanase
第一作者简介:覃勇荣(1963-),男,广西平南人,硕士,教授,研究
方向为岩溶地区生态恢复重建与资源开发利用。E-mail:hcxyqyr
@126.com.
责任作者:刘旭辉(1962-),女,四川武胜人,硕士,教授,研究方向
为岩溶地区生物资源开发利用与环境化学分析。E-mail:hcxylxh
@163.com.
基金项目:广西自然科学基金资助项目(桂科自0832273);广西高
校重点学科基金资助项目(桂教科研[2010]6号);广西高校重点
实验室基金资助项目(桂教科研[2012]9号)。
收稿日期:2013-04-15
无患子总皂苷提取工艺条件优化及天然洗涤剂研制
覃 勇 荣,刘   欣,黄 光 兵,李 秋 明,刘 旭 辉
(河池学院 化学与生命科学系,广西 宜州546300)
  摘 要:以野生成熟的无患子果实为试材,采用超声波协同提取法提取无患子中的总皂苷,
通过单因素试验和正交实验确定最佳提取工艺条件,以齐墩果酸为对照品,利用香草醛-冰醋酸-
高氯酸体系分光光度法,在波长539nm处测定无患子总皂苷含量。以水为溶剂,筛选出无患子
天然洗涤剂的最佳配方,并测定其去污能力。结果表明:无患子总皂苷的最佳提取工艺条件为:
乙醇体积分数55%,料液比1∶40,超声波功率100W,超声时间45min。此条件下的提取物中总
皂苷平均含量为19.40%。以固液比小于1∶4的无患子天然洗涤剂有较好洗涤效果,该产品绿
色环保,环境友好,具有较大的研究和开发利用潜力。
关键词:无患子;总皂苷;超声波提取;新型洗涤剂
中图分类号:S 567 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2013)16-0143-06
  无患子(Sapindus mukurossi)属无患子科无患子属
落叶乔木,又名木患子、肥皂树、洗手果,主产于东南亚
各国,我国长江流域及南方各省均有栽培[1]。无患子生
长快,寿命长,树形优美,根系发达,抗风力强,观赏和实
用价值高,是深受人们喜爱的园林树种[2]。无患子果皮
蕴含丰富的皂苷,具有很强的表面活性和去污能力,可
作为纯天然洗涤用品使用[3-4]。用无患子洗面可以增白
去斑,洗发可以去风明目。无患子提取物具有抗菌、止
痒、治疗脚癣和轮癣等功效[5-7],无患子皂苷可作为农药
乳化剂,对多种害虫有较好的杀灭效果[8]。目前,对无
患子的研究主要集中在生物学特性、栽培管理、化学成
分分析及其分离提取技术等方面[9-11]。魏凤玉等[7,12]用
水提-大孔树脂吸附分离法和超滤法对无患子皂苷进行
分离纯化,总皂苷纯度分别达到85%和67%。孙洁如
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等[5]采用醇提溶剂萃取工艺,萃取率为50.7%,但此工
艺溶剂用量较大,纯度和产率不高。武士威等[13]筛选出
无患子餐具洗涤剂的最佳原料配比,制备了由表面活性
剂和助剂组成的餐具洗涤剂。截至2010年底,以无患子
为原料开发的产品有沐浴露、洁面乳、手工皂、果蔬净、
皂苷粉、洗发水、面膜、洗衣液等10多种[14],但这些产品
都不同程度地添加了化学合成试剂,不仅成本高,去污
力不理想,而且对人体皮肤和环境都有一定的影响。该
研究旨在优化无患子总皂苷提取的工艺条件,研制纯天
然的新型洗涤剂,以期为桂西北喀斯特地区植物资源的
综合开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为野生的成熟无患子果实,于2012年2~
3月,在河池学院东校区采集。果实采回后,先用自来水
将其表面的尘土洗涤干净,然后用去离子水冲洗3次,
沥干水分,剥取无患子果皮并将其置于60℃的电热恒温
鼓风干燥箱中烘干,再用微型植物粉碎机粉碎,过40目
标准筛,用塑料封口袋密封,置阴凉处保存,备用。
仪器:FZ102型微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪
器有限公司);UV-1800型紫外-可见分光光度计(上海:
日本岛津有限公司);4426型台式电动离心机(常州国华
电器有限公司);CFA-160型微电脑(光波)电热炉(茂名
市恒声电器有限公司);HH-6型数显恒温水浴锅(国华
电器有限公司);AL204型电子分析天平(梅特勒-托利多
仪器上海有限公司);SHB?Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑
州长城科工贸有限公司);KQ2200DE型数显超声波清
洗器(昆山市超声仪器有限公司);101-2-BS型电热恒温
鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂);FCD-217SEN型卧
式双层门冷藏冷冻柜(青岛海尔特种电冰柜有限公司);
TH-86-340-LA-86℃型超低温冰箱(北京天地精仪科技有
限公司)。
试剂:齐墩果酸标准品(中国药品生物制品检定
所);无水乙醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸。以上药品
除特别说明外均为分析纯(AR),试验用水为去离子水。
1.2 试验方法
1.2.1 无患子总皂苷的提取 无患子总皂苷的提取用
超声波协同提取法[15-16]。准确称取0.5000g无患子果
皮粉末,按要求加入一定量的提取溶剂,超声振荡提取
一定时间,抽滤,取滤液定容,再加入提取溶剂二次提
取,定容,得待测样品溶液。
1.2.2 总皂苷含量测定方法 齐墩果酸标准溶液的制
备:精密称取齐墩果酸标准品10mg,置于烧杯中,用甲
醇溶解并定容至100mL的容量瓶中,摇匀,得0.1mg/mL
的标准品溶液,冷藏备用。测定波长的选择:精密吸取
齐墩果酸标准样品溶液1.00mL置于10mL比色管中,
沸水浴中挥干,依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶
液0.2mL,高氯酸0.8mL,摇匀,于60℃水浴中加热
15min取出,冰水浴中冷却后加入冰醋酸5mL,混匀,以
相应试剂为空白,在200~800nm波长范围内测定其吸
收波长,确定539nm作为样品溶液中皂苷类化合物的
测定波长。标准曲线的绘制:精密吸取齐墩果酸标准溶
液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8、2.0mL于6支10mL比
色管中,沸水浴中挥干,依次加入新配制的5%香草
醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,摇匀,于60℃水
浴中加热15min取出,冰水浴中冷却后加入冰醋酸
5mL,混匀,以相应试剂为空白,在539nm处测定吸光
度,以吸光度A为纵坐标,浓度C为横坐标绘制标准曲
线(图1),得回归方程为:y=20.421x-0.0266,R2=
0.9999。无患子总皂苷含量的测定:准确称取干燥的无
患子果皮样品0.5000g,置于50mL锥形瓶中,加入
20mL 55%的乙醇溶液,以50W 的超声波功率处理
45min,抽滤,定容于50mL的容量瓶中,然后取滤液
0.5mL,沸水浴挥干,再用甲醇定容于10mL具塞试管
中,摇匀备用。准确移取待测样液1mL,其制备方法同
上,按标准曲线项下测定吸光度值,然后代入回归方程
计算样品液中总皂苷的质量浓度,最后根据公式计算样
品中总皂苷的含量。总皂苷含量X(%)=(A+0.0266)×
600/(20.421×M),式中:X为样品中总皂苷的含量(%);A
为待测样品溶液的吸光度;M为样品的质量(g)。
图1 齐墩果酸的标准曲线
1.2.3 无患子总皂苷提取工艺条件的单因素试验 超
声时间对总皂苷提取率的影响:准确称取干燥的无患子
果皮样品0.5000g,料液比为1∶40,超声波功率为
60W,乙醇体积分数为30%,超声时间为10、20、30、40、
50min,研究超声时间对总皂荚提取率的影响。超声波
功率对总皂苷提取率的影响:准确称取干燥的无患子果
皮样品0.5000g,料液比为1∶40,乙醇体积分数为
30%,超声时间为40min,超声功率为80、100、120、140、
160W,研究超声功率对总皂荚提取率的影响。料液比对
总皂苷提取率的影响:准确称取干燥的无患子果皮样品
0.5000g,乙醇体积分数为30%,超声时间为40min,超声
功率为100W,料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、
1∶60,研究料液比对总皂荚提取率的影响。乙醇体积
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分数对总皂苷提取率的影响:准确称取干燥的无患子果
皮样品0.5000g,超声时间为40min,超声功率为
100W,料液比为1∶40,乙醇体积分数为30%、40%、
50%、60%、70%,研究乙醇体积分数对总皂荚提取率的
影响。
1.2.4 无患子总皂苷提取工艺条件的正交实验 在单
因素试验的基础上,选取超声波提取时间、料液比、乙醇
体积分数等作为考察因素,每个因素设计3个水平,以
无患子皂苷提取率为考察指标,设计L9(34)正交实验,
根据极差R比较得出无患子皂苷提取的最佳工艺条件。
正交实验因素和水平见表1。
表1 正交实验的因素与水平
因素
水平
1  2  3
A超声时间/min  35  1∶30  45
B料液比/g·mL-1  40  1∶40  50
C乙醇体积分数/% 45  1∶50  55
1.2.5 无患子天然洗涤剂研制 洗涤液制作:称取5g
干燥的无患子果皮样品,置于锥形瓶中,用去离子水作
为提取溶剂,分别以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、
1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12的固液比置于
250mL烧杯中,用功率为100W的超声波在室温条件
下提取约30min(在提取过程中,水温上升18℃左右,该
温度对超声波提取有机物的结果不造成影响)。提取完
毕后,在4 000r/min的离心机中离心约1h(若仍浑浊可
进行二次离心),弃去滤渣,取上清液于小烧杯中,即得
纯天然的无患子洗涤液。去污力测试:将一块带有污垢
(墨水或油脂等)的白色纱布剪成等大的几小块,分别铺
放于培养皿中,然后将不同固液比无患子天然洗涤液各
5mL分别加入培养皿中,浸泡5min,用力搓洗相同的
时间,过清水后铺放回培养皿中,观察墨迹的洗脱程度,
以此判断不同固液比的无患子洗涤液的去污力。
1.3 数据分析
试验设3个平行,结果取平均值。数据处理用
Microsoft Excel 2003进行。
2 结果与分析
2.1 无患子总皂苷提取工艺的单因素试验
2.1.1 超声时间对总皂苷提取率的影响 由图2可知,
在超声时间10~40min,无患子总皂苷提取率随着超声
时间的延长而增加,在40min时总皂苷的提取率达到最
大,超过40min后,皂苷提取率随时间延长逐渐下降。
原因可能是随着提取时间的增加,原料中的组分逐渐
扩散到溶剂中,一定时间后,溶于溶剂中的组分达到一
定浓度后,其溶解速度反而变慢,故以40min作为进一
步优化提取的时间。
2.1.2 超声波功率对总皂苷提取率的影响 由图3可
图2 超声时间对无患子总皂苷提取率的影响
知,超声功率为100W时,无患子总皂苷的提取率最高;
且随着超声功率的增加,总皂苷提取率反而有所下降。
超声功率的升高有利于皂苷类化合物的溶出,但功率过
高乙醇挥发严重,杂质溶出增加,同时,皂苷可能会部分
分解,在实际操作中存在着很多局限性,故选择超声功
率为100W作为最佳提取功率。
图3 超声波功率对无患子总皂苷提取率的影响
2.1.3 料液比对总皂苷提取率的影响 由图4可知,在
料液比小于1∶40之前,随着料液比的增大,总皂苷的提
取率逐渐增大,当料液比为1∶40时,皂苷的提取率最
高,随着料液比的继续增大,总皂苷的提取率反而减少。
这可能是皂苷类化合物已经基本上提取完全,有其它杂
质进入,使浸提液黏度增大,扩散速度变慢,导致皂苷类
化合物难溶出。故选择料液比1∶40作为进一步优化
提取的料液比。
图4 料液比对无患子总皂苷提取率的影响
2.1.4 乙醇体积分数对总皂苷提取率的影响 由图5
可知,随着乙醇体积分数的增大,总皂苷的提取率不断
增加,在50%时无患子总皂苷的提取率最高,超过50%
以后提取率下降。这可能是因为部分皂苷类化合物是
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水溶性物质,当乙醇体积分数过高时,水溶性皂苷溶出
减少,而一些杂质溶出增多并与水溶性皂苷竞争溶剂,
从而使皂苷提取率下降。所以,选择50%的乙醇体积分
数作为进一步优化的提取条件。
图5 乙醇体积分数对无患子总皂苷提取率的影响
2.2 无患子总皂苷提取工艺的正交实验
由表2可以看出,以无患子的提取率作为考察指
标,3种考察因素对总皂苷的提取率效果与单因素试验
结果趋势基本相同,对比极差值(R),结果表明,超声时
间对无患子总皂苷的提取结果影响最大,乙醇体积分数
次之,料液比的影响最小,即A>C>B。这是可能是因
为提取时间增加,无患子果皮水提液中的生物碱、氨基
酸、蛋白质、粘液质、鞣质、糖等杂质溶解量加大,而不利
于皂苷提取;综合各种因素,选定无患子皂苷提取的最
佳方案为A3B2C3,即超声时间为45min,乙醇体积分数
为55%,料液比为1∶40。
2.3 验证性试验
为了考察上述优化工艺的稳定性,按该工艺的最佳
条件,即超声时间为45min,乙醇体积分数为55%,料液
比为1∶40的条件下进行5次重复性试验,分别测定其
总皂苷含量,再计算其RSD值。由表3可知,在此工艺
条件下,总皂苷平均提取率为19.40%,优于正交实验中
    
  表2 正交实验结果
试验号
因素 总皂苷含量
A  B  C /%
1  1  1  1  19.34
2  1  2  2  19.07
3  1  3  3  18.81
4  2  1  2  18.64
5  2  2  3  19.40
6  2  3  1  19.13
7  3  1  3  19.69
8  3  2  1  19.33
9  3  3  2  19.37
K1 19.07  19.22  19.26
K2 19.05  19.26  19.02
K3 19.46  19.10  19.29
R  0.39  0.16  0.27
  表3 验证性试验结果
样品质量/g 吸光度A 总皂苷提取率/% 平均含量/% RSD/%
0.5000  0.307  19.60
0.5003  0.303  19.35
0.5004  0.300  19.17  19.40  0.16
0.5001  0.303  19.35
0.5003  0.306  19.54
绝大部分试验方案,由RSD值(0.16%)可知,该工艺试
验结果可靠。
2.4 无患子天然洗涤剂研制
由图6可知,随着固液比增大,洗涤液的颜色逐渐
变浅。同时由表4和图7可看出,经无患子天然洗涤液
洗涤过的纱布,墨迹相对较浅,其中以固液比小于1∶4
的无患子洗涤液效果较为明显。这是因为无患子皂苷
具有天然的表面活性成分,本身就具备了一定的去污能
力。由于未添加任何辅助化学试剂,用上述无患子天然
洗涤液洗涤污渍,在试验条件下未能达到彻底去污的效
果,其原因尚需进一步探讨。
图6 不同固液比的无患子洗涤液颜色比较
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图7 不同固液比的无患子天然洗涤液去污力比较
  表4 无患子天然洗涤液去污力测试结果
固液比 去污效果 固液比 去污效果
空白 差 1∶7 一般
1∶1 良好 1∶8 一般
1∶2 良好 1∶9 一般
1∶3 良好 1∶10 一般
1∶4 较好 1∶11 一般
1∶5 一般 1∶12 一般
1∶6 一般
  由于制作的无患子天然洗涤液中除水溶剂外,并没
有添加任何化学成分,制成后的无患子洗涤液散发有淡
淡的甜味,这是无患子本身的味道。可根据个人的喜
好,对无患子天然洗涤液的香型做适当的调整。课题组
将采自校园的茉莉花、白兰花、含笑等香料,按常规方法
经过风干、研磨、离心等过程提取天然香精,并适量添加
到无患子洗涤液之中,得到了不同香味和香型的无患子
洗涤液,若将其进一步浓缩,即可得到无患子天然洗
涤剂。
3 讨论与结论
用超声法提取无患子总皂苷,可以选择的因素较
多。在试验中可用水作为提取剂,但由于皂苷在水中易
溶解,水提过程中往往会将一些单糖、寡糖、氨基酸、蛋
白质、黏液质等提取出来,从而导致提取物中的总皂苷
纯度降低。因此,该试验选择一定体积分数的乙醇作为
提取剂。另外,在超声法提取皂苷方面,大量相关研究
结果表明,超声时间、料液比、乙醇体积分数常会对超声
法提取皂苷产生一定的影响,因此,该试验将超声波提
取时间、料液比、乙醇体积分数3个因素作为正交实验
的因素选择。
影响总皂苷提取率的因素除了超声波功率、时间、
料液比、乙醇浓度之外,还有提取次数、温度、pH值、溶
剂等,而且在提取时还会根据需要进行脱脂、脱色等技术
处理,而该试验在提取时并没有对相应的材料进行脱脂、
脱色处理,只是对提取功率、时间、乙醇浓度和料液比进行
了研究,故所得的提取率是否偏低还有待进一步研究。
该试验的无患子总皂苷提取率相对偏低,可能是由
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于试验过程中乙醇挥发、温度控制不够稳定,使无患子
总皂苷没有被完全提取出来造成的。或者是由于该研
究使用的材料采自桂西北喀斯特地区,特殊地理环境,造
成了无患子总皂苷含量的差异。邵文豪等[17]曾对不同产
地无患子果皮皂苷含量的地理变异进行了研究,结果发
现,不同产地间的无患子果皮皂苷含量差异显著,因此,不
排除地理差异造成无患子总皂苷含量差异的可能性。
该研究以水为提取剂,通过去污力对比试验筛选出
无患子新型洗涤剂的最佳配方。在水提过程中,由于大
量的水溶性物质被溶解出来,洗涤液因含有糖苷类物质
而比较粘稠,在细菌的作用下,长期保存可能会有异味,
因此,是否可以通过高温灭菌的方法来防止异味的产
生,有待进一步研究。
该试验结果表明,超声波法提取无患子果皮总皂苷
的最佳工艺条件为:超声时间45min,料液比1∶40,乙
醇体积分数55%。在该条件下,无患子总皂苷的得率为
19.40%。超声波法提取无患子总皂苷具有工艺简单、提
取效率高、溶剂无毒且易回收再利用等优点,适于无患
子总皂苷的工业化生产。无患子天然洗涤剂与合成洗
涤用品相比,其去污效果虽在某些方面可能还不够理
想,但以其纯天然的特性、对肌肤自然保养以及良好的
环保性能,其市场潜力不可忽视。
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Optimization of Extraction Techniques of Sapindus mukurossi Saponine and
Development of New Detergent
QIN Yong-rong,LIU Xin,HUANG Guang-bing,LI Qiu-ming,LIU Xu-hui
(Department of Chemistry and Life Sciences,Hechi University,Yizhou,Guangxi 546300)
Abstract:Taking wild nature Sapindus mukurossi as material,the total saponine was extracted by the ultrasonic
extraction,and the optimal conditions were determined by single factor and orthogonal experiment and using oleanolic acid
as the control,the contents of total Sapindus saponine were measured by spectrophotometer of vanilin-acetic acid-
perchloric acid system at a wavelength of 539nm.On the basis,using water as a solvent to selecte the best formula of the
new detergent through experimentation,and determine its decontamination ability.The results showed that the optimal
extraction technology was as folows:55%ethanol,the ratio of material to solvent 1∶40,ultrasonic extracting time 45
min,ultrasonic extraction power 100W,the average content of total saponine in the extraction was 19.40%under this
condition.The washing liquid of Sapindus mukurossi had the features of green,environmental protection,environment-
friendly and better washing efect under solid liquid ratio of 1∶4.So it would have great potential of development and
utilization.
Key words:Sapindus mukurossi;total saponine;ultrasonic extraction;new detergent
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